趙文英，朱慶書，徐艷麗，孫彥妮

(青島科技大學化工學院，山東青島266042)

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白頭翁皂苷提取方法比較及加壓提取傳質(zhì)動力學

趙文英，朱慶書，徐艷麗，孫彥妮

(青島科技大學化工學院，山東青島266042)

采用加熱回流、超聲輔助、微波輔助以及加壓熱水等方法提取白頭翁總皂苷，比較不同提取方法對白頭翁皂苷提取率、抑菌活性、抗氧化活性的影響；同時采用電鏡掃描觀察提取方法對藥材結(jié)構(gòu)的影響；在此基礎(chǔ)上，研究加壓提取的傳質(zhì)動力學。結(jié)果表明:采用加壓熱水方法提取白頭翁皂苷具有提取率高(提取率6.74%，質(zhì)量分數(shù))、提取物抗氧化、抑菌活性強的特點；電鏡掃描表明采用加壓熱水進行提取時，不破壞藥材的細胞結(jié)構(gòu)；加壓熱水提取的傳質(zhì)過程符合二階動力學模型，其動力學方程為ρt=t[(2.6exp(-331.04/T))-1+t(0.007 8T2-6.416 9T+1 329.3)-1]-1，提取過程活化能Ea為74.376 2 kJ/mol。

白頭翁;皂苷;加壓熱水提取;動力學

中藥白頭翁(RadixPulsatillae)為毛莨科多年生草本植物白頭翁的干燥根。中醫(yī)認為其味苦性寒，有清熱解毒、涼血止痢、燥濕殺蟲的功效，為臨床常用中藥材?，F(xiàn)代藥理學實驗也證明其有抗氧化、抗炎、殺蟲和抑菌的作用，主要用于治療各種痢疾、癤癰以及癌癥等病癥。雖然白頭翁在臨床上具有廣泛的應(yīng)用，但對其主要成分的提取研究并沒有引起重視，目前只有少量有關(guān)白頭翁中皂苷、多糖等成分的研究報道，所采取的提取方法主要是傳統(tǒng)的水煎或加熱回流法[2-4]等。由于中藥有效成分藥理作用的發(fā)揮與其所采取的提取方法有很大關(guān)系，甚至能決定其在臨床上的應(yīng)用價值，因而有必要對白頭翁中有效成分的提取工藝進行深入研究。

目前，中藥材有效成分的提取最常用的方法是回流提取，隨著科技的不斷發(fā)展，一些新型提取技術(shù)，如超聲輔助提取、微波輔助提取以及加壓提取[5-6]等方法也不斷應(yīng)用于中藥成分的提取中并取得了良好的效果。為了確定適用于白頭翁中皂苷成分的提取方法，筆者系統(tǒng)考察加熱回流、超聲輔助、微波輔助和加壓等提取方法對白頭翁中皂苷類成分提取的影響，并對加壓提取的傳質(zhì)過程進行研究，以用于指導工業(yè)化生產(chǎn)，以期能夠進一步提高白頭翁臨床應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 儀器、材料及試劑

KQ-100型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；G80D23ESL-DN型微波爐，Galanz集團；加壓溶劑提取器，自制；LabTech紫外分光光度儀，北京萊伯泰儀器有限公司；JSM-6700F型場發(fā)射掃描電子顯微鏡，日本電子公司；Q6J3-W1000A型高速萬能粉碎機，天津泰斯特儀器有限公司。

白頭翁，安徽海鑫中藥材有限公司；白頭翁皂苷B4對照品(純度≥98%)，中國藥品生物制品檢定所；大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、四聯(lián)球菌，青島科技大學藥劑實驗室提供；DPPH·試劑，Sigma公司；其余試劑均為市售分析純。

1.2 白頭翁總皂苷含量測定的波長選擇及標準曲線繪制

采用分光光度法，以白頭翁皂苷B4為標準品測定白頭翁皂苷含量。按照文獻中的方法配制對照品溶液，揮干溶劑后，依次加入現(xiàn)配的5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL、高氯酸0.8 mL，搖勻后70 ℃水浴加熱15 min，流水冷卻后，再加入冰醋酸5.0 mL，振搖后靜置10 min，在400～800 nm范圍內(nèi)掃描；取一定量的白頭翁提取液，按上述方法配制并掃描。結(jié)果顯示，白頭翁皂苷B4在473 nm附近有最大峰，而白頭翁提取液于475 nm附近有最大吸收。因此，本文選擇測定波長為473 nm。

