● 楊旭東 張 杰 楊清東 楊驕霞 王桂云 崔榮軍 劉洪鳳

白毛藤多糖聯(lián)合阿霉素對乳腺癌細(xì)胞凋亡的影響※

● 楊旭東1*張 杰1▲楊清東1楊驕霞2王桂云1崔榮軍1劉洪鳳1

目的:探討白毛藤多糖(Solamum lyratum Thunb polysaccharide，SLTP)聯(lián)合阿霉素(Adrismycim，ADM)對人乳腺癌MCF－7細(xì)胞凋亡的影響及其分子機(jī)制。方法:實驗分為空白對照組、ADM組、ADM+低劑量SLTP組，ADM+中劑量SLTP組，ADM+高劑量SLTP組。通過RT－PCR檢測各組Bcl－2、Fas基因表達(dá)量的變化，同時應(yīng)用熒光顯微鏡觀察人乳腺癌細(xì)胞MCF－7細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果:與空白對照組比較，ADM組及ADM+高中低劑量SLTP組細(xì)胞凋亡率增加，并且上調(diào)Fas和降低Bcl－2表達(dá)。結(jié)論:阿霉素及阿霉素聯(lián)合白毛藤多糖促進(jìn)其MCF－7細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與激活Fas、抑制Bcl－2的基因表達(dá)有關(guān)。

白毛藤多糖 阿霉素 乳腺癌 Fas Bcl－2

乳腺癌即乳腺惡性腫瘤，是女性常見的惡性腫瘤之一，治療方式以手術(shù)治療為主。對于無法手術(shù)治療的患者，如何一方面保證化療藥物的療效，一方面減少化療藥物的毒副作用，一直是臨床上惡性腫瘤化療過程中亟待解決的問題。白毛藤(Solamum lyratum Thunb)是茄科植物白英的全草，傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為其有清熱、利濕、解毒、消腫之功用［1］。本課題組前期實驗表明，白毛藤對多種腫瘤細(xì)胞具有增殖抑制作用［2－3］，本研究進(jìn)一步觀察白毛藤多糖(Solamum lyratum Thunb polysaccharide，SLTP)聯(lián)合阿霉素(Adrismycim，ADM)對人乳腺癌MCF－7細(xì)胞增殖的影響及其分子機(jī)制，為SLTP應(yīng)用于乳腺癌的輔助化療，降低化療藥物的毒副作用提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 乳腺癌細(xì)胞株 人乳腺癌MCF－7細(xì)胞株購于武漢中美科技有限公司，按細(xì)胞庫要求培養(yǎng)細(xì)胞。

1.2 主要試劑 RT－PCR試劑盒及相關(guān)試劑購于大連寶生物有限公司(批號:DRR019A);胰酶(批號: 1606137)、引物購于上海生工生物工程公司;DMEM培養(yǎng)基(批號:12491013)、胎牛血清(批號:1527494)、Trizol(批號15596－026)購于美國Gibco公司，4℃保存;MTT細(xì)胞增殖分析試劑盒購于Sigma公司(批號: PB11058)。

2 方法

2.1 藥物的制備 白毛藤清洗勻漿、醇提、沉淀，留取沉淀再溶解、再沉淀、離心分離。蒸餾水溶解固體部分，加入等體積氯仿/正丁醇混合液(4∶1)，振蕩混勻20min，沉淀，取上清，去除蛋白，重復(fù)操作3次。取上清，再醇析(4倍乙醇)，取沉淀用乙醚、丙酮依次洗滌，冷凍干燥，即得SLTP。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 精確稱取適量SLTP溶解于10%胎牛血清的 DMEM培養(yǎng)液中配置成16mg· mL－1SLTP的母液，4℃儲存，應(yīng)用時按比例稀釋。MCF－7細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。調(diào)零組:不含細(xì)胞的培養(yǎng)液;空白對照組:用含MCF－7細(xì)胞的培養(yǎng)液;ADM組:1mg·L－1ADM;ADM+低劑量SLTP組: 1mg·L－1ADM+0.4mg·mL－1SLTP;ADM+中劑量SLTP組:1mg·L－1ADM+0.8mg·mL－1SLTP; ADM+高劑量SLTP組:1mg·L－1ADM+1.6mg· mL－1SLTP。

