曾漢榮，楊虹女，李文星，涂興，孔維佳

(1.枝江市人民醫(yī)院耳鼻咽喉科，湖北 枝江 443200；2.華中科技大學同濟生命科學學院，湖北 武漢 430022)

喉組織中相關(guān)特異性蛋白異常的表達及臨床意義

曾漢榮1，楊虹女1，李文星2，涂興2，孔維佳2

(1.枝江市人民醫(yī)院耳鼻咽喉科，湖北 枝江 443200；2.華中科技大學同濟生命科學學院，湖北 武漢 430022)

目的探討喉組織中相關(guān)特異性蛋白異常的表達及其臨床意義。方法所有病理標本來源于2012年5月至2015年2月間我院耳鼻咽喉頭頸外科因喉部不同病因需要接受手術(shù)治療住院患者，其中，喉癌組織標本(喉癌組)、喉聲帶息肉組織標本(息肉組)和喉癌前病變組織標本(癌前組)各69例。喉癌標本按照2010年國際抗癌聯(lián)盟(UICC)標準進行臨床分期和病理分級。采用過氧化物酶標記鏈酶卵蛋白素染色法檢測各組標本中人乳頭狀瘤病毒16E7蛋白(HPV16E7)和細胞周期調(diào)節(jié)蛋白D1(Cyclin D1)表達水平。采用相關(guān)統(tǒng)計學分析和比較各組間HPV16E7和Cyclin D1陽性表達率和相關(guān)性差異。結(jié)果喉癌組HPV16E7和Cyclin D1陽性表達出現(xiàn)于細胞核，為大量黃褐色粗大顆粒，陽性表達率分別為44.93%和52.17%，明顯強于息肉組(分別為2.90%和8.70%)和癌前組(分別為5.80%和23.19%)，差異均有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，癌前組HPV16E7和Cyclin D1陽性表達率較息肉組也明顯提高，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；在喉癌臨床分期中，HPV16E7和Cyclin D1陽性表達率在Ⅰ～Ⅳ期中隨著分期增加呈上升趨勢(P＜0.01)；在喉癌病理分級中，HPV16E7和Cyclin D1陽性表達率隨分化程度減弱，均表現(xiàn)為Ⅲ級＞Ⅱ級＞Ⅰ級(P＜0.01)；HPV16E7和Cyclin D1陽性表達率與喉癌發(fā)生率均具有顯著正相關(guān)(r=0.79、0.86，P= 0.003，0.002)，兩者相互間陽性表達率也呈顯著正相關(guān)(r=0.68，P=0.005)。結(jié)論喉癌的發(fā)生和發(fā)展與HPV16E7和Cyclin D1過度表達密切相關(guān)，因此，對HPV16E7和Cyclin D1檢測有利于提高患者的臨床早期診斷和生存預后。

