黃少江

（第三軍醫(yī)大學新橋醫(yī)院 腫瘤科，重慶 400037）

三陰性乳腺癌患者表皮生長因子受體-3的表達與肝轉(zhuǎn)移的相關性及意義

黃少江

（第三軍醫(yī)大學新橋醫(yī)院 腫瘤科，重慶 400037）

目的 探討三陰性乳腺癌（TNBC）組織中表皮生長因子受體-3（HER-3）的表達情況，以及與肝轉(zhuǎn)移的相關性和臨床意義。方法 收集TNBC患者術后組織標本及臨床資料，不同的表達水平的HER-3采用免疫組化法和蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）法檢測，分析HER-3與臨床病理特征及肝轉(zhuǎn)移的相關性，其預后采用生存分析法（Kaplan-Meier）分析。結(jié)果 TNBC組織中HER-3的檢測陽性率為72.63%（69/95），陽性表達與TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關，且肝轉(zhuǎn)移發(fā)生率高于陰性組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。TNBC組織中HER-3陰性與HER-3陽性組患者中位無病生存期（DFS）分別為18.4和14.5個月，中位總生存期（OS）分別為31.2和26.3個月，差異均有統(tǒng)計學意義。結(jié)論 HER-3在TNBC組織中過度表達，與淋巴結(jié)及肝臟轉(zhuǎn)移相關，是不良預后的重要因素，可作為TNBC預后評估非常有潛力的生物學標志物。

表皮生長因子受體-3；三陰乳腺癌；肝轉(zhuǎn)移

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤，三陰乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）是乳腺癌中預后最差的類型。固體惡性腫瘤的生長和進展的先決條件是腫瘤相關血管的生成，表皮生長因子受體是調(diào)節(jié)許多腫瘤血管生成的主要治療靶點[1]。國內(nèi)外學者一致認為篩選特異性靶標，開拓治療新方案，實現(xiàn)早期診斷，是當前胃癌研究的重點方向。血管生成是腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的基礎，表皮生長因子受體屬于酪氨酸激酶家族，在細胞增殖、凋亡、血管生成和轉(zhuǎn)移中起重要作用。表皮生長因子受體-3（epithelial growth factor receptor-3,HER-3/ErbB-3）近年來成為腫瘤的研究熱點[2]，但HER-3是否與TNBC肝轉(zhuǎn)移相關鮮見相關文獻報道。本研究通過分析HER-3蛋白在TNBC組織中表達情況，分析與臨床病理特征及肝轉(zhuǎn)移性的相關性，并探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2011年7月-2012年12月于在第三軍醫(yī)大學新橋醫(yī)院確診的TNBC 95例女性乳腺癌術后患者。年齡39～69歲，平均56歲；病理分級Ⅰ期10例，Ⅱ期48例，Ⅲ期37例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移54例。乳腺癌經(jīng)2位病理學專家診斷確定，其診斷和分級參照2010年WHO診斷標準。免疫組化標本經(jīng)福爾馬林固定及石蠟包埋；蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測新鮮組織置入-80℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩男g后第1天開始進行隨訪≥3年，主要采用電話、門診等方式。

1.2 主要試劑及方法

①由Abcam公司（英國）購進兔抗人ErbB-3單克隆抗體及免疫組織化學（streptavidin-perosidase，SP）法試劑盒。免疫組織化學技術采用三步法，標本經(jīng)甲醛固定，烘干脫蠟水化，3%過氧化氫H2O2室溫孵育15 min，高壓修復1.5 min，加入一抗（濃度1∶100）4℃過夜。加入二抗及鏈霉親和素-生物素復合物（strept avidin-biotin complex，SABC）法各室溫孵育20 min，二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色、蘇木精染色、封片鏡檢。②Western blot法：裂解組織制作樣品，煮沸4 min后取每個樣品總量25 μl，行電泳轉(zhuǎn)膜，加ErbB-3和β-肌動蛋白（β-action）抗體的封閉過夜。然后洗膜加二抗孵育洗膜顯影。

1.3 結(jié)果判斷

在顯微鏡下隨機選取5個高倍鏡視野，根據(jù)染色程度和陽性染色細胞所占百分取其平均數(shù)為最后得分。（-）與（±/+）定義為陰性，（++）與（+++）定義為陽性。

