郭亞男，楊海波，趙蔭濤，劉 源，李 凌，周巖強

鄭州大學第一附屬醫(yī)院心血管內科 鄭州 450052

可溶性環(huán)氧化物水解酶抑制劑在TGF-β1誘導的人臍靜脈內皮細胞內皮-間質轉化中的作用*

郭亞男，楊海波#，趙蔭濤，劉 源，李 凌，周巖強

鄭州大學第一附屬醫(yī)院心血管內科 鄭州 450052

#通信作者，男，1975年1月生，博士，教授，研究方向：心血管病介入治療，E-mail：yanghaibo1975@126.com

可溶性環(huán)氧化物水解酶抑制劑；內皮-間質轉化；臍靜脈內皮細胞；心肌纖維化

目的：觀察可溶性環(huán)氧化物水解酶抑制劑t-AUCB對TGF-β1誘導的人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)內皮-間質轉化(EndMT)的影響。 方法：采用t-AUCB(50 μmol/L)預處理HUVEC 40 min后，用TGF-β1(10 μg/L)誘導HUVEC 24 h，采用Western blot法檢測Smad2/3的磷酸化水平；誘導72 h后，光鏡觀察細胞形態(tài)的變化，采用CCK-8試劑盒檢測細胞活性，采用實時熒光定量PCR檢測內皮細胞標記物(CD31)、間質細胞標記物(collagen Ⅰ、 collagen Ⅲ、vimentin)及EndMT中重要的下游轉錄因子(snail1、twist1、twist2、ZEB1)mRNA的表達。同時設TGF-β1和t-AUCB單獨作用組。結果：光鏡下，TGF-β1組細胞轉變?yōu)楠M長形，細胞間隙疏松，TGF-β1+t-AUCB組、t-AUCB組細胞形態(tài)正常。TGF-β1組細胞CD31 mRNA表達下調，collagen Ⅰ、 collagen Ⅲ、vimentin mRNA表達上調，snail1、twist1、twist2、ZEB1 mRNA表達上調,Smad2及Smad3蛋白磷酸化水平升高(P<0.05)。與TGF-β1組比較，TGF-β1+t-AUCB組、t-AUCB組上述指標的表達均有一定程度的逆轉(P<0.05)。結論：t-AUCB可通過抑制內皮細胞的EndMT而發(fā)揮抗纖維化作用。

creased(P<0.05). Compared with those of TGF-β1 group, the indexes mentioned above in TGF-β1+t-AUCB group and t-AUCB group showed reversed effect to a certain extent(P<0.05).Conclusion: t-AUCB has an anti-fibrosis effect on the HUVEC by inhibiting the progress of EndMT.

心肌纖維化是由各種病理情況下心肌成纖維細胞的過度增殖和細胞外基質的過度沉積造成的，表現(xiàn)為心肌微毛細血管密度的降低和心臟結構的改變[1]，是臨床上多種疾病包括心肌缺血、心肌病、高血壓、糖尿病等常見的并發(fā)癥和共同的病理表現(xiàn)。目前臨床上尚無特異性的抗心肌纖維化治療藥物[2],因此尋找特異性的抗心肌纖維化藥物,減少心肌重構成為當前研究的熱點。研究[3]表明，心肌成纖維細胞除了來源于固有的成纖維細胞及祖細胞外，還可由骨髓來源的循環(huán)纖維細胞、單核細胞、周細胞及上皮細胞通過內皮-間質轉化(endothelial-mesenchymal transition，EndMT)等轉化而來,EndMT在心肌纖維化中的作用受到越來越多的重視[4]。多種信號通路可以調節(jié)EndMT的發(fā)生，其中TGF-β1/Smads信號通路是研究最為深入的一種[5]?？扇苄原h(huán)氧化物水解酶抑制劑(soluble epoxide hydrolase inhibitor，sEHI)與多種心血管疾病密切相關，它具有抗高血壓[6]、減少心肌缺血再灌注損傷[7]、調節(jié)血脂[8]及抗心肌纖維化等作用。作者用TGF-β1誘導人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)發(fā)生EndMT，并觀察sEHI干預對這一過程的影響，探討sEHI與EndMT的關系。

1 材料與方法

1.1 細胞及主要儀器、試劑

1.1.1 細胞 細胞株HUVEC-12購自YRGene(NC006)，用含體積分數(shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液在37 ℃、體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞貼壁約80%后用2.5 g/L胰蛋白酶消化并傳代。實驗前將細胞置于含有體積分數(shù)0.2%胎牛血清、0.1 g/L肝素及DMEM的無血清培養(yǎng)基中進行6 h的饑餓處理。