喉癌；人乳頭狀瘤病毒16E7蛋白；細胞周期調(diào)節(jié)蛋白D1；陽性表達

喉癌(laryngeal squamous cell carcinoma，LSCC)是耳鼻咽喉頭頸外科最常見的惡性腫瘤，占全部喉癌的96%～98%。人乳頭瘤病毒(human papiloma-virus， HPV)感染是其發(fā)病的主要病因，并和細胞周期調(diào)控蛋白(cyclin)一道在LSCC發(fā)生中起著決定性作用[1]。作為一種致癌原癌基因病毒，HPV的高危型早期編碼區(qū)E7基因及其編碼核磷酸蛋白(HPV16E7蛋白)被認為與口咽喉腫瘤密切相關(guān)原癌基因。它通過干擾和加快喉組織中細胞周期調(diào)節(jié)蛋白D1(Cyclin D1)過表達[2]，造成細胞周期循環(huán)途徑中G1/S關(guān)卡(G1/S checkpoint)失控，喉組織細胞生長變得無序增加，出現(xiàn)嚴重未成熟和/或異常細胞，從而導致LSCC發(fā)生發(fā)展[3]。研究HPV16E7、Cyclin D1與癌生物學行為關(guān)系及其相關(guān)程度，有利于了解LSCC發(fā)生發(fā)展及其治療方式。本實驗將采用鏈霉卵白素-辣根過氧化物酶(streptavidin-perosidase，SP)技術(shù)，檢測臨床上LSCC、聲帶息肉(vocal cord polyp，VCP)和喉癌前病變(laryngeal precarcinoma lesions，LPL)組織中HPV16 E7和Cyclin D1表達，旨在為臨床了解LSCC發(fā)病機制和早期診斷及其基因治療靶點提供實驗數(shù)據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 病理標本均來源于2012年5月至2015年2月間在我院耳鼻咽喉頭頸外科因喉部不同病因，經(jīng)術(shù)前電子喉鏡、病變組織活檢等確定需要接受手術(shù)治療住院患者，最終經(jīng)過病理科作HE染色，醫(yī)師診斷得出相應結(jié)果并出具診斷報告。每一例病理組織離體后，迅速用生理鹽水沖洗血跡，無菌手術(shù)刀在中心部位切取組織，置于10%中性福爾馬林中固定，常規(guī)石蠟包埋，供HE和免疫組織化學染色。其中，喉癌組織標本(LSCC組)69例，來自行根治性手術(shù)部位，男性57例，女性12例，年齡42～79歲，平均(60.5± 12.3)歲；LSCC納入標準：(1)既往無喉部手術(shù)史；(2)手術(shù)前沒有接受任何放療、化療或免疫治療；(3)不伴不典型增生；(4)無并發(fā)其他癌癥及急、慢性病史；根據(jù)2010年國際抗癌聯(lián)盟(UICC)標準進行臨床分期：Ⅰ期17例，Ⅱ期24例，Ⅲ期17例，Ⅳ期11例；按腫瘤分化程度分級：Ⅰ級(高度分化)24例，Ⅱ級(中度分化)33例，Ⅲ級(低度分化)12例。聲帶息肉標本(VCP組)69例，為本院同時期行聲帶息肉摘除住院患者；喉癌前病變標本(LPL組)69例，為喉角化病、喉黏膜白斑病、疣狀增生等異常病灶需要住院進行手術(shù)根治患者[4]。VCP組和LPL組中病理材料來源時間、納入標準、性別和年齡資料與LSCC組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均＞0.05)、具有可比性。對于上述所有標本均在實驗前再次行HE染色，由3名經(jīng)驗豐富病理科醫(yī)師對切片組織細胞形態(tài)學再次行病理學定性確診。

1.2 主要儀器和試劑 脫水機、包埋機和切片機(Leica公司，德國)；生物學顯微鏡(BX-63，Olympus公司，日本)；圖像獲取數(shù)字分析系統(tǒng)(NIH Image 1.6，Kontronm公司，德國)；酶標儀(Synergy HF，Bio-tek公司，美國)；Western blot轉(zhuǎn)移電泳儀(XCell SureLock，Invitrogen公司，美國)；雙通道熒光掃描儀(ODY-2182，Li-Cor公司，美國)，紫外凝膠成像系統(tǒng)(VL，Vilber公司，法國)。兔抗人HPV16E7、Cyclin D1和GAPDH單克隆抗體均購自美國Epitomics公司；SP免疫組化測試盒、DAB-H2O2試劑盒、磷酸鹽緩沖液(PBS)、3%H2O2等購自基因生物工程有限公司；溴酚藍、TBST緩沖液、脫脂奶粉均購自Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 SP法檢測蛋白表達 將各組標本經(jīng)10%中性福爾馬林固定、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟包埋等步驟制成蠟塊，后作連續(xù)切片，厚度為4 μm。每一個標本留取10張切片用作檢測兩種蛋白，每種蛋白5張。將各組待檢測切片放入烤箱中烘烤、二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化，蒸餾水和PBS反復沖洗修復，3% H2O2液孵育后，滴加非免疫羊血清封閉去除血清。根據(jù)SP免疫組化測試盒上說明，分別在各組織切片上滴加稀釋比例為1：100的Ⅰ抗兔抗人HPV16E7或Cyclin D1單克隆抗體(50 μL/張)、Ⅱ抗鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶溶液，Ⅲ抗辣根過氧化物酶標記鏈霉卵白素液。最后滴加DAB-H2O2顯色劑染色，蘇木素復染，鹽酸乙醇分化，并經(jīng)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，40×40倍顯微鏡下檢測、圖像獲取數(shù)字分析系統(tǒng)保存圖片于計算機供分析使用。

