趙盼，張學堯，劉曉健，趙小明，于榮榮，董瑋，馬恩波，張建珍，張敏

（1山西大學應用生物學研究所，太原 030006；2山西大學生命科學學院，太原 030006）

飛蝗幾丁質脫乙?；傅恼婧吮磉_、親和純化及酶活性

趙盼1,2，張學堯1，劉曉健1，趙小明1，于榮榮1,2，董瑋1，馬恩波1，張建珍1，張敏1

（1山西大學應用生物學研究所，太原 030006；2山西大學生命科學學院，太原 030006）

【目的】體外真核表達飛蝗（Locusta migratoria）幾丁質脫乙?；?和2（chitin deacetylase 1 and 2，LmCDA1和LmCDA2）并測定其酶活性，為進一步明確飛蝗LmCDA1和LmCDA2在幾丁質降解途徑中的生理功能及研發(fā)新型綠色環(huán)保殺蟲劑提供依據(jù)。【方法】使用BLASTP和SMART軟件在線預測LmCDA1、LmCDA2a和LmCDA2b的結構域；PCR克隆獲得目的基因LmCDA1、LmCDA2a和LmCDA2b的全長序列，并分別構建pFastBac-LmCDAs重組質粒，轉化獲得Bacmid重組質粒后，轉染至昆蟲Sf9細胞進行目的蛋白的體外表達。采用Western blot技術對目的蛋白表達情況進行檢測，并通過Ni-NTA親和層析柱和陰離子（Q-Sepharose）交換層析柱對蛋白產物進行純化。12% SDS-PAGE檢測蛋白純度后，采用分光光度法以對硝基乙酰苯胺為底物檢測目的蛋白的酶活性，T檢驗法對LmCDA2a和LmCDA2b酶活力進行差異顯著性分析?！窘Y果】BLASTP和SMART軟件預測結果顯示LmCDA1、LmCDA2a和LmCDA2b均含有4個結構域：N-端信號肽（signal peptide）、幾丁質結合域（chitin binding peritrophin-A，ChBD）、A型低密度脂蛋白受體結構域（low-density lipoprotein receptor class A，LDLa）和脫乙?；复呋Y構域（catalytic domain，CDA）。3個基因的幾丁質結合域中均包含6個保守的半胱氨酸。LmCDA2a和LmCDA2b兩個剪切子除在其第3個半胱氨酸和第4個半胱氨酸之間（67—84 aa）的氨基酸數(shù)目和組成及在第4和第6個半胱氨酸（84—106 aa）之間的序列存在差異外，其余部分完全一致。Western blot結果顯示LmCDA1、LmCDA2a和LmCDA2b的蛋白分子量約為61 kD左右，與預測的蛋白分子量大小一致，表明Bacmid重組質粒在昆蟲Sf9細胞中成功表達。采用12% SDS-PAGE膠電泳對各蛋白純化組分進行檢測，結果顯示Ni-NTA親和層析柱可將大部分雜蛋白洗脫，而Q-Sepharose交換層析柱可對蛋白進行更徹底地純化。酶活檢測結果顯示LmCDA1、LmCDA2a和LmCDA2b的酶活力分別為0.268、0.354、0.228 U·μL-1，并且LmCDA2a和LmCDA2b的酶活力存在顯著差異?！窘Y論】體外真核表達LmCDA1、LmCDA2a和LmCDA2b蛋白并進行酶活測定后發(fā)現(xiàn)三者均具有幾丁質脫乙酰基酶活力，且LmCDA2a和LmCDA2b的酶活力具有顯著性差異，推測前期研究中沉默LmCDA2a和LmCDA2b后分別出現(xiàn)不同飛蝗表型的原因可能是由于它們酶活力存在顯著性差異。