1.1.2 主要儀器、試劑 t-AUCB(sEHI)購自Cayman公司(分子式：C24H32N2O4，純度≥99%，貨號16568)，取4.12 mg t-AUCB溶解于1 mL二甲基亞砜(DMSO)中配制實驗所用母液(10 mmol/L)，實驗過程中DMSO在液體中的濃度低于0.02%。TGF-β1購自美國PEPROTECH公司，ECGS購自美國ScienCell公司，細胞毒性檢測試劑盒CCK-8購自日本同仁化學；信號轉導分子及其磷酸化分子抗體Smad2、Smad3、 p-Smad2、p-Smad3購自美國Cell Signaling Technology公司。多功能微孔板檢測系統(tǒng)SynergyHT購自美國BioTek公司，紫外分光光度計NANODROP 2000c購自美國Thermo Scientific公司，反轉錄儀Veriti 96 well Thermal Lycler購自美國Applied Biosystems公司，實時熒光定量PCR儀Light Lycler 480購自瑞士Roche公司。

1.2 實驗分組 實驗分為3組，以僅用饑餓液持續(xù)培養(yǎng)的HUVEC作空白對照。TGF-β1誘導組：用含有TGF-β1(10 μg/L)的饑餓液持續(xù)培養(yǎng)HUVEC；t-AUCB組：HUVEC采用t-AUCB(50 μmol/L)預處理40 min后，繼續(xù)采用含有TGF-β1(10 μg/L)與t-AUCB(50 μmol/L)的饑餓液持續(xù)培養(yǎng)；t-AUCB組：單用含有t-AUCB(50 μmol/L)的饑餓液持續(xù)培養(yǎng)HUVEC。培養(yǎng)24 h后，測定各組細胞中Smad2/3蛋白磷酸化水平；培養(yǎng)72 h后，進行細胞形態(tài)觀察，并檢測細胞活性及EndMT相關因子mRNA的表達水平。

1.3 細胞活性檢測 采用CCK-8試劑盒進行細胞活性檢測。細胞分組處理后，棄去培養(yǎng)基，在96孔板中加入含10 μL CCK-8的無胎牛血清培養(yǎng)基100 μL，于培養(yǎng)箱中孵育2.0～2.5 h，然后用酶標儀測定波長450 nm處的OD值。每組5孔。細胞活性=實驗組OD/空白對照OD×100%。

1.4 Smad2/3磷酸化水平的檢測 冰上裂解細胞10 min，置于1.5 mL離心管中，超聲裂解儀5 kHz裂解10～15 s，4 ℃12 000 r/min離心15 min，將上清液移至離心管中，BCA定量檢測蛋白濃度并將蛋白濃度調整一致后置于煮沸儀上將其變性。每組樣本混勻后取10 μL行100 g/L SDS-PAGE凝膠電泳，檢測內參GAPDH，根據(jù)OD值調整上樣量，使其與GAPDH的OD值保持一致，之后每組以校正后的上樣量進行凝膠電泳，將蛋白以恒壓100 V 90 min后轉移至PVDF膜上，用含50 g/L脫脂奶粉的TBST進行封閉，然后加一抗(p-Smad2、p-Smad3、Smad2、Smad3，抗體稀釋度均為11 000)于4 ℃環(huán)境下孵育過夜，加入二抗室溫孵育1 h，再用TBST洗3次，放入熒光檢測儀中，應用Odyssey圖像分析軟件檢測目的蛋白的OD值。以磷酸化蛋白與總蛋白表達水平的比值表示目的蛋白的磷酸化水平，以實驗組與空白對照磷酸化水平的比值表示該組目的蛋白的磷酸化水平。

1.5 EndMT相關因子mRNA表達水平的檢測 使用Trizol試劑按步驟提取細胞總RNA，取總RNA大約5 μL，以GAPDH為內參，應用Light Lycler 480實時定量PCR儀進行擴增，按照說明書操作，測定snail1、E盒結合鋅指蛋白1(zinc finger E-box binding homeobox 1，ZEB1)、扭曲蛋白(twist)、Ⅰ型膠原蛋白(collagen Ⅰ)、Ⅲ型膠原蛋白(collagen Ⅲ)、波形蛋白(vimentin)、CD31 mRNA的表達。引物由上海生工生物工程技術有限公司合成，引物序列見表1。以目的mRNA與內參表達量的比值表示目的mRNA的相對表達水平，以實驗組與空白對照相對表達水平的比值表示該組目的mRNA的表達水平。

表1 引物序列

1.6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 19.0進行數(shù)據(jù)分析，3組間各指標的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q法(方差齊)或Dunnett′s T3(方差不齊)檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 3組細胞活性的比較 TGF-β1組、TGF-β1+t-AUCB組、t-AUCB組細胞活性分別為(98.2±9.6)%、(99.1±13.2)%、(98.4±6.8)%，3組間比較，差異無統(tǒng)計學意義(F=0.989，P=0.011)。