1.3.2 結(jié)果判讀 由3位病理科醫(yī)師組成診斷小組以雙盲法形式分別對所有切片進行獨立閱片，得出相應結(jié)果，當3位專家獨立觀察結(jié)果不一致時，經(jīng)討論最終判讀切片病理性質(zhì)特征。根據(jù)檢測HPV16E7和Cyclin D1表達說明書提供資料，染色陽性對照用已知宮頸鱗狀細胞癌病例切片1張，陰性對照是取各組切片1張，PBS取代Ⅰ抗，分別依照上述免疫組化相關(guān)步驟同時進行操作、染色和鏡檢，得出結(jié)果作為參考。HPV16E7或Cyclin D1陽性表達特征均為細胞核出現(xiàn)棕黃色或棕褐色細小和/或粗大顆粒。結(jié)合染色強度和陽性細胞數(shù)對結(jié)果進行判定[5]：光學顯微鏡下(40×40倍)對每張切片隨機選擇5個視野，每個視野計數(shù)200個細胞，按陽性細胞所占整個觀察細胞百分比平均數(shù)劃分，當陽性細胞數(shù)占整個觀察細胞數(shù)百分比＜5%，視為陰性(-)，5%～25%為弱陽性(+)，25%～50%為中度陽性(++)，＞50%為強陽性(+++)。+、++、+++統(tǒng)稱陽性表達，－為陰性表達。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用Origin 6.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，兩兩比較采用t檢驗；計數(shù)資料以率或百分比表示，兩兩比較采用χ2分割法；相關(guān)性分析用Pearson相關(guān)系數(shù)(r)法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組HPV16E7和Cyclin D1陽性表達病理特征比較 HPV16E7和Cyclin D1在VCP組沒有陽性表達或表達極少，整個細胞染成淺藍色或藍色；在LPL組有少量陽性表達，其病理特征為細胞核出現(xiàn)與背景染色不一樣細而少黃色顆粒；在LSCC組，陽性表達非常強烈，更多細胞核出現(xiàn)黃色或黃褐色細網(wǎng)狀或粗大顆粒，陽性細胞染色較深，呈灶狀或彌漫分布，見圖1。

圖1 各組中HPV16E7和Cyclin D1陽性表達病理特征比較（SP×400）

2.2 各組HPV16E7和Cyclin D1陽性表達率比較 與VCP組比較，LPL組HPV16E7陽性表達率稍有增加，但差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.48，P＞0.05)，Cyclin D1陽性表達率增加明顯(χ2=4.97，P＜0.05)；LSCC組HPV16E7和Cyclin D1陽性表達率顯著上升(χ2= 33.49、30.80，P均＜0.05)。與LPL組比較，LSCC組HPV16E7和Cyclin D1陽性表達率均顯著增加(χ2= 27.91、16.74，P均＜0.05)，見表1。

表1 HPV16E7和Cyclin D1在各組中陽性表達率比較[例（%）]

2.3 LSCC組HPV16E7和Cyclin D1陽性表達與臨床分期和病理分級的關(guān)系 在臨床分期中，HPV16E7和Cyclin D1陽性表達率在Ⅰ～Ⅳ期隨分期增加呈上升趨勢，即Ⅳ期＞Ⅲ期＞Ⅱ期＞Ⅰ期；HPV16E7陽性表達率從Ⅰ期過渡到Ⅲ期時，差異無統(tǒng)計學意義(χ2= 4.45，P＞0.10)，但Ⅳ期與其他幾期差異有統(tǒng)計學意義(χ2=10.79，P＜0.05)。Cyclin D1陽性表達率隨著分期增加而顯著增加，各期間差異有統(tǒng)計學意義(χ2=21.36，P＜0.05)，見表2。在病理分級中，HPV16E7和Cyclin D1陽性表達率隨著病理組織分化程度減弱、分級增加呈現(xiàn)逐級增加趨勢，即Ⅲ級＞Ⅱ級＞Ⅰ級，各級間差異均具有統(tǒng)計學意義(χ2=27.81、32.57，P＜0.005)，見表3。

2.4 LSCC與HPV16E7和Cyclin D1陽性表達率之間相關(guān)性比較 在喉癌組織中HPV16E7和Cyclin D1陽性表達率與LSCC發(fā)生率均具有顯著正相關(guān)(r=0.79、 0.86，P=0.003、0.002)；HPV16E7陽性表達率與Cyclin D1陽性表達也呈顯著正相關(guān)(r=0.68，P=0.005)。

表2 喉癌中HPV16E7和Cyclin D1陽性表達率在臨床分期中比較[例(%)]

表3 喉癌中HPV16E7和Cyclin D1陽性表達率在病理分級中比較[例(%)]

