劉明明，張根元，王浦海

(1.南京工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，江蘇南京211800； 2.江蘇省藥物研究所有限公司，江蘇南京211800)

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離子對(duì)色譜法測定鹽酸達(dá)克羅寧中的雜質(zhì)

劉明明1，張根元2，王浦海2

(1.南京工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，江蘇南京211800； 2.江蘇省藥物研究所有限公司，江蘇南京211800)

采用Kromasil C18色譜柱，以磷酸鹽緩沖液(稱取辛烷磺酸鈉2.34 g及KH2PO46.8 g，加H2O 1 L使溶解，用H3PO4調(diào)節(jié)pH至3.0)：甲醇(體積比40∶ 60)為流動(dòng)相，流速1.0 mL/min，檢測波長282 nm，柱溫25 ℃。雜質(zhì)A、B與鹽酸達(dá)克羅寧在0.05～0.5 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。雜質(zhì)A、B的平均回收率分別為99.66%和105.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為2.12%和4.17%。本方法為鹽酸達(dá)克羅寧雜質(zhì)的檢查提供了科學(xué)依據(jù)。

鹽酸達(dá)克羅寧；離子對(duì)色譜法；雜質(zhì)

鹽酸達(dá)克羅寧(Dyclonine hydrochloride，1)，化學(xué)名為1-(4-丁氧基苯)-3-(1-哌啶基)-1-丙酮鹽酸鹽，是一種起效快且安全性高的局部麻醉藥[1-2]。中國藥典尚未收載本品，美國藥典第35版規(guī)定以L13柱測定其含量，國內(nèi)也有采用C18柱進(jìn)行測定的報(bào)道，但這些方法均是用有機(jī)相-磷酸二氫鉀[4-7]或有機(jī)相-三乙胺[8-9]體系作為流動(dòng)相，且鮮見其相關(guān)雜質(zhì)檢測的報(bào)道。根據(jù)本品的結(jié)構(gòu)特征及合成工藝路線[10]，推測最終產(chǎn)品中可能存在的工藝雜質(zhì)包括：4-羥基苯乙酮(起始原料，雜質(zhì)A)和4-丁氧基苯乙酮(中間體，雜質(zhì)B)；降解雜質(zhì)包括：1-(4-丁氧基苯基)-2-丙烯-1-丙酮(雜質(zhì)C)和1-(4-羥基苯基)-2-丙烯-1-丙酮(雜質(zhì)D)，見圖1。

1—鹽酸達(dá)克羅寧；A—4-羥基苯乙酮；B—4-丁氧基苯乙酮；C—1-(4-丁氧基苯基)-2-丙烯-1-丙酮；D—1-(4-羥基苯基)-2-丙烯-1-丙酮圖1 鹽酸達(dá)克羅寧(1)及相關(guān)雜質(zhì)Fig.1 Structures of dyclonine hydrochlorido (1) and its related substances

在有機(jī)相的體系下色譜檢測鹽酸達(dá)克羅寧的主峰峰形拖尾嚴(yán)重，且相關(guān)雜質(zhì)分離不佳。為了彌補(bǔ)現(xiàn)有方法的不足，本文建立了一種新的離子對(duì)色譜法，在流動(dòng)相中引入離子對(duì)試劑辛烷磺酸鈉，使主峰峰形及主成分與雜質(zhì)的分離度均得到極大改善。該方法專屬性強(qiáng)、靈敏度高，可適用于鹽酸達(dá)克羅寧相關(guān)雜質(zhì)的檢查。考慮到本品中實(shí)際存在A、B兩個(gè)已知雜質(zhì)，雜質(zhì)C、D僅在強(qiáng)制降解條件下出現(xiàn)，故本研究在新的離子對(duì)色譜條件下僅對(duì)雜質(zhì)A、B進(jìn)行方法學(xué)研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鹽酸達(dá)克羅寧(1)對(duì)照品(中國生物制品藥品檢定研究院，批號(hào)20150402， 含量99.94%)，鹽酸達(dá)克羅寧(1)樣品(江蘇省藥物研究所有限公司，批號(hào)20150803，20150901，20150903)；有關(guān)物質(zhì)A(江蘇省藥物研究所有限公司，批號(hào)：BH-AB02993-150302，含量：99.71% )；有關(guān)物質(zhì)B(江蘇省藥物研究所有限公司，批號(hào)：20150701，含量：99.56%)；辛烷磺酸鈉(分析純)，德國默克公司；KH2PO4(分析純)，南京化學(xué)試劑有限公司；甲醇(色譜純)，霍尼韋爾貿(mào)易(上海)有限公司；H3PO4(分析純)，南京化學(xué)試劑有限公司；水為自制超純水。