飛蝗；幾丁質脫乙?；?；真核表達；蛋白純化；酶活檢測

0 引言

【研究意義】飛蝗（Locusta migratoria）主要以禾本科植物為食，對農業(yè)生產造成極大的損害，是重要的農業(yè)害蟲[1]。由于長期采用化學防治，不僅對環(huán)境造成了嚴重的污染，而且導致飛蝗對常用殺蟲劑馬拉硫磷產生抗藥性，因此研發(fā)新型綠色環(huán)保殺蟲劑成為重要的社會熱點[2-3]。幾丁質是昆蟲及甲殼動物外骨骼的特有成分，對昆蟲正常的生長發(fā)育具有不可或缺的重要作用。幾丁質脫乙酰基酶（chitin deacetylase，CDA，E.C.3.2.1.41）是幾丁質降解通路中的重要酶系，能夠催化幾丁質中β-1,4糖苷鍵連接的N-乙?；咸前返囊阴０坊箮锥≠|水解并轉化為殼聚糖[4-5]。因此，對飛蝗幾丁質脫乙?；福↙mCDA）及其酶活力進行研究，對于后續(xù)以該酶為靶標研發(fā)特異性殺蟲劑具有重要的指導意義?！厩叭搜芯窟M展】目前有關昆蟲CDA基因的研究大多集中在雙翅目、鞘翅目和鱗翅目等昆蟲中。ARAKI等[6]在研究真菌細胞壁中幾丁質代謝時首次分離純化出 CDA蛋白。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)各物種之間 CDAs生物學功能具有差異性，在擬尺蠖（Trichoplusia ni）中CDA參與調控中腸圍食膜的形成[7]。在黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）中存在2個 CDAs基因序列，分別是 serpentine（serp）和vermiform（verm），二者均對胚胎期氣管的形成和延伸具有重要作用[8]。隨著研究的不斷深入，DIXIT等[9]利用生物信息學方法在4種昆蟲中做了系統(tǒng)的研究，把CDAs分為5種類型，其中GROUP-I和GROUP-II的CDAs包含幾丁質結合域、A型低密度脂蛋白受體結構域和脫乙?；复呋Y構域；GROUP-III和GROUP-IV中的CDAs包含幾丁質結合域和脫乙酰基酶催化結構域；而GROUP-V中的CDAs僅含有脫乙酰基酶催化結構域。此外，該研究還指出不同昆蟲的CDAs在功能域結構和mRNA表達特異性方面均存在差異[10-13]。ARAKANE等[14]在赤擬谷盜（Tribolium castaneum）中鑒定出9個CDAs，發(fā)現(xiàn)它們在不同組織部位和不同時期的表達模式具有很大的差異，并且敲除TcCDA1后幼蟲因不能正常蛻去舊表皮而死亡。筆者課題組前期工作利用RNAi技術研究發(fā)現(xiàn)，沉默中華稻蝗（Oxya chinensis）OcCDA1、OcCDA2和OcCDA2a基因后可導致中華稻蝗因蛻皮困難而死亡，而干擾OcCDA2b對中華稻蝗的生長發(fā)育沒有影響[15-16]；此外，在飛蝗中使LmCDA2a的表達下調后出現(xiàn)與中華稻蝗相似的表型[17]。目前關于幾丁質脫乙?；傅难芯恐饕性谄渖飳W功能的探討上，而有關昆蟲CDA酶活力體外測定的報道較少。2014年，ZHONG等[18]在畢赤酵母中成功表達了具有活性的家蠶（Bombyx mori）圍食膜幾丁質去乙?；??！颈狙芯壳腥朦c】根據(jù)課題組前期研究，筆者推測LmCDA2a和LmCDA2b基因沉默后導致飛蝗出現(xiàn)不同表型可能是由于這兩個基因的催化功能不同所引起。因此，本研究將LmCDA1、LmCDA2a和LmCDA2b體外表達并純化后對其酶活力進行測定?！緮M解決的關鍵問題】成功構建pFastBac-LmCDAs重組表達質粒，并在昆蟲Sf9細胞中實現(xiàn)異源表達。采用Western blot方法對表達的目的蛋白進行驗證后，探索適合LmCDA重組酶的分離純化條件及體系，并采用分光光度法以對硝基乙酰苯胺為底物對LmCDA重組酶催化活力進行檢測，為研發(fā)昆蟲特異性的綠色環(huán)保殺蟲劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