2.2 3組細胞形態(tài) 光鏡下，空白對照細胞間連接緊密，呈鵝卵石樣。TGF-β1組細胞變狹長形，連接較松散。TGF-β1+t-AUCB組細胞形態(tài)為鵝卵石樣，連接較緊密。t-AUCB組細胞形態(tài)與空白對照相似(圖1)。

2.3 3組細胞Smad2/3蛋白的磷酸化水平 見圖2、表2。

A:空白對照;B:TGF-β1組;C:TGF-β1+t-AUCB組;D:t-AUCB組。圖1 不同處理因素處理后HUVEC細胞的形態(tài)(×400)

1：空白對照；2：TGF-β1;C:TGF-β1+t-AUCB組;D:t-AUCB組。圖2 3組細胞Smad2/3蛋白磷酸化水平的檢測

表2 3組細胞Smad2/3蛋白的磷酸化水平

*:與TGF-β1組比較，P<0.05。

2.4 3組細胞EndMT相關因子的表達 見表3、4。

表3 3組EndMT過程中內皮和間質細胞標記物mRNA的表達

*:與TGF-β1組比較，P<0.05。

表4 4組EndMT過程中重要下游轉錄因子mRNA的表達

*:與TGF-β1組比較，P<0.05；#:與t-AUCB組比較，P<0.05。

3 討論

心肌纖維化是由各種病理情況下心肌成纖維細胞的過度增殖和細胞外基質的過度沉積造成的，易引起心室壁順應性及舒張功能的下降，最終可使心肌收縮功能受損而引起心力衰竭[9]。研究[3]表明，心肌成纖維細胞除了來源于固有的成纖維細胞及祖細胞外，還可由骨髓來源的循環(huán)纖維細胞、單核細胞、周細胞及上皮細胞等通過EndMT轉化而來。相關研究[10]表明，經(jīng)上皮細胞轉化而來的成纖維細胞占成纖維細胞總數(shù)的30%左右。在EndMT過程中，內皮細胞逐漸失去極性和緊密連接的特性而變成狹長的梭形，且細胞間的連接變得疏松[11]。多種信號通路可以調節(jié)EndMT的發(fā)生，其中TGF-β1/Smads信號通路是研究最為深入的一種[5]。TGF-β1首先與胞外的受體結合從而引起Smad2/3磷酸化，然后磷酸化Smad2/3再與Smad4結合成復合物進入細胞核，與核內特異的DNA片段結合，調節(jié)ZEB1、snail、twist等下游轉錄因子的表達[12]，從而促進EndMT的發(fā)生。sEHI與多種心血管疾病密切相關，它具有抗高血壓[6]、減少心肌缺血再灌注損傷[7]、調節(jié)血脂[8]及抗心肌纖維化等作用。Xu等[13]發(fā)現(xiàn)sEHI可以通過阻斷核因子κB而發(fā)揮抗心肌纖維化的作用。Sirish等[10]的研究證明sEHI可顯著抑制心肌梗死后C57BL/6j小鼠的心肌纖維化并改善小鼠的心功能。然而sEHI在EndMT中的作用尚無人報道。因此，作者觀察了t-AUCB(一種sEHI)干預對TGF-β1誘導的EndMT過程中HUVEC細胞活性及相關因子表達的影響，探討sEHI在EndMT中的作用。

因Smad2及Smad3的磷酸化發(fā)生在較早期，在下游基因出現(xiàn)改變之前即有變化，而且預實驗結果也支持TGF-β1刺激HUVEC 12 h后Smads信號通路的磷酸化水平較高，故該實驗中選擇在干預細胞24 h后檢測Smad2/3磷酸化水平，選擇在干預細胞72 h后檢測下游基因的表達及細胞形態(tài)。預實驗中作者選擇了多個t-AUCB藥物濃度，結果提示100 μmol/L t-AUCB干預可使細胞活性顯著降低，而藥物濃度≤50 μmol/L則無此影響，因此作者選擇50 μmol/L的t-AUCB進行了后續(xù)實驗。該研究結果表明，TGF-β1可引起HUVEC Smad2及Smad3蛋白的磷酸化水平顯著升高，促進HUVEC細胞向間質細胞表型的轉化，表現(xiàn)為內皮細胞標記物CD31 mRNA表達下調，間質細胞標記物collagen Ⅰ、collagen Ⅲ、vimentin mRNA表達上調，而EndMT下游轉錄因子snail1、twist1、twist2、ZEB1 mRNA的表達均顯著升高。TGF-β1與t-AUCB聯(lián)合干預后，HUVEC細胞間質轉化過程部分被逆轉。