LC-2010A型高效液相色譜儀，日本Shimadzu公司；Micromass ZQ型液質(zhì)聯(lián)用儀，美國Waters公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 檢測波長的選擇

取1及有關(guān)物質(zhì)A、B適量，分別用流動(dòng)相溶解并稀釋制成每1 mL中約含5 μg的溶液，照紫外-可見分光光度法(中國藥典2015年版通則0401)測定，在200～400 nm波長范圍內(nèi)掃描，結(jié)果1及有雜質(zhì)A、B 均在282 nm左右的波長處有最大吸收，故選擇282 nm作為本品雜質(zhì)的檢測波長。

1.2.2 色譜條件

色譜柱為Kromasil C18硅烷鍵合硅膠柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：磷酸鹽緩沖液(稱取辛烷磺酸鈉2.34 g及KH2PO46.8 g，加水1 L使溶解，用H3PO4調(diào)節(jié)pH至3.0，搖勻)-甲醇(體積比為40∶ 60)；檢測波長282 nm；流速1.0 mL/min；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量20 μL。

1.2.3 系統(tǒng)適用性溶液的配制

精密稱取1 10 mg，置50 mL量瓶中，加適量流動(dòng)相溶解，置水浴中加熱4 h，取出后放冷，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻即得。

1.2.4 雜質(zhì)混合溶液的配制

精密稱取A、B各10 mg，置于100 mL量瓶中，流動(dòng)相定容，精密量取5 mL，置50 mL量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻即得。

1.2.5 雜質(zhì)對(duì)照溶液的配制

精密量取有關(guān)物質(zhì)混合溶液1 mL，置于100 mL量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻即得。

1.2.6 供試品溶液的配制

精密稱取1 20 mg，置于100 mL量瓶中，加流動(dòng)相適量溶解，并加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻即得。

1.2.7 對(duì)照溶液的配制

精密量取供試品溶液1 mL，置于100 mL量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，精密量取1 mL，置于10 mL量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻即得。

2 結(jié)果與討論

2.1 分離度

取系統(tǒng)適用性溶液20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，如圖2所示。由圖2可知：1與相關(guān)雜質(zhì)的分離度均大于2.0，理論板數(shù)以1計(jì)算，大于4 000。

1—1；2—雜質(zhì)A；3—雜質(zhì)B；4—雜質(zhì)C；5—雜質(zhì)D圖2 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液色譜圖Fig.2 Chromatogram of the system suitability test solution

2.2 專屬性試驗(yàn)

取樣品1 10 mg，共6份，各置50 mL量瓶中，振搖使其溶解，分別進(jìn)行強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、氧化、光照和高溫破壞試驗(yàn)，另一份不作破壞，作對(duì)照試驗(yàn)，其中強(qiáng)酸、強(qiáng)堿樣品進(jìn)樣前須中和，結(jié)果見圖3。由圖3可知：在上述色譜條件下，降解產(chǎn)物與1分離良好，且經(jīng)苛刻條件下破壞后的主峰峰純度符合要求(純度因子大于峰純度閾值)。

圖3 專屬性試驗(yàn)色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of forced specificity test