試驗于 2014—2015年在山西大學應用生物學研究所完成。

1.1 材料與試劑

材料：LmCDA1、LmCDA2a和LmCDA2b（GenBank登錄號KR537804和KR537805）全長質粒為筆者實驗室保存。pFastBacTMDual真核表達載體購于Invitrogen公司。草地貪夜蛾卵巢 Sf9細胞系購于昆明動物所。大腸桿菌 DH10Bac感受態(tài)細胞為筆者實驗室保存。

試劑：ExTaq酶、T4 DNA連接酶購買于Promega公司，DNA Marker、Xba I和Hind Ⅲ限制性內切酶購于NEB公司，IPTG、X-Gal購于TaKaRa公司，Trizol試劑購于Invitrogen；無內毒素質粒提取試劑盒、質粒提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒均購于OMEGA公司；Ni-NTA親和層析柱和Q-Sepharose陰離子交換層析柱材料購于GE公司。

1.2 引物設計

本研究所用引物采用 Primer Express 5.0軟件設計，由生物工程（上海）股份有限公司合成，具體見表1。

1.3 幾丁質脫乙?；富虻恼婧吮磉_

1.3.1 LmCDA1、LmCDA2a和LmCDA2b克隆和純化 以LmCDA1、LmCDA2a和LmCDA2b全長序列為模板，利用PCR擴增技術獲得帶有雙酶切位點（Xba I、Hind III）和編碼尾部6×His標簽的LmCDA1、LmCDA2a和LmCDA2b。1%的瓊脂糖凝膠對PCR產物進行電泳檢測，并將目的基因全長序列純化回收，置于 4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 飛蝗幾丁質脫乙?；富颍↙mCDAs）的表達引物Table 1 Primers used for PCR amplification of chitin deacetylase gene (LmCDAs) in L. migratoria

1.3.2 pFastBac-LmCDA重組載體的構建 用 Xba I和Hind III對pFastBacTMDual質粒和上述3種PCR回收產物分別進行雙酶切后，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產物后完成目的片段的膠回收；雙酶切后的pFastBacTMDual質粒片段和目的基因按3﹕1的摩爾比例混合，T4 DNA連接酶16℃連接過夜，連接產物轉化至Trans-T1感受態(tài)細胞后，在含有100 μg·mL-1的氨芐和100 μg·mL-1慶大霉素的LB瓊脂平板上篩選陽性克隆。LB培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)后，提取質粒，隨后進行酶切及測序驗證。

1.3.3 Bacmid重組載體的構建與鑒定 將構建成功的pFastBac-LmCDA1、pFastBac-LmCDA2a和pFastBac-LmCDA2b重組質粒分別轉化到DH10 Bac感受態(tài)細胞中。重組中間載體通過同源重組整合入DH10 Bac感受態(tài)細胞攜帶的Bacmid質粒中，37℃培養(yǎng)20 h，進行藍白斑篩選。由于重組 Bacmid 基因序列大于 135 kb，采用普通酶切鑒定陽性克隆的方法可能導致雜帶過多，因此采用轉座位點 mini-attTn7兩側的M13F/M13R作為引物進行PCR擴增鑒定。擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，采用OMEGA無內毒素質粒提取試劑盒提取 Bacmid重組質粒，用于后續(xù)轉染試驗。

1.3.4 Bacmid重組質粒的轉染及表達 將長勢良好的昆蟲Sf9細胞常規(guī)消化后接種到24孔培養(yǎng)板內，以無抗生素的細胞培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，次日，待細胞密度接近 80%時按照 LipofectamineTM3000轉染試劑盒說明完成Bacmid重組質粒對Sf9細胞的轉染。轉染共分為3組：空白對照組、空載體對照組（pFastBacTMDual）和試驗組（pFastBac-LmCDAs）。分別轉染12、24和72 h，在顯微鏡下觀察Bacmid重組質粒轉染Sf9細胞后的形態(tài)，并在轉染72 h時收集細胞進行檢測。