2.3 MTT方法檢測細(xì)胞的藥物敏感性 以每孔150μL將密度為1×105個·mL－1的MCF－7細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中。分別加入不同濃度藥物20μL，每組設(shè)5個復(fù)孔，另外設(shè)不加藥物的空白對照組。細(xì)胞培養(yǎng)12、24、48h后，除調(diào)零組外各組分別加入20μL MTT(5g·L－1);培養(yǎng)4h后，棄去MTT液，加DMSO150μL/孔，全自動酶標(biāo)儀490nm波長，測定光密度值(OD值)。計算腫瘤細(xì)胞抑制率(inhibition rate，IR)。IR=(對照組OD－實驗組OD)/(對照組OD－空白組OD)×100%。

2.4 細(xì)胞凋亡檢測 MCF－7細(xì)胞以3×105·mL－1的濃度，接種于6孔培養(yǎng)板中，1mL/孔。CO2培養(yǎng)箱孵育細(xì)胞24h后，加入相應(yīng)藥物，對照組加相同體積新鮮培養(yǎng)液。48h后胰酶消化細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，0.01mol·L－1PBS漂洗 3遍，固定液 4℃固定細(xì)胞10min，棄固定液，0.01mol·L－1PBS漂洗細(xì)胞3次，5min/次，干燥后，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，用5mg ·L－1Hoechst33258染色液染色15 min，取出蓋玻片，用甘油與PBS比例為1:9的混合性封片劑封片，熒光顯微鏡觀察。計算細(xì)胞凋亡率，細(xì)胞凋亡率=［凋亡細(xì)胞/(凋亡細(xì)胞+正常細(xì)胞)］×100%。

2.5 RT－PCR檢測 總RNA的提取，將各組細(xì)胞中加入1mL Trizol，用移液管吹打混勻，移入Ep管，15～30℃放置5min。每管加入0.2ml氯仿，震蕩混勻，室溫放置3min。12000 r·min－1、4℃，離心15min，上清移入新Ep管，加0.5mL異丙醇，混勻，靜置10min。12000r·min－1、4℃、離心 5min，棄上清液，加入1mL4℃75%乙醇(DEPC水配制)，震蕩使RNA沉淀重新懸浮。7500r·min－1、4℃，離心5min，棄上清，靜置10min，加入DEPC水20μL混勻、溶解RNA，分光光度計測定A260/A280為1.8－2.0，RNA產(chǎn)物置于－80℃冰箱保存。PCR擴(kuò)增引物如下:Fas上游引物序列為:5'－CGCCTATGGTTGTTGTTGACC－3';Fas下游引物序列為:5'－CCTCTGTTACGACCTC－3'，擴(kuò)增產(chǎn)物Fas的長度為477bp。Bcl－2上游引物序列為:5'－GACTTCTCGTCGCTACCGTC－3';Bcl－2下游引物序列:5'－ACATGCACCTACCCAGCCTCCGTTATC－3'，擴(kuò)增產(chǎn)物Bcl－2長度為296bp。β－actin上游引物序列為:5'－ATGTGGCACCACACCTTCTA－3'，β－actin下游引物序列為:5'－CGTCATACTCCTGCTTGCTG－3'，擴(kuò)增產(chǎn)物β－actin片段為838bp。PCR反應(yīng)條件:94℃、5min，預(yù)變性，1個循環(huán);94℃、5min，變性，54℃、50s，退火，72℃、90s，延伸，35個循環(huán);72℃、10min，延伸，1個循環(huán)。瓊脂糖凝膠電泳后拍照，軟件分析Bcl－2、Fas mRNA的相對表達(dá)量。

3 結(jié)果

3.1 MTT實驗測定藥物敏感性 實驗結(jié)果顯示，高中低劑量的SLTP分別與ADM合用對乳腺癌細(xì)胞都有明顯的抑制增殖作用，其作用效果比單用ADM效果明顯。見表1。

表1 細(xì)胞生長抑制率(%±s)

表1 細(xì)胞生長抑制率(%±s)

注:與ADM組比較，＊＊P＜0.01，*P＜0.05。

組別12 h 24 h 48 h空白對照組ADM組ADM+低劑量SLTP組ADM+中劑量SLTP組ADM+高劑量SLTP組———5.460.03 9.180.04*15.070.13*19.730.21＊＊7.430.21 10.790.52*23.610.84＊＊27.060.53＊＊13.611.31 18.471.44*26.641.71＊＊31.141.87＊＊