1.4 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組間比較用t檢驗，多組間比較用單因素方差分析，計數(shù)資料比較用χ2檢驗，生存分析用生存分析法（Kaplan-Meier）法及Log-rank檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 HER-3在TNBC組織中的表達

免疫組織化學結(jié)果顯示，HER-3陽性率為72.63%（69/95），主要表達于細胞質(zhì)，極少部分表達于細胞核；HER-3（-）為11.58%（11/95），HER-3（±/+）為15.79%（15/95），HER-3（++）為33.68%（32/95），HER-3（+++）為38.95%（37/95）。見圖1。

2.2 HER-3與臨床病理參數(shù)的關系

HER-3的陽性表達與乳腺癌患者年齡、核分級、P53及腫瘤大小無相關性（P＞0.05），HER-3的陽性表達與分期、淋巴結(jié)狀況存在相關性（P＜0.05）。見表1。

表1 HER-3與臨床病理參數(shù)的關系

2.3 HER-3蛋白在TNBC中的表達

應用兔抗人HER-3單克隆抗體對TNBC癌旁組織和癌組織測及灰度測定和分析，特異性染色條帶出現(xiàn)在約185kD處，證實HER-3的表達量與病理分期相關（見圖2）。組間兩兩比較差異有統(tǒng)計學意義（P=0.000），在癌旁組織中HER-3蛋白表達量最低，分期越晚表達量越高，各組比較差異有統(tǒng)計學意義（P=0.000）。見表2。

表2 HER-3蛋白在TNBC中的表達

圖2 HER-3蛋白在TNBC中的表達

2.4 HER-3表達與TNBC肝轉(zhuǎn)移的相關性

隨訪期間38例患者出現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移，HER-3表達分為陰性（-和±/+）肝轉(zhuǎn)移發(fā)生率低于陽性（++、+++）組，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.018），見表3。

表3 HER-3表達與肝臟轉(zhuǎn)移的相關性

2.5 HER-3不同表達對TNBC預后的影響

TNBC組織中HER-3陰性與HER-3陽性中位DFS分別為：18.4和14.5個月，差異有統(tǒng)計學意義（P= 0.000）。HER-3陰性與陽性中位OS分別為31.2和26.3個月，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.000）。見圖3。

圖3 HER-3陰性及陽性對乳腺癌DFS（左）和OS（右）的影響

3 討論

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤，盡管隨著手術水平的提高，放化療、內(nèi)分泌治療及靶向治療的應用，乳腺癌的生存期得到明顯的提高。但三陰乳腺癌由于其異質(zhì)性，預后仍非常差[3]。對乳腺癌的發(fā)生、浸潤和轉(zhuǎn)移的機制尚不完全清楚，可能包括自身基因的異常表達、腫瘤血管的異常增生、免疫功能低下及炎癥因子的持續(xù)存在等多種因素。早期乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關因素對預后起著至關重要的作用，不僅是臨床病理學改變，也包括分子生物學標志物的異常改變。探索一種可靠的生物標志物，將有助于乳腺癌早期診斷及改善治療方案，并預測患者的預后。鑒于在乳腺癌細胞增殖發(fā)生至關重要的作用，細胞增殖的生物標志物是潛在的評估TNBC風險的重要工具。