1.3.5 表達產物的Western blot檢測與純化 離心收集的細胞中加入1 mL 50 mmol·L-1的磷酸鹽緩沖液（pH 7.2）和10 μL 100 mmol·L-1的PMSF，冰上勻漿，使細胞充分破碎。2 000 r/min，4℃離心5 min，收集上清，得到粗酶液。粗酶液在12%的SDS-PAGE膠上電泳后，100 V恒壓轉印100 min至 PVDF膜上，隨后用5% w/v牛血清蛋白TBST緩沖液于4℃封閉過夜；TBST洗膜3次；按1﹕1 000比例稀釋抗His標簽鼠單克隆抗體，室溫孵育2 h，TBST洗膜3次；按1﹕5 000比例稀釋二抗（羊抗鼠 IgG），室溫孵育2 h，TBST洗膜3次后，在雙色紅外激光成像系統(tǒng)中進行避光顯色。

Western blot鑒定成功后對目的蛋白進行純化。由于重組蛋白尾部攜帶6×His標簽序列，利用Ni-NTA親和層析柱與6×His蛋白標簽上的組氨酸咪唑基團特異性結合的原理，使用咪唑線性梯度的方法將目標蛋白洗脫下來，完成重組蛋白的初步純化。保留部分粗酶液作為柱前對照后，將剩余粗酶液與鎳柱材料在4℃條件下溫和顛倒振蕩孵育2 h后，4℃離心收集穿透液。用含20 mmol·L-1咪唑的磷酸緩沖液（50 mmol·L-1，pH 8.0）洗去雜蛋白，再用含有20—300 mmol·L-1咪唑的磷酸緩沖液（50 mmol·L-1，pH 8.0）以 2.0 mL·min-1的流速洗脫目的蛋白，最后用12%的 SDS-PAGE膠電泳對純化后的各組分純度進行檢測。

采用陰離子（Q-Sepharose）交換層析柱對上述純化的蛋白進行進一步純化。首先將含有目的蛋白的洗脫液直接上樣于磷酸鈉緩沖液（50 mmol·L-1，pH 8.0）預平衡過的Q-Sepharose層析柱中，之后用含有0—1 mol·L-1氯化鈉的磷酸緩沖液（50 mmol·L-1，pH 8.0）洗脫目的蛋白，流速為2.0 mL·min-1，最后用12%的SDS-PAGE蛋白膠對純化后的各組分進行純度檢測。

1.3.6 目的蛋白CDA酶活力測定 （1）對硝基乙酰苯胺和對硝基苯胺特征吸收波長的確定：分別配制0.07 mmol·L-1對硝基乙酰苯胺、對硝基苯胺的水溶液，采用酶標儀在310—480 nm的波長范圍內進行掃描，以去離子水作為參比，測定對硝基乙酰苯胺和對硝基苯胺的特征吸收波長[19]。

（2）對硝基苯胺標準曲線的繪制：稱取1 mg對硝基苯胺溶解于10 mL水中，加入微量丙酮助溶，混勻后用蒸餾水進行梯度稀釋制備1—10 mg·L-1不同濃度梯度的標準品。隨后，以蒸餾水作為參比，測定各濃度標準品在400 nm處的吸光值；以標準品濃度為橫坐標，以400 nm處吸光值為縱坐標，繪制對硝基苯胺標準曲線，并通過計算標準曲線斜率確定線性系數(shù)K。

（3）酶解反應體系及條件：配制200 mg·L-1的對硝基乙酰苯胺底物溶液作為母液，微量丙酮助溶。向含有100 μL的底物溶液中加入300 μL提前預熱的磷酸鹽緩沖液后，迅速加入100 μL酶液，于50℃反應15 min后，100℃煮沸終止反應。再加入超純水定容至1 000 μL，混勻，845×g離心10 min，取200 μL上清于酶標板中，用酶標儀檢測其 400 nm處吸光值（A400）。空白對照體系：100 μL底物溶液加300 μL磷酸鹽緩沖液以及100 μL相應高溫預滅活的酶液后，加入超純水定容至1 000 μL，然后吸取200 μL檢測其吸光值（A0）。上述每個反應均包含3個生物學重復。