由圖3可知：本品1在高溫條件下不穩(wěn)定，降解出了2個(gè)主要雜質(zhì)C和D，該2個(gè)主要雜質(zhì)在已有文獻(xiàn)報(bào)道的檢測方法中與主成分難以分離，而在本文色譜條件下與主成分分離良好，說明本色譜條件對(duì)本品與相關(guān)雜質(zhì)的分離效果有極大改善。

2.3 線性試驗(yàn)及校正因子測定

精密稱取1及雜質(zhì)A、B對(duì)照品適量，用流動(dòng)相溶解并定量稀釋制成濃度為0.05～0.5 μg/mL的1及A、B的混合對(duì)照品溶液，作為線性測定系列濃度溶液，分別進(jìn)樣20 μL，記錄色譜圖。并以濃度ρ為橫坐標(biāo)，峰面積A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。同時(shí)根據(jù)1及雜質(zhì)A、B線性方程的斜率，計(jì)算A、B的校正因子，結(jié)果見表1。

表1 線性試驗(yàn)結(jié)果

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

取樣品1，平行配制供試品溶液及對(duì)照溶液6份，取20 μL分別進(jìn)樣，記錄色譜圖。按加校正因子自身對(duì)照法計(jì)算有關(guān)物質(zhì)，結(jié)果6份樣品有關(guān)物質(zhì)A含量的RSD為0.69%、有關(guān)物質(zhì)B含量的RSD為1.48%、單個(gè)雜質(zhì)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.22%、總雜質(zhì)的RSD為1.08%。

2.5 回收率試驗(yàn)

分別精密稱取1 10 mg共9份，各置50 mL量瓶中，分別精密加入有關(guān)物質(zhì)混合溶液0.5、1.0和1.5 mL，即得50%、100%和150%雜質(zhì)限度的混合液，各3份，分別進(jìn)樣測定，計(jì)算回收率。結(jié)果有關(guān)物質(zhì)A、B的平均回收率為99.66%和105.1%，RSD分別為2.12%和4.17%(n=9)。

2.6 精密度與穩(wěn)定性試驗(yàn)

取 1及有關(guān)物質(zhì)對(duì)照溶液，分別連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計(jì)算得1及有關(guān)物質(zhì)A、B峰面積的RSD分別為0.85%、1.35%和1.40%。

取1供試品溶液，分別配制后于0、2、4、6、8、12和24 h進(jìn)樣，記錄色譜圖及峰面積，結(jié)果有關(guān)物質(zhì)A、B及1峰面積的RSD分別為0.97%、1.46%和0.80%，未見其他雜質(zhì)出現(xiàn)，說明供試品溶液放置24 h穩(wěn)定。

2.7 樣品測定

取3批樣品1供試品、對(duì)照溶液，分別進(jìn)樣，記錄色譜圖。按加校正因子的自身對(duì)照法計(jì)算相關(guān)雜質(zhì)，結(jié)果見表2。

表2 相關(guān)雜質(zhì)測定結(jié)果

由表2可知：鹽酸達(dá)克羅寧樣品的相關(guān)雜質(zhì)都被有效檢測出來。因?yàn)楸酒?為一含堿性氮原子的極性化合物，在反相色譜條件下與固定相相互作用較強(qiáng)，導(dǎo)致其拖尾嚴(yán)重，峰型差柱效低，且與相鄰雜質(zhì)分離不佳。反離子對(duì)試劑辛烷磺酸鈉的引入，與本品結(jié)構(gòu)中的堿性氮原子相結(jié)合形成中性分子的離子對(duì)化合物，使得其疏水性增強(qiáng)，與固定相的作用減弱，很好地改善了峰型，極大地提高了柱效，與相關(guān)雜質(zhì)的分離度明顯增加，從而解決了已有文獻(xiàn)報(bào)道的方法中鹽酸達(dá)克羅寧峰拖尾嚴(yán)重、分離度差的問題。