人類表皮生長因子受體家族蛋白過度表達與腫瘤的惡性程度有關，其家族主要成員為HER-1或EGFR、HER-2、HER-3和HER-4，這4個基因可與受體酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTKs）膜結(jié)合形成一個復雜的信號轉(zhuǎn)導網(wǎng)絡。該受體有著相似的結(jié)構(gòu)，包括胞外配體結(jié)合域，一個跨膜結(jié)構(gòu)域，細胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)尾區(qū)。受體功能的特征在于均相/異源響應于配體結(jié)合，激酶結(jié)構(gòu)域活化，C末端酪氨酸殘基自磷酸化，并對接蛋白質(zhì)以引發(fā)下游信號的酪氨酸磷酸化。該受體存在多個特性，包括配體和受體表達的特定細胞型態(tài)，配體和受體的亞細胞分離，并且細胞內(nèi)受體結(jié)合蛋白，多樣性的放大或衰減HER家族信號傳導的控制。HER家族中研究最多的因子是VEGF和HER-2，但近來有學者提出HER-3可能成為癌癥生物學中研究的一個新目標[4]。但不少研究者認為，單靶點的治療可能導致耐藥，能多靶點作用于HER家族的是未來靶向治療的新目標。與其他家庭成員一樣HER-3受體可以啟動信號轉(zhuǎn)導，可能受體過度表達可導致促進細胞增殖，抑制細胞凋亡，增加腫瘤細胞活力和促進血管生成和轉(zhuǎn)移形成[5]。由于其激酶活性缺失，HER-3不能在二聚體激活信號；然而HER-3配體的存在，可以促進EGFR和HER-2激酶的活性，從而誘導C末端磷酸化，磷酸化酪氨酸殘基的結(jié)合，招募Src同源結(jié)構(gòu)域（Src homology domain，SH2）結(jié)構(gòu)域的蛋白以及多聚嘧啶序列結(jié)合蛋白（polypyrimidine tract binding protein，PTB）結(jié)合蛋白，最終導致下游信號通路的激活[6]，因此阻斷HER-3抗體，可以提高抗腫瘤作用。HER-3銜接蛋白SHCA，以及增強TGF-β誘導 HER-2介導的磷脂酰肌醇 -3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）激活，并涉及與Rac1蛋白、Pak1的細胞表面整合和肌動蛋白細胞骨架共定位在細胞膜突起的前緣導致細胞遷移。在許多腫瘤中看來，HER-3作為RTK和PI3K激活之間的主要環(huán)節(jié)，其最近為選擇性抑制PI3K信號途徑RTK驅(qū)動腫瘤得到重視。由于HER-3配體的存在，可以促進EGFR和HER-2激酶的活性，從而誘導的HER-3的C末端磷酸化。通過誘導EGFR和HER-2激酶抑制劑，阻斷HER-3抗體，可以提高抗腫瘤作用。但如何阻斷HER-3的活性以及EGFR和HER-2通路，成為目前的研究難題。

HER-3表達與胃癌進展參數(shù)顯著相關，包括腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)、遠處轉(zhuǎn)移、腫瘤分期和疾病復發(fā)，其陽性表達有著較差的生存，它可能成為一個新靶向治療的目標[7]。KA DAMASCENO等[8]在動物模型的胃癌中發(fā)現(xiàn)HER-3≤90%陽性表達，如何利用這些高表達因子來為人類惡性腫瘤的治療奠定基礎是目前關注的熱點。H STYCZEN等[9]在結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者中發(fā)現(xiàn)HER-2的過表達僅8%，而HER-3 有75%出現(xiàn)過表達，他們認為HER-3的靶向治療可能在未來會超越HER-2和EGFR，但前期仍然需要大量的基礎研究和臨床數(shù)據(jù)[10]。SY BAE等[11]發(fā)現(xiàn)，HER-3過度表達是三陰乳腺癌患者不良預后的重要指標，可能是HER-2和EGFR陰性的患者使用靶向藥另一個方向；然而一些研究者發(fā)現(xiàn)，HER-3的表達與乳腺癌的預后沒有直接相關性[12]，因此HER-3在乳腺癌中的作用以及與肝轉(zhuǎn)移的相關性還有待驗證。

本研究發(fā)現(xiàn)，HER-3在TNBC組織中過度表達，其陽性表達與TNM分期、淋巴結(jié)狀況以及肝轉(zhuǎn)移發(fā)生率相關。無論中位DFS還是OS陽性組均低于陰性組，這與一些學者的研究基本一致[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，HER-3陽性表達的TNBC患者更容易發(fā)生肝轉(zhuǎn)移，是不良預后的危險因素，其具體的作用機制需要進一步的研究證實。綜上所述，HER-3在TNBC組織中過度表達，與淋巴結(jié)及肝臟轉(zhuǎn)移相關，是不良預后的重要因素，可作為TNBC預后評估非常有潛力的生物學標志物。

[1] KHELWATTY S A,ESSAPEN S,SEDDON A M,et al.Acquired resistance to anti-EGFR mAb ICR62 in cancer cells is accompanied by an increased EGFR expression,HER-2/HER-3 signalling and sensitivity to pan HER blockers[J].British Journal of Cancer,2015,113(7):1010-1019.