綜上所述，作者認為，t-AUCB可抑制TGF-β1誘導的HUVEC的EndMT，為t-AUCB在抗心肌纖維化治療中的臨床應用提供了更多的實驗依據(jù)，但EndMT涉及多條信號通路及下游轉錄因子，該研究尚未就t-AUCB對其他信號通路的影響進行研究，同時也未能在動物模型中進行相關實驗，因此還需進一步完善實驗方案，以明確其作用機制。

[1]VASAN RS,BENJAMIN EJ.Diastolic heart failure：no time to relax[J].N Engl J Med,2001,344(1):56

[2]KRENNING G,ZEISBERG EM,KALLURI R.The origin of fibroblasts and mechanism of cardiac fibrosis[J].J Cell Physiol,2010,225(3):631

[3]BUJAK M,REN G,KWEON HJ,et al.Essential role of Smad3 in infarct healing and in the pathogenesis of cardiac remodeling[J].Circulation,2007,116(19):2127

[4]WIDYANTORO B,EMOTO N,NAKAYAMA K,et al.Endothelial cell-derived endothelin-1 promotes cardiac fibrosis in diabetic hearts through stimulation of endothelial-to-mesenchymal transition[J].Circulation,2010,121(22):2407

[5]FENG XH,DERYNCK R.Specificity and versatility in tgf-beta signaling through Smads[J].Annu Rev Cell Dev Biol,2005,21(21):659

[6]DAVIS BB,THOMPSON DA,HOWARD LL,et al.Inhibitors of soluble epoxide hydrolase attenuate vascular smooth muscle cell proliferation[J].Proc Natl Acad Sci USA,2002,99(4):2222

[7]QIN J,SUN D,JIANG H,et al.Inhibition of soluble epoxide hydrolase increases coronary perfusion in mice[J].Physiol Rep,2015,3(6):12427

[8]SHEN L,PENG H,ZHAO S,et al.A potent soluble epoxide hydrolase inhibitor, t-AUCB, modulates cholesterol balance and oxidized low density lipoprotein metabolism in adipocytes in vitro[J].Biol Chem,2014,395(4):443

[9]PORTER KE,TURNER NA.Cardiac fibroblasts: at the heart of myocardial remodeling[J].Pharmacol Ther,2009,123(2):255

[10]SIRISH P,LI N,LIU JY,et al.Unique mechanistic insights into the beneficial effects of soluble epoxide hydrolase inhibitors in the prevention of cardiac fibrosis[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2013,110(14):5618

[11]MARKWALD RR,FITZHARRIS TP,MANASEK FJ.Structural development of endocardial cushions[J].Am J Anat,1977,148(1):85

[12]VALCOURT U,KOWANETZ M,NIIMI H,et al.TGF-beta and the Smad signaling pathway support transcriptomic reprogramming during epithelial-mesenchymal cell transition[J].Mol Biol Cell,2005,16(4):1987

[13]XU D,LI N,HE Y,et al.Prevention and reversal of cardiac hypertrophy by soluble epoxide hydrolase inhibitors[J].Proc Natl Acad Sci USA,2006,103(49):18733

(2016-06-23收稿 責任編輯王 曼)

Effect of soluble epoxide hydrolase inhibitor on endothelial-to-mesenchymal transition of human umbilical vein endothelial cells induced by TGF-β1

GUOYanan，YANGHaibo，ZHAOYintao，LIUYuan，LILing，ZHOUYanqiang

DepartmentofCardiology,theFirstAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052

soluble epoxide hydrolase inhibitor;endothelial-to-mesenchymal transition;HUVEC;myocardial fibrosis

Aim: To observe the effect of soluble epoxide hydrolase inhibitor t-AUCB on TGF-β1 induced endothelial-to-mesenchymal transition(EndMT) of human umbilical vein endothelial cell(HUVEC). Methods: The HUVEC were pretreated by t-AUCB(50 μmol/L) for 40 min,then were induced by TGF-β1(10 μg/L) for 24 h,and Western blot was used to detect the phosphorylation levels of Smad2/3; after 72 h, light microscope was used to observe cell morphology, CCK-8 kit was used to test cell viability, and Real-time PCR was used to determine the mRNA expressions of epithelial marker(CD31) and mesenchymal markers(collagen Ⅰ,collagen Ⅲ,vimentin), as well as the key downstream transcription factors(snail1,twist1,twist2,ZEB1). TGF-β1 group and t-AUCB group were set.Results: The cells in TGF-β1 group changed into a long and narrow shape with intercellular porosis, while the cells in TGF-β1+t-AUCB group and t-AUCB group had normal forms. In TGF-β1 group,CD31 mRNA expression was down-regulated, but those of collagen Ⅰ, collagen Ⅲ, vimentin,snail1,twist1,twist2,and ZEB1 were up-regulated,and Smad2 and Smad3 protein phosphorylation levels in---------------------

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.02.014

R542.2+3

*鄭州大學第一附屬醫(yī)院院內青年創(chuàng)新基金項目