3.2 細(xì)胞凋亡情況 熒光顯微鏡下可見空白對照組細(xì)胞核形態(tài)完整。不同濃度藥物作用于乳腺癌MCF－7細(xì)胞48 h后，熒光標(biāo)記的凋亡細(xì)胞，細(xì)胞核呈藍(lán)色深染、細(xì)胞核碎裂等情況。各組細(xì)胞的凋亡率各不相同，與空白對照組凋亡率(3.76%)比較，ADM組凋亡率(6.37%)明顯升高，說明ADM可以誘導(dǎo)乳腺癌MCF－7細(xì)胞凋亡;ADM+低劑量SLTP組凋亡率為9.03%，ADM+中劑量SLTP組凋亡率為11.41%，ADM+高劑量SLTP組凋亡率為15.43%，與空白對照組比較，ADM+高劑量SLTP組腫瘤細(xì)胞的凋亡率升高最明顯(P＜0.01)。

3.3 ADM聯(lián)合SLTP對Bc1－2和Fas基因表達(dá)影響

腫瘤細(xì)胞中抑制細(xì)胞凋亡的Bcl－2基因的表達(dá)情況(見圖1及表2):與空白對照組比較，藥物作用48h后，ADM組Bcl－2基因表達(dá)減少(P＜0.05)，ADM+低劑量SLTP組、ADM+中劑量SLTP組、ADM+高劑量SLTP組Bcl－2基因表達(dá)降低，效果更顯著(P＜0.01);腫瘤細(xì)胞中促進(jìn)細(xì)胞凋亡的Fas基因的表達(dá)情況(見圖2及表2):與空白對照組比較，藥物作用48h后，ADM組Fas基因表達(dá)增加(P＜0.05)，ADM+低劑量SLTP組、ADM+中劑量SLTP組、ADM+高劑量SLTP組Fas基因表達(dá)增加，效果更顯著(P＜0.01)。

表2 ADM聯(lián)合SLTP對Bc1－2和Fas基因表達(dá)影響(±s)

表2 ADM聯(lián)合SLTP對Bc1－2和Fas基因表達(dá)影響(±s)

注:與空白對照組比較，＊＊P＜0.01，*P＜0.05。

組別 Bcl－2/β－Actin Fas/β－Actin空白對照組ADM組ADM+低劑量SLTP組ADM+中劑量SLTP組ADM+高劑量SLTP組0.63±0.04 0.46±0.03*0.32±0.03＊＊0.28±0.02＊＊0.21±0.01＊＊0.13±0.01 0.29±0.02*0.37±0.02＊＊0.42±0.03＊＊0.56±0.04＊＊

圖1 ADM聯(lián)合SLTP對Bc1－2基因表達(dá)影響

圖2 ADM聯(lián)合SLTP對Fas基因表達(dá)影響M.DNA Marker;A.空白對照組;B.ADM組;C.ADM+低劑量SLTP組; D.ADM+中劑量SLTP組;E.ADM+高劑量SLTP組

4 討論

乳腺癌是發(fā)生在乳腺腺上皮組織的惡性腫瘤，目前已成為威脅女性健康的常見腫瘤之一［4、5］。大多患者通過乳腺癌根治術(shù)治療，但由于乳腺癌細(xì)胞之間連接松散，易脫落，可隨血液或淋巴液播散全身，形成轉(zhuǎn)移，危及生命。對于無法采用手術(shù)治療的患者或術(shù)后恢復(fù)的患者往往輔助化療治療腫瘤。化療藥物在殺滅腫瘤細(xì)胞同時損傷正常組織細(xì)胞，因此提高化療藥物的敏感性至關(guān)重要，在保證治療效果的同時又降低了化療藥物毒副作用。細(xì)胞的無限制生長可導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，其原因是細(xì)胞的過度增殖和細(xì)胞凋亡的減少，因此調(diào)控抗凋亡基因及凋亡基因的表達(dá)成為了腫瘤治療中的一個潛在的靶點(diǎn)。Bcl－2基因最早在研究B細(xì)胞淋巴瘤中發(fā)現(xiàn)的，其位于18q21，具有明顯的抑制細(xì)胞凋亡的作用，是Bcl－2家族中最具代表的抗凋亡蛋白。其通過調(diào)控線粒體途徑、影響細(xì)胞膜跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)、激活谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶、改變鈣離子分布等機(jī)制調(diào)控凋亡，因此，Bcl－2蛋白的表達(dá)情況可以在一定程度上反映細(xì)胞凋亡的程度［6－8］。實驗研究表明Bcl－2等凋亡相關(guān)基因的異常表達(dá)是導(dǎo)致腫瘤化療耐受的重要原因之一［9－10］。因此藥物是否能有效抑制Bcl－2等凋亡相關(guān)基因的異常表達(dá)，將能提高腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性，降低化療的抵抗。Fas蛋白是一種細(xì)胞膜表面受體蛋白，在細(xì)胞凋亡中起重要的作用，分子量為45kd，位于人染色體的10q24.1，與活化的T淋巴細(xì)胞表面的配體Fas－L蛋白結(jié)合，向細(xì)胞膜內(nèi)傳遞死亡信號，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［11］。