[2] WANG L,YUAN H,LI Y,et al.The role of HER3 in gastric cancer[J].Biomed Pharmacother,2014,68(6):809-812.

[3] DISIS M L,STANTON S E.Triple-negative breast cancer:immune modulation as the new treatment paradigm[J].American Society Clinical Oncology Educational Book,2015(35):e25-30.

[4] CUI X F,ZHOU W M,YANG Y,et al.Epidermal growth factor upregulates serotonin transporter and its association with visceral hypersensitivity in irritable bowel syndrome[J].World Journal of Gastroenterology,2014,20(37):13521-13529.

[5] GALA K,CHANDARLAPATY S.Molecular pathways:HER3 targeted therapy[J].Clinical Cancer Research,2014,20(6):1410-1416.

[6] SHA H,LI R,BIAN X,et al.A tumor-penetrating recombinant protein anti-EGFR-iRGD enhance efficacy of paclitaxel in 3D multicellular spheroids and gastric cancer in vivo[J].European Journal of Pharmaceutical Sciences,2015(77):60-72.

[7] CILIBERTO D,STAROPOLI N,CAGLIOTI F,et al.A systematic review and meta-analysis of randomized trials on the role of targeted therapy in the management of advanced gastric cancer: Evidence does not translate[J].Cancer Biology Therapy,2015,16(8): 1148-1159.

[8] DAMASCENO K A,FERREIRA E,ESTRELA-LIMA A,et al. Relationship between the expression ofversican and EGFR, HER-2,HER-3 and CD44 in matrix-producing tumours in thecanine mammary gland[J].Histology&Histopathology,2016,31(6): 675-688.

[9] STYCZEN H,NAGELMEIER I,BEISSBARTH T,et al.HER-2 and HER-3 expression in liver metastases of patients with colorectal cancer[J].Oncotarget,2015,6(17):15065-15076.

[10] ZHANG N,CHANG Y,RIOS A,et al.HER3/ErbB3,an emerging cancer therapeutic target[J].Acta Biochimica Et Biophysica Sinica,2016,48(1):39-48.

[11] BAE S Y,LA CHOI Y,KIM S,et al.HER3 status by immunohistochemistry is correlated with poor prognosis in hormone receptor-negative breast cancer patients[J].Breast Cancer Research and Treatment,2013,139(3):741-750.

[12] KARAMOUZIS M V,DALAGIORGOU G,GEORGOPOULOU U, et al.HER-3 targeting alters the dimerization pattern of ErbB protein family members in breastcarcinomas[J].Oncotarget,2016, 7(5):5576-5597.

[13] KANG J C,POOVASSERY J S,BANSAL P,et al.Engineering multivalent antibodies to target heregulin-induced HER3 signaling in breast cancercells[J].MAbs,2014,6(2):340-353.

Significance of HER-3 in predicting liver metastasis in three negative breast cancer patient

Shao-jiang Huang
(Department of oncology,the Third Military Medical University Xinqiao Hospital, Chongqing 400037,China)

Objective To investigate the expression of HER-3 in TNBC tissues,and to explore the relationship and clinical value with liver metastasis.Methods TNBC tissue specimens and clinical data were collected,and the expression of HER-3 was detected by immunohistochemical and Western blot method.Clinicopathological features and correlation with liver metastasis were analyzed,and the prognosis was analyzed by Kaplan Meier survival analysis.Results The positive rate of HER-3 in TNBC was 72.63% (69/95),and had correlation with TNM stage and lymph node status but not related to nuclear grade,p53 or tumor size.The incidence of liver metastasis in HER-3 positive group was significantly higher than the negative group statistically.The median DFS of HER-3 negative and positive group were 18.4 and 14.5 months,and the median OS was 31.2 and 26.3 months with statistically significant.Conclusions The HER-3 expresses in TNBC,and promotes the invasion of cancer cells,and is closely related to liver metastasis,and can be used as a potential biomarker for assessing the prognosis of TNBC.

HER-3;triple-negative breast cancer;liver metastasis

R737.9

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.05.007

1005-8982（2017）05-0033-05

2016-08-08