3 結(jié)論

本文在參考國內(nèi)外已報(bào)道的鹽酸達(dá)克羅寧檢測方法文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)色譜條件進(jìn)行了改善，建立了測定本品雜質(zhì)更為合理、科學(xué)的離子對(duì)色譜檢測法。通過調(diào)整離子對(duì)試劑種類、用量、溶液pH及有機(jī)相比例，經(jīng)優(yōu)化篩選，最終確立了本方法，為鹽酸達(dá)克羅寧雜質(zhì)的檢查提供了科學(xué)依據(jù)。

[1] 張麗君，朱晶，祝修權(quán).鹽酸達(dá)克羅寧的合成.廣東化工，2010，37(8)：106-108.

[2] 張小瑞，王金波，慕高萌.1%鹽酸達(dá)克羅寧凝膠的制備及質(zhì)量控制.實(shí)用藥物與臨床，2015,18(1)：66-69.

[3] The United States Pharmacopoeia Commission Inc.The United States Pharmacopoeia.(USP35).Rockville:the United States Pharmacopoeia Convention,Inc.,2012:2997.

[4] 于桂蘭，楊建春，張琦，等.HPLC法同時(shí)測定敏寧搽劑中二組分含量.藥物分析雜志，2011,31(5):977-979.

[5] 毛宗惠.HPLC法測定復(fù)方鹽酸達(dá)克羅寧乳膏中鹽酸達(dá)克羅寧含量.世界最新醫(yī)學(xué)信息文摘，2015,15(18)：36-37.

[6] 張勇，黃愛文，宋洪濤.高效液相色譜法測定多效胃鏡乳中主要成分含量.中國藥業(yè)，2014，23(20)：57-59.

[7] 譚璐，張廣求，劉文.HPLC法同時(shí)測定復(fù)方乳酸左氧氟沙星燒傷凝膠中兩組分的含量.中國藥房，2013,24(40):3833-3835.

[8] 傅峰，施孝金，郁韞超.復(fù)方地塞米松涂膜中醋酸地塞米松和鹽酸達(dá)克羅寧的HPLC法測定.中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2012,43(11):935-937.

[9] 李成，顏晗，羅意文，等.HPLC測定復(fù)方鹽酸達(dá)克羅寧薄荷腦潤膚止癢水中達(dá)克羅寧的含量.海南醫(yī)學(xué)，2010,21(14):125-126.

[10] 孫田江，陸宏國，周斌，等.一種鹽酸達(dá)克羅寧合成方法：101544616 B.2011-05-25.

(責(zé)任編輯 周曉薇)

Determination of impurities in Dyclonine hydrochloride by ion pair chromatography

LIU Mingming1,ZHANG Genyuan2,WANG Puhai2

(1.College of Pharmaceutical Engineering，Nanjing Tech University，Nanjing 211800,China;2.Jiangsu Provincial Institute of Material Medica Co.Ltd., Nanjing 211800,China)

A C18column was used,with the mobile phase of phosphate buffer (dissolved octane sulfonic acid sodium salt 2.34 g and KH2PO46.8 g in 1 L water, pH adjusted to 3.0 by H3PO4)：methanol (V/V=40∶ 60) with flow rate 1.0 mL/min at 25 ℃ with the detection wavelength of 282 nm.It was linear for the related substances A,B and Dyclonine hydrochloride in the concentration ranges of 0.05-0.5 μg/mL.The average recoveries of A and B were 99.66% and 105.12%,with RSDs of 2.12% and 4.17%,respectively. This mothod provides a scientific basis for the determination of the Dyclonine hydrochloride substances.

Dyclonine hydrochloride；ion pair chromatography；related substances

10.3969/j.issn.1672-3678.2017.02.008

2016-05-12

劉明明(1991—)，女，江蘇南京人，研究方向：藥物制劑及分析；張根元(聯(lián)系人)，副研究員，E-mail：zhanggenyuan63@126.com

R927.1

A

1672-3678(2017)02-0045-04