本研究結(jié)果顯示:高中低劑量的SLTP分別與ADM合用可明顯抑制乳腺癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，提高ADM的藥物療效;并且SLTP能明顯上調(diào)Fas基因表達(dá)，下調(diào)Bcl－2基因表達(dá)，其作用效果比單用ADM效果明顯。表明SLTP可能通過調(diào)節(jié)Bcl－2及Fas基因表達(dá)的平衡，增加腫瘤細(xì)胞對ADM的敏感性，促進(jìn)ADM誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞的凋亡。為SLTP應(yīng)用于乳腺癌的輔助化療提供實驗依據(jù)，然而其協(xié)同作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

［1］馮洪錢.民間獸醫(yī)本草［M］.北京:科學(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社，1993:307－308.

［2］楊旭東，張 杰，楊驕霞.白毛藤對人乳腺癌MCF－7細(xì)胞凋亡的影響［J］.中國現(xiàn)代中藥，2010，12(4):34－36.

［3］楊旭東，張 杰，董 凱.白毛藤總苷誘導(dǎo)人食管癌細(xì)胞Ec－9706凋亡及其作用機(jī)制的研究［J］.牡丹江醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2011，32(1):7－9.

［4］黃哲宙，陳萬青，吳春曉，等.中國女性乳腺癌的發(fā)病和死亡現(xiàn)狀——全國32個腫瘤登記點(diǎn)2003－2007年資料分析報告［J］.腫瘤，2012，32:435－439.

［5］胡一迪，胡孝渠，李 權(quán)，等.Survivin，caspase－8在人體乳腺癌增生乳腺癌癌前病變和乳腺癌中的表達(dá)程度分析［J］.中國生化藥物雜志，2015，13:100－102.

［6］Kelly PN，Strasser A.The role of Bcl－2 and its pro－survival relatives in tumourigenesis and cancer therapy［J］.Cell Death Differ，2011，18(9): 1414－1424.

［7］Shamas－Din A，Kale J，Leber B，et al.Mechanisms of action of Bcl－2 family proteins［J］.Cold Spring Harb Perspect Biol，2013，5(4):714.

［8］Martinou JC，Youle RJ.Mitochondria in apoptosis:Bcl－2 family members and mitochondrial dynamcis［J］.Dev Cell，2011，21(1):92－101.

［9］秦緒軍，何 偉，海春旭.Bcl－2蛋白在腫瘤放化療氧化損傷中的作用［J］.癌變畸變突變，2014，26(5):361－364.

［10］王雪峰，何援利，譚 峰.Bcl－2基因?qū)Νh(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的大鼠卵巢損傷的保護(hù)作用［J］.中國婦幼保健，2013，28(1):143－147.

［11］Martin－villalba A，Llorens－bobadilla E，Wollny D.CD95 in cancer: tool or target［J］.Trends in Molecular Medicine，2013，19(6):329－335.

黑龍江省中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥科研項目(No.ZHY10－W71);牡丹江醫(yī)學(xué)院科學(xué)技術(shù)研究項目(No.ZS201314)

楊旭東，男，副教授。主要從事中藥的藥理與毒理研究。

▲通訊作者張杰，女，碩士。主要從事中藥的藥理與毒理研究。E－mail:zhangjie03mdj@126.com

1.黑龍江省牡丹江醫(yī)學(xué)院(157011);2.黑龍江省牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院(157011)