精密稱取白頭翁皂苷B4適量，經(jīng)稀釋后配制成不同濃度的對照品溶液，在473 nm處測定吸光度值A(chǔ)473。所得標準曲線回歸方程為y=8.855 5A473+0.054 6(R=0.999 5)，線性范圍0.004～0.036 mg/mL。

采用分光光度法測定不同提取方法提取的白頭翁皂苷的吸光度值，根據(jù)標準曲線回歸方程，計算皂苷含量，同時皂苷的提取率計算見式(1)。

皂苷提取率 =(提取物中白頭翁皂苷質(zhì)量/提取藥材質(zhì)量)×100%

(1)

1.3 白頭翁皂苷提取

分別采用加熱回流、超聲輔助、微波輔助和加壓熱水4種方法提取白頭翁皂苷。取干燥、粉碎成粗粉的白頭翁樣品適量，按照料液比1∶ 10 (mg/mL)加入蒸餾水，其中加熱回流提取2次，第一次提取120 min，第二次提取60 min；超聲輔助提取30 min，超聲頻率為200 W；微波輔助提取采用中火，間歇提取10 min；加壓提取溫度120 ℃、壓力0.3 MPa，提取30 min。提取完成后，將藥液過濾，揮干溶劑后得浸膏，備用。浸膏得率計算見式(2)。

浸膏得率=(浸膏質(zhì)量/提取藥材質(zhì)量)×100%

(2)

1.4 白頭翁皂苷抗氧化活性測定

按文獻方法做適當修改，測定白頭翁皂苷抗氧化活性。分別取預(yù)先配制好的DPPH·溶液與提取物樣品或空白對照樣品混勻，室溫下避光放置30 min，在400～600 nm范圍內(nèi)掃描，確定最大吸收波長為517 nm。然后在此波長處測定樣品吸光值(A517)，每組樣品平行測定3次，取平均值。按式(3)計算DPPH·的清除率(SA)。

(3)

式中：A0為加空白對照溶液時DPPH·溶液的吸光度；Ai為加入提取物樣品時DPPH·溶液的吸光度；Aj為未加DPPH·溶液時樣品溶液的吸光度。

1.5 白頭翁皂苷抑菌試驗

按照文獻采用打孔法測定白頭翁皂苷抑菌活性。在已凝固的瓊脂培養(yǎng)基上用直徑4 mm打孔器等距離打孔(每孔間距為30 mm)，每孔用移液槍定量加入0.5 mL藥液(100 mg/mL)，于37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，取出后測定抑菌圈直徑大小，比較抑菌效果。

1.6 加壓提取傳質(zhì)機理

中藥材的提取是一個復(fù)雜的非穩(wěn)態(tài)、非平衡的傳質(zhì)過程，在前期分析加壓提取過程特征及在查閱相關(guān)文獻的基礎(chǔ)上，本文確定采用二階方程模型描述加壓提取白頭翁皂苷的傳質(zhì)過程。

根據(jù)二階模型，白頭翁皂苷提取的傳質(zhì)速率方程為

(4)

式中：k為提取速率常數(shù)(min-1)；ρs為白頭翁皂苷溶液飽和質(zhì)量濃度(mg/mL)；ρt為t時刻溶液中白頭翁皂苷質(zhì)量濃度(mg/mL)。

(5)

此即為二階傳質(zhì)動力學方程，將式(5)兩邊同時取倒數(shù)，可得提取速率ρt/t的數(shù)學表達式

(6)

(7)

2 結(jié)果與討論

2.1 白頭翁皂苷含量及活性比較

采用4種不同方法提取白頭翁皂苷，其提取率以及抑菌活性(抑菌圈)和抗氧化活性結(jié)果見表1。

表1 不同提取方法對白頭翁皂苷提取的影響

從表1可以看出：白頭翁皂苷提取物浸膏得率最多的是加熱回流提取，超聲與微波輔助提取的浸膏量相差不大，加壓提取的浸膏量最少；從皂苷提取率來看，加熱回流皂苷提取率最少，但與超聲、微波這兩種方法比較，相差不大，而加壓提取的皂苷提取率為8.05%，明顯高于其他3種提取方法。通常，采用加熱回流方法提取植物類藥材中的有效成分時，由于熱效應(yīng)影響，除所需提取的成分外，還會同時將植物中的其他成分提取出來，特別是以水為提取溶劑時，高溫時水的溶解能力較強，會將植物中的糖、鞣質(zhì)、蛋白質(zhì)等成分也同時提取出來，因此加熱回流提取的浸膏量會最多；超聲和微波提取這兩種方法是借助于高能量使植物細胞壁破裂，有效成分易于溶出，但在提高有效成分提取率的同時，也會使植物細胞碎片混雜在提取物浸膏中，從而使浸膏量增加；加壓提取方法是通過高溫高壓改變?nèi)軇┑娜軇┬阅?，對中藥材中有效成分選擇性提取，而不破壞細胞結(jié)構(gòu)，因而具有浸膏量少、純度高、有效成分提取率高的特點。