酶活力單位定義：在上述酶催化反應條件下，每小時產生1 μg對硝基苯胺所需要的酶量定義為1個酶活力單位（U·μL-1）。計算公式：酶活力=（A400-A0）×酶液稀釋倍數(shù)/KT。式中，A400為待測酶液樣品的吸光值；A0為預滅活酶液樣品的吸光值；T為酶促反應時間（h）；K為線性系數(shù)。

2 結果

2.1 LmCDA1、LmCDA2a和LmCDA2b的結構域預測

使用 BLASTP和 SMART軟件，在線預測LmCDA1、LmCD2a和LmCDA2b的結構域。LmCDA1、LmCD2a和LmCDA2b均含有4個結構域： N-端信號肽（signal peptide）、幾丁質結合域（chitin binding peritrophin-A，ChBD）、A型低密度脂蛋白受體結構域（low-density lipoprotein receptor class A，LDLa）和脫乙?；复呋Y構域（catalytic domain，CDA）（圖1）。3個基因的幾丁質結合域中均包含6個保守的半胱氨酸。LmCDA2a和LmCDA2b兩個剪切子除在其第3個半胱氨酸和第4個半胱氨酸之間（67—84 aa）的氨基酸數(shù)目和組成及在第4和第6個半胱氨酸（84—106 aa）之間的序列存在差異外，其余部分完全一致。

2.2 LmCDA1、LmCDA2a和LmCDA2b克隆和純化

以LmCDAs全長序列為模板，用所設計的蛋白表達引物進行PCR擴增，擴增產物使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。結果如圖2所示，以DL5000 DNA Ladder為參照，得到3條與預期大小一致的擴增產物（圖中箭頭位置所示）。

圖1 LmCDA1、LmCDA2a和LmCDA2b的結構域預測示意圖Fig. 1 Schematic diagram of deduced domains of LmCDA1, LmCDA2a and LmCDA2b

2.3 pFastBacTM-LmCDA重組載體的構建

圖2 飛蝗幾丁質脫乙?；富虻腜CR擴增Fig. 2 PCR amplification of chitin deacetylase in L. migratoria

使用膠回收試劑盒對PCR擴增產物進行回收純化。將攜帶有酶切位點的目的基因序列和中間載體質粒pFastBacTMDual分別經過Hind Ⅲ和Xba I進行雙酶切后，回收目的基因序列和載體片段；用 T4DNA連接酶連接目的基因序列和載體片段，獲得重組載體質粒。通過雙酶切方法對重組載體質粒進行 1%瓊脂糖電泳檢測。泳道2、4和6顯示pFastBac-LmCDA1、pFastBac-LmCDA2a、pFastBac-LmCDA2b重組載體經過Hind Ⅲ和Xba I雙酶切后得到pFastBacTMDual載體骨架及目的基因序列（圖3）。

圖3 重組質粒的雙酶切鑒定Fig. 3 Identification of recombinant plasmid by Hind Ⅲ and Xba I

2.4 Bacmid重組載體的構建及鑒定

由于重組Bacmid 基因序列大于135 kb，采用普通酶切鑒定陽性克隆方法可能導致雜帶過多，因此采用轉座位點mini-attTn7兩側的M13F/M13R作為引物進行PCR擴增后，1%瓊脂糖電泳檢測。泳道 1為轉染空pFastBacDual質粒的Bacmid重組載體的陰性對照，該PCR擴增產物約為2 560 bp；泳道2、3和4分別為Bacmid-LmCDA1、Bacmid-LmCDA2a、Bacmid-LmCDA2b的PCR鑒定結果，其目的片段大小分別為4 198、4 216、4 198 bp。PCR鑒定結果表明上述3種重組Bacmid質粒構建成功（圖4）。

2.5 表達產物的Western blot檢測

表達產物經 12% SDS-PAGE膠電泳后進行Western blot 檢測。如圖5所示，只有轉染Bacmid重組質粒的試驗組（泳道3、4和5）有約為61 kD左右的特異性蛋白條帶（黑色箭頭所指位置），其蛋白分子量大小均與在線預測的蛋白分子量大小相符；而空載體對照組（泳道 2）和空白對照組（泳道 1）均無特異性蛋白條帶，表明目的蛋白在昆蟲Sf9細胞中成功表達，并具有免疫活性，可被抗體特異識別。