3 討 論

LSCC是在大量不典型增生-癌變遺傳病變積累基礎(chǔ)上發(fā)生，其生物學行為是一種細胞周期紊亂性疾病，與原癌基因激活、抑癌基因失活、轉(zhuǎn)錄基因失調(diào)等異常生物學行為密切相關(guān)[6]。HPV16E7是致癌的重要轉(zhuǎn)化基因，負責早期區(qū)編碼HPV調(diào)整、轉(zhuǎn)換及蛋白復制。有關(guān)它在LSCC組織中陽性表達的機制還不明確。隨著對細胞調(diào)控認識，發(fā)現(xiàn)當患者遭受HPV感染后，負責控制細胞周期進程Cyclin D1將發(fā)生明顯異常表達[7]，這在本實驗中得到證實，LSCC組織中HPV16E7蛋白表達及其陽性率均明顯高于LPL以及VCP組織，而伴隨LSCC組織中HPV16E7陽性增加，Cyclin D1表達及其陽性率也顯著高于LPL以及VCP組織。提示HPV可能是一種重要致癌病毒，且對喉組織具有趨嗜性，使得喉組織在HPV反復感染下積累到一定量后，造成LSCC發(fā)生。在此基礎(chǔ)上，出現(xiàn)HPV16E7和處于細胞周期控制部位關(guān)鍵蛋白Cyclin D1表達水平顯著增加[8]。本實驗結(jié)果顯示，在喉癌組織中，HPV16E7和Cyclin D1陽性表達率分別達到44.93%和52.17%，說明在喉癌發(fā)生過程中，HPV嚴重感染侵襲喉組織使得HPV16E7成為喉癌發(fā)生啟動因素，Cyclin D1增加引起細胞周期紊亂，加速喉組織細胞異化，使得Cyclin D1成為加速和延續(xù)喉癌發(fā)生的維持因素。臨床上通過檢測喉組織中HPV16E7和Cyclin D1異常增加，能夠從側(cè)面反映出喉組織性質(zhì)改變及惡化傾向[9]。另外，在LPL組織中，亦發(fā)現(xiàn)HPV16E7和Cyclin D1陽性表達率也明顯高于VCP組織，提示臨床對于一些不典型增生和結(jié)構(gòu)改變喉組織角化病、黏膜白班、疣狀增生等需要引起高度重視，盡早開展藥物治療或擇期手術(shù)，加強喉癌前病變防治與篩查，動態(tài)觀察HPV16E7和Cyclin D1數(shù)值變化，把喉組織惡變趨勢消除在萌芽狀態(tài)[10]。

本實驗結(jié)果證實，隨著喉癌腫瘤臨床分期增加，HPV16E7和Cyclin D1在Ⅰ～Ⅳ期之間陽性表達逐步增多。提示臨床一旦檢測到喉組織中HPV16E7和Cyclin D1蛋白陽性表達逐步增強，發(fā)生喉癌風險極高，喉癌細胞增殖調(diào)控明顯增速、擴大和增多，喉癌細胞生成活躍程度增加，臨床上應采取積極治療措施，并為喉癌不同時段選擇正確治療方案[11]。另外，隨著喉癌組織病理程度加重，細胞分化程度減弱，喉組織中HPV16E7和Cyclin D1蛋白陽性表達率都呈逐漸增加趨勢，提示喉癌病理分型早于自身臨床表現(xiàn)，當喉癌組織出現(xiàn)臨床表現(xiàn)并檢測出HPV16E7和Cyclin D1陽性表達時，喉癌病理特征顯得更加嚴重，分化程度極低。說明喉組織中HPV16E7和Cyclin D1陽性表達與喉癌臨床分期和病理分級均具有顯著相關(guān)性，檢測喉組織中HPV16E7和Cyclin D1陽性表達，可用于喉癌惡性程度的評定，對喉癌患者早發(fā)現(xiàn)、早診斷和早治療顯得特別重要，兩者可作為判斷喉癌惡性程度和預后的一個重要參考指標[12]。