從抑菌實驗結(jié)果可以看出：加壓提取的白頭翁皂苷的抑菌活性略低于加熱回流提取，但比超聲輔助提取與微波輔助提取的抑菌活性高。加熱回流提取的皂苷提取率最低，但其活性最高，可能是浸膏中含有的雜質(zhì)，如糖、鞣質(zhì)等成分也具有抑菌活性的原因，而加壓提取的皂苷提取率較高，因而具有較強的抑菌活性。

抗氧化活性實驗結(jié)果也說明，加壓提取的白頭翁皂苷由于提取率高，對DPPH·的清除活性也較強。

2.2 白頭翁藥材掃描電鏡

將加熱回流、超聲輔助、微波輔助以及加壓提取后的白頭翁藥材，和未提取的白頭翁藥材樣品通過掃描電鏡觀察其微觀結(jié)構(gòu)變化，結(jié)果見圖1。

圖1 白頭翁藥材電鏡掃描圖Fig.1 Scanning electron microscope images of Radix Pulsatillae

由圖1可知：未經(jīng)過提取的藥材，表面自然、完整；經(jīng)過加熱回流提取后，藥材整體組織結(jié)構(gòu)疏松，有明顯的破碎，但藥材表面結(jié)構(gòu)仍比較完整；經(jīng)超聲和微波輔助提取后的藥材已觀察不到完整的表面組織結(jié)構(gòu)，藥材細胞很明顯已經(jīng)被破壞，甚至可以看到一些細胞的內(nèi)部組織結(jié)構(gòu)；經(jīng)加壓熱水提取后的藥材，表面平整，沒有明顯的組織碎片，但有很明顯經(jīng)過壓縮后的褶皺。由此可以推測，加壓熱水提取有效促進中藥成分的傳質(zhì)效應(yīng)，與加熱回流提取的傳質(zhì)機理相似，與超聲、微波輔助提取的傳質(zhì)過程有所不同。

2.3 加壓提取的傳質(zhì)動力學

稱取適量經(jīng)干燥粉碎后的白頭翁藥材粗粉，按1∶ 10 (mg/mL)加入蒸餾水，加熱至90～140 ℃，在0.3 MPa壓力下提取90 min，每隔一段時間取樣10 mL，揮干溶劑，用分光光度法測皂苷含量，結(jié)果見圖2。

利用圖2中數(shù)據(jù)，根據(jù)式(5)作t/ρt～t圖，見圖3。

圖2 不同溫度下，加壓提取白頭翁皂苷含量隨時間變化曲線Fig.2 Effects of temperature on saponins concentration from Radix Pulsatillae by pressurized extraction

圖3 不同溫度下，加壓提取白頭翁皂苷成分的動力學關(guān)系Fig.3 Relationships of second-order extraction kinetics of saponins from Radix Pulsatillae by pressurized extraction at different temperatures

由表2可知：利用加壓熱水技術(shù)提取白頭翁中的皂苷成分，除90 ℃外，溫度在100～140 ℃時，提取時間15～90 min內(nèi)，相關(guān)系數(shù)R值偏低，但均大于0.95，與二階動力學模型相關(guān)性較強。因此，可用該動力學模型來描述加壓熱水提取白頭翁中皂苷成分的傳質(zhì)過程。實驗中選取15～90 min進行方程擬合，是由于實驗設(shè)備的局限，需要先把藥材樣品放到提取罐中，加入提取溶劑后密閉，再逐漸升高溫度。在升溫過程中，藥材與溶劑接觸，已經(jīng)開始對其中的有效成分進行浸提，但計時是從升到設(shè)定溫度后開始，因此計時初期成分的提取率明顯偏高。為減少提取設(shè)備所造成的誤差干擾，我們選取15 min為方程擬合起始點。