圖4 重組Bacmid質粒的PCR鑒定Fig. 4 Identification of recombinant Bacmid plasmid by PCR

圖5 Western blot檢測重組質粒在Sf9細胞中表達Fig. 5 Western blot detected the expression of recombinant plasmid in the cells of Sf9

2.6 表達產物的純化

表達產物與Ni-NTA親和層析柱結合，采用咪唑線性梯度的方法對目的蛋白進行初步純化后，用12% SDS-PAGE電泳檢測各組分洗脫樣品。結果如圖6-A—6-C所示，泳道5、7、9、11中均含有明顯的目的條帶（黑色箭頭所示，大小約為61 kD），但是各組分樣品仍可見雜蛋白條帶，需要通過其他方法進一步分離純化。

將經過 Ni-NTA親和層析且含目標條帶的蛋白組分混合，然后通過 Q-Sepharose交換層析柱進行更精細的純化。將組分用氯化鈉線性梯度洗脫后收集的各餾分進行 SDS-PAGE電泳檢測，結果如圖6-D—6-F中黑色箭頭所示。圖6-D的泳道1、圖6-E的泳道7、圖6-F的泳道11均可見在61 kD處目的蛋白條帶單一，表明3種重組蛋白純度符合后續(xù)酶活檢測要求。

2.7 目的蛋白CDA酶活力測定

2.7.1 對硝基乙酰苯胺和對硝基苯胺特征吸收波長的測定 分別配制 0.07 mmol·L-1對硝基乙酰苯胺、對硝基苯胺的水溶液，以去離子水作為參比，用酶標儀在310—480 nm波長范圍內進行吸光度掃描，測定其特征吸收波長（圖 7-A）。對硝基乙酰苯胺的最大吸收峰處于317 nm，而對硝基苯胺的最大吸收峰在380 nm處。由于380 nm處存在對硝基乙酰苯胺的干擾，而在400 nm處對硝基乙酰苯胺干擾較小，吸收仍然強烈，因此選擇400 nm作為檢測波長。

2.7.2 對硝基苯胺標準曲線的繪制 以標準品濃度為橫坐標，400 nm處吸光值為縱坐標，建立對硝基苯胺標準曲線（圖 7-B）。對硝基苯胺標準曲線的 R2為0.998，表明在 OD0—OD1范圍內不同濃度的對硝基苯胺溶液與400 nm處的吸光值具有良好的線性關系，符合比爾定律，可以通過分光光度法進行定量測定對硝基苯胺的量。

2.7.3 目的蛋白酶活力檢測 LmCDA1、LmCDA2a和 LmCDA2b的酶活力分別為 0.268、0.354、0.228 U·μL-1（表2），說明以上3種重組蛋白酶體外表達均具有幾丁質脫乙?；该富盍Α?LmCDA2a和LmCDA2b酶活力進行差異顯著性分析發(fā)現(xiàn)LmCDA2a和LmCDA2b兩者之間的酶活力具有顯著差異（P＜0.05）（圖7-C）。

圖6 目的蛋白LmCDA1、LmCDA2a和LmCDA2b的純化Fig. 6 The purification of the purpose proteins of LmCDA1, LmCDA2a and LmCDA2b

圖7 對硝基乙酰苯胺和對硝基苯胺紫外可見吸收光譜（A）、對硝基苯胺標準曲線（B）及LmCDA2a和LmCDA2b酶活力差異顯著性分析（C）Fig. 7 Absorption spectrum of p-nitroacetanilide and p-nitroaniline (A), standard curve of p-nitroaniline (B) and significant difference analysis of LmCDA2a and LmCDA2b enzyme activity (C)

3 討論

體外表達并制備出有活性的蛋白對于更好地研究飛蝗CDA基因的生物學功能至關重要。本研究采用昆蟲Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)構建LmCDAs的重組質粒，通過體外轉染昆蟲sf9細胞，獲得具有生物活性的功能 CDA蛋白，并對其酶活力進行檢測。