作為一種細胞周期紊亂性疾病，喉腔惡性腫瘤形成通路主要來自細胞周期網(wǎng)絡(luò)調(diào)控系統(tǒng)中G1/S期循環(huán)途徑，該調(diào)控系統(tǒng)在外來分裂刺激因素HPV強烈作用下，HPV16E7被激活并過度表達，直接或間接激活和增大處于G1中期Cyclin D1調(diào)控功能，最終造成喉癌腫瘤發(fā)生和發(fā)展[13]。所以，HPV16E7和Cyclin D1陽性表達率與喉癌發(fā)生率均具有顯著正相關(guān)，且HPV16E7陽性表達率與Cyclin D1陽性表達也呈現(xiàn)顯著正相關(guān)。提示喉癌生成可能與患者遭受HPV感染，刺激喉組織中HPV16E7過度表達，并引起Cyclin D1活性增加有關(guān)。HPV16E7可能是促使喉癌形成的啟動因素和初始條件，在其刺激因素作用下，誘發(fā)喉組織細胞周期中Cyclin D1過表達，并與細胞周期依賴性激酶結(jié)合，促使轉(zhuǎn)錄因子E2F與抑制蛋白分離而充分發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子作用，使喉組織中未成熟細胞在形成過程中跨過G1/S關(guān)卡，快捷由G1期向S期演進，致使未分化喉組織細胞無序增殖。并且Cyclin D1功能異常，阻斷干擾素產(chǎn)生，增加外源DNA整合及突變，抵抗細胞凋亡，使細胞永生化，最終造成細胞增殖失控而促進喉癌發(fā)生[14]。總之，喉癌的發(fā)生和發(fā)展與HPV嚴重感染宿主細胞造成HPV16E7過度表達，并刺激Cyclin D1惡性增加密切相關(guān)。對喉組織中HPV16E7和Cyclin D1檢測有利于提高臨床對喉癌發(fā)病原因及其機制認識，對喉癌早期預防、診斷和治療，以及患者預后評價均具有重要的臨床意義。

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Effects and clinical significances of abnormal expressions of key proteins of laryngeal tissues on patients with laryngeal squamous cell carcinoma

ZENG Han-rong1,YANG Hong-nv1,LI Wen-xing2,TU Xing2,KONG Wei-jia2. 1.Department of Otolaryngology,the People's Hospital of Zhijiang City,Zhijiang 443200,Hubei,CHINA;2.College of Life Science&Technology,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430022,Hubei,CHINA

ObjectiveTo investigate the effects and clinical significances of abnormal expressions of human papillomavirus 16E7 protein(HPV16E7)and cell cycle protein D1(Cyclin D1)on patients with laryngeal squamous cell carcinoma.MethodsAll the pathologic specimens were collected from the patients with laryngeal diseases who underwent surgical treatment because of different causes in Department of Otolaryngology of our hospital from May 2012 to February 2015,which included laryngeal squamous cell carcinoma(LSC group)and vocal cord polyp(VCP group)as well as laryngeal precarcinoma lesions(LPL group),with 69 cases in each group.According to the correlated standard of 2010 InternationalAnti-CancerAssociation,the clinical stage and pathological degree were further developed in the specimens of LSC group.The expression levels and clinical pathological features of HPV16E7 and Cyclin D1 were detected through the immunohistochemical SP staining methods.Moreover,the positive expression rate and correlational difference were analyzed and compared by statistical software in the three groups.ResultsThe positive expressions of HPV16E7 and Cyclin D1 were observed in cell nucleus in LSC group,which got a great number of thick and brown particles.Compared with VCP and LPL groups,the positive expression rate of HPV16E7 and Cyclin D1 were significantly increased in LSC group(44.93%vs 2.90%and 5.80%,52.17%vs 8.70%and 23.19%,respectively),P＜0.01.Compared with VCP group,the positive expression rate of HPV16E7 and Cyclin D1 in LPV group were significantly increased(P＜0.05).The positive expression rate of HPV16E7 and Cyclin D1 were increasingly grown up from stageⅠto stageⅣ,and raised with degreeⅢ＞degreeⅡ＞degreeⅠin LSC group(P＜0.01,respectively).The positive expression rate of the two proteins had significant positive correlation with the incidence of LSC(r=0.79,0.86,P=0.003,0.002),and positive expression rate of HPV16E7 had also completed positive correlation with that of Cyclin D1 in LSC group(r=0.68,P=0.005).ConclusionThe occurrence and development of laryngeal carcinoma might have the significant relationship with HPV16E7 and Cyclin D1 in patients with LSC.To detect HPV16E7 and Cyclin D1 in laryngeal organization of patients might contribute to enhancement of early diagnosis and prognosis of survival of laryngeal carcinoma patients in clinic.

Laryngeal squamous cell carcinoma(LSCC);Human papillomavirus 16E7 protein(HPV16E7); Cell cycle protein D1(Cyclin D1);Positive expression

R767

A

1003—6350（2017）05—0743—04

2016-09-07)

曾漢榮。E-mail：zenghr1963@163.com

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.05.019