根據(jù)公式(7)，擬合加壓提取白頭翁皂苷的提取動力學方程。在一定溫度下，t時刻提取物濃度ρt與h0和ρs相關(guān)，而h0與ρs又與提取溫度T有關(guān)。用lnh0對1/T作圖，采用最小二乘法做線性歸回，則初始提取速率與溫度的關(guān)系為h0=2.6exp(-331.04/T)，R=0.978 2；用ρs對T作圖，同樣采用最小二乘法進行線性回歸，飽和質(zhì)量濃度與溫度的關(guān)系為ρs=0.007 8T2-6.416 9T+1 329.3，R=0.992 9。

表2 不同溫度下二階動力學模型線性化數(shù)據(jù)

將h0和ρs帶入式(7)，可得白頭翁皂苷成分的提取動力學方程

ρt=

(8)

式(8)給出了提取時間t和提取溫度T與提取物質(zhì)量濃度ρt之間的關(guān)系，利用Origin 9.1軟件作圖4。由圖4可知：在一定范圍內(nèi)可用于預(yù)測任意時間、溫度下提取物的濃度，便于調(diào)整提取工藝參數(shù)。由加壓提取白頭翁皂苷成分濃度預(yù)測圖可以看出，在提取初期，提取物濃度隨提取溫度變化比較平緩，但隨著提取時間的延長，在較低溫度時，皂苷濃度有明顯的提升，提高溫度反而不利于白頭翁皂苷類成分的提取，這可能與提取溫度高會破壞皂苷類成分有關(guān)。

圖4 任何溫度與時間下，加壓提取白頭翁中皂苷成分濃度預(yù)測圖Fig.4 Predictive model for saponins extraction from Radix Pulsatillae by pressurized extraction at different extraction time and temperature

2.4 提取過程的活化能

圖5 溫度(1/T)與二階速率常數(shù)(ln k)間關(guān)系圖Fig.5 Relationship between temperature and the second-order leaching rate constant

3 結(jié)論

系統(tǒng)比較了加熱回流、超聲輔助、微波輔助以及加壓熱水提取方法對白頭翁皂苷的提取率、抗氧化活性以及抑菌活性等指標的影響，結(jié)果表明加壓熱水提取方法具有提取率高，提取物活性強的特點，而且用水代替有機溶劑做提取試劑，具有綠色環(huán)保的優(yōu)勢，是促進中藥產(chǎn)業(yè)綠色發(fā)展的最具前途的技術(shù)之一。

對提取后藥材的電鏡掃描結(jié)果表明，加壓熱水提取技術(shù)與目前較常見的超聲輔助和微波輔助的傳質(zhì)機理有所不同，通過對相關(guān)提取動力學模型擬合比

較，得到的二階動力學模型ρt=t[(2.6exp(-331.04/T))-1+t(0.007 8T2-6.416 9T+1 329.3)-1]-1可以較好地說明加壓提取過程傳質(zhì)機理，由此推導出的動力學方程可用于指導加壓熱水提取白頭翁皂苷的工業(yè)化生產(chǎn)。

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(責任編輯 荀志金)

Comparison of techniques for extraction of triterpenoid glycosides fromRadixPulsatillaeand kinetics of pressurized hot water extraction

ZHAO Wenying,ZHU Qingshu,XU Yanli,SUN Yanni

(College of Chemical Engineering,Qingdao University of Science and Technology,Qingdao 266042,China)

Triterpenoid glycosides fromRadixPulsatillaewere extracted by hot water extraction,ultrasonic assisted extraction,microwave assisted extraction,and pressurized hot water extraction (PHWE).The extraction yield of triterpenoid glycosides as well as antibacterial and antioxidant activity of the extracts from four methods were compared.Scanning electron microscope images of the plant cells after four treatments were obtained to provide visual evidence of the extraction effect.The results show that the extraction yield of triterpenoid glycosides by PHWE was the highest,and the extracts obtained with PHWE also showed the higher antibacterial and antioxidant activity.The extraction model of a second-order mechanism was developed to predict the concentration of triterpenoid glycosides under various extraction temperatures.The extraction kinetic equation was described asρt=t[(2.6exp(-331.04/T))-1+t(0.007 8T2-6.416 9T+1 329.3)-1]-1,theEawas 7.437 62 kJ/mol.

RadixPulsatillae; triterpenoid glycosides; pressurized hot extraction; kinetics

10.3969/j.issn.1672-3678.2017.02.006

2016-11-25

山東省中青年科學家科研獎勵基金(BS2009SW033)

趙文英(1969—)，女，山東蓬萊人，博士，副教授，研究方向：天然產(chǎn)物成分提取，E-mail:wyzhao0059@aliyun.com

TQ35

A

1672-3678(2017)02-0035-06