表2 體外表達的LmCDAs的酶活力Table 2 Enzyme activity of in vitro expressed LmCDAs

本研究采用Western blot技術檢測目的蛋白在昆蟲Sf9細胞中的表達情況，結果顯示pFastBac-LmCDAs重組產物對應的泳道內檢測到約61 kD蛋白分子量的特異性目的條帶，與在線預測的目的蛋白分子量大小一致，而空白對照組和空載體對照組pFastBac-LmCDAs在61 kD蛋白分子量處均無條帶出現(xiàn)，表明標記有組氨酸標簽的目標蛋白在昆蟲Sf9細胞中成功表達。但是，在pFastBac-LmCDAs重組產物對應的泳道內，除了約61 kD的特異性目標條帶外，還分別可以看到約58、55和55 kD較小的蛋白片段。這與經過Ni-NTA親和層析純化后得到的蛋白組分一致，推測這3個較小蛋白條帶是His標簽抗體檢測到的非特異性蛋白。

探索并建立了飛蝗幾丁質脫乙?；傅募兓w系，但采用Ni-NTA親和層析法得到的純化蛋白仍然存在少量雜蛋白，推測可能是由于草地貪夜蛾Sf9真核表達體系中除了帶有組氨酸標簽的目的蛋白外自身存在著其他組氨酸含量較高的蛋白，或者是目的蛋白的隨機水解片段，這些蛋白均可被Ni-NTA柱識別并被高濃度咪唑洗脫。2013年，LIU等[20]在 Bm-DNAPOL純化中使用Ni-NTA親和純化的基礎上，進一步使用Mono Q 陰離子交換層析柱對蛋白進行更徹底的純化，從而有效的分離目的蛋白?；诖耍狙芯繉⒔涍^Ni-NTA親和層析且含目標條帶的蛋白組分混合后，采用 Q-Sepharose交換層析柱對其進行進一步的純化。結果顯示經過兩步純化后，LmCDA1、LmCDA2a和LmCDA2b的目的蛋白和雜蛋白均得到了有效的分離。

由于幾丁質不溶于水，若以幾丁質為底物，需預先處理制成水溶性衍生物，并且?guī)锥≠|脫乙酰產物檢測也缺乏簡便方法，造成酶活力檢測困難，所以直接用幾丁質作底物進行酶活力測定的報道較少。目前CDA酶活力的測定方法主要有3種，即放射標記法、NADH顯色法和吲哚/鹽酸法比色法[21-26]。ZHONG等[18]在畢赤酵母中成功表達家蠶圍食膜的幾丁質去乙?；?，以對硝基乙酰苯胺為底物測得其酶活力為0.00185 U·μL-1。對硝基乙酰苯胺含有乙?；?，它可以在 CDA酶的催化下脫去乙?；纬蓪ο趸桨?。該方法具有操作簡便、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好等優(yōu)點。因此，本研究以對硝基乙酰苯胺為底物對其進行酶活測定，證明了LmCDA1、LmCDA2a和LmCDA2b蛋白在體外具有脫乙?；墓δ?。筆者實驗室前期對LmCDA2的生物學功能進行研究，RNAi干擾結果表明LmCDA2a的沉默導致飛蝗因蛻皮困難而死亡，對其生長發(fā)育起著重要的作用，而LmCDA2b對飛蝗的生長發(fā)育沒有影響[17]。為了探討 LmCDA2a和 LmCDA2b在飛蝗生長發(fā)育中功能的差異是否由其催化功能不同所導致，本研究在前期對LmCDA2a、LmCDA2b的體內功能分析的基礎上，體外真核表達獲得 LmCDA2a和LmCDA2b具有酶活性的蛋白，并且發(fā)現(xiàn)二者酶活力具有顯著差異。這一結果為后續(xù)進一步研究飛蝗幾丁質去乙酰基酶生理功能提供了基礎資料，并為從基因水平上尋找新型殺蟲劑靶標、研發(fā)新型綠色環(huán)保殺蟲劑打下了基礎。

4 結論

利用Bac-to-Bac真核表達系統(tǒng)成功表達出具有生物活性的LmCDA1、LmCDA2a和LmCDA2b 蛋白，發(fā)現(xiàn)LmCDA2a和LmCDA2b酶活力具有顯著性差異。從酶學角度為之前提出的推測（LmCDA2a和LmCDA2b基因沉默后導致飛蝗表型不同可能是由于它們的催化功能不同）提供了理論依據(jù)。

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（責任編輯 岳梅）

Eukaryotic Expression, Affinity Purification and Enzyme Activity of Chitin Deacetylase in Locusta migratoria

ZHAO Pan1,2, ZHANG XueYao1, LIU XiaoJian1, ZHAO XiaoMing1, YU RongRong1,2, DONG Wei1, MA EnBo1, ZHANG JianZhen1, ZHANG Min1
(1Research Institute of Applied Biology, Shanxi University, Taiyuan 030006;2College of Life Science, Shanxi University, Taiyuan 030006)

【Objective】 The objective of this study is to investigate the eukaryotic expression and enzyme activity of chitin deacetylase 1 and 2 (LmCDA1 and LmCDA2) in Locusta migratoria. The results will provide an experimental basis to further clarify the physiological function of LmCDA1 and LmCDA2 in chitin degradation pathway and the development of new green pesticides.【Method】The domains of LmCDA1, LmCDA2a and LmCDA2b were predicted using BLASTP and SMART softwares. Thefull-length sequences of LmCDA1, LmCDA2a and LmCDA2b were obtained by PCR. Recombinant plasmids of pFastBac-LmCDAs were constructed, the recombinant Bacmid plasmids were obtained by transformation, and then transfected into Sf9 insect cells to express target proteins in vitro. Target proteins were detected by Western blot technology, and then purified by Ni-NTA affinity chromatography column and anion exchange chromatography column (Q-Sepharose). The purity of proteins was detected by 12% SDS-PAGE, and the enzymes activity was detected by spectrophotometric method with p-nitroacetylaniline as substrate. The method of T test was used to analyze the difference of enzyme activity of LmCDA2a and LmCDA2b. 【Result】 The results by using BLASTP and SMART softwares showed LmCDA1, LmCDA2a and LmCDA2b contained four structural domains, that are signal peptide, chitin binding peritrophin-A (ChBD), low-density lipoprotein receptor class A (LDLa) and catalytic domain (CDA). Three genes contained six conserved cysteines in ChBD. The spacing and amino acid composition between cysteines 3 and 4 (67-84 aa) and the sequence between cysteines 4 and 6 (84-106 aa) differed between LmCDA2a and LmCDA2b, the rest were identical. Western blot result showed that the protein molecular weight of LmCDA1, LmCDA2a and LmCDA2b was about 61 kD, consistent with the prediction, which suggested that the recombinant Bacmid plasmids were expressed successfully in Sf9 insect cells. The purity of purified proteins was detected by 12% SDS-PAGE electrophoresis. Most impurities could be removed by Ni-NTA affinity chromatography, and the proteins were further purified by Q-Sepharose exchange chromatography. Enzyme activity determination showed that LmCDA1, LmCDA2a and LmCDA2b had chitin deacetylase activity of 0.268, 0.354 and 0.228 U·μL-1, respectively, and the activity of LmCDA2a and LmCDA2b showed significant differences. 【Conclusion】Eukaryotic expression in vitro and enzyme activity determination of LmCDA1, LmCDA2a and LmCDA2b revealed that these three enzymes have chitin deacetylase activity, and LmCDA2a and LmCDA2b enzyme activity has a significant difference. It was speculated that the reasons of different phenotypes of L. migratoria when LmCDA2a and LmCDA2b were silenced might be that LmCDA2a and LmCDA2b enzyme activity had a significant difference.

Locusta migratoria; chitin deacetylase; eukaryotic expression; protein purification; activity detection

2016-10-04；接受日期：2016-12-27

國家自然科學青年基金（31402020）、山西省基礎研究計劃（2015011070）、山西省回國留學人員科研資助項目（2015-007）

聯(lián)系方式：趙盼，E-mail：m15735172763@163.com。通信作者張敏，E-mail：minzhang7801@126.com