李亞楠，趙兵令，王海東，陳天直，劉穎，常露程，董常生

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)，山西太谷 030801）

內(nèi)皮素3對不同毛色綿羊黑色素細胞的影響

李亞楠，趙兵令，王海東，陳天直，劉穎，常露程，董常生

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)，山西太谷 030801）

【目的】探索內(nèi)皮素3（EDN3）對來源于不同毛色體外培養(yǎng)的黑色素細胞產(chǎn)生黑色素作用機制及差異的影響。【方法】體外培養(yǎng)不同毛色皮膚來源的黑色素細胞，通過MTT法檢測不同細胞在EDN3影響下的增殖率，分別提取兩種細胞的總RNA和總蛋白，總RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用實時熒光定量PCR方法檢測EDN3對兩種細胞內(nèi)EDNRB、NRas及TYR在mRNA水平相對表達量的影響，總蛋白通過Western blot方法檢測EDN3對兩種細胞內(nèi)EDNRB、NRas及TYR在蛋白水平的表達量是否發(fā)生變化，結(jié)果均使用SPSS19.0軟件進行差異顯著性分析?！窘Y(jié)果】MTT法測得EDN3對黑白兩種來源的黑色素細胞的增殖均產(chǎn)生促進作用，實時熒光定量PCR結(jié)果顯示添加EDN3的白色來源細胞內(nèi)EDNRB mRNA的相對表達量是正常細胞組的1.7992倍，NRas是正常細胞組的1.8536倍差異極顯著(P<0.01)，但TYR mRNA的相對表達量未發(fā)生明顯變化；添加EDN3的黑色來源細胞內(nèi)EDNRB mRNA的相對表達量是正常細胞組的2.2512倍，NRas是正常細胞組的1.3859倍，TYR是正常細胞組的15.5710倍差異極顯著(P<0.01)；Western blot結(jié)果顯示添加 EDN3的白色來源細胞內(nèi) EDNRB 蛋白表達量是正常細胞組的3.0827倍差異極顯著(P<0.01)，NRas是正常細胞組的1.2936倍差異顯著(P<0.05)，TYR蛋白表達量未發(fā)生明顯變化；添加EDN3的黑色來源細胞內(nèi)EDNRB 蛋白表達量是正常細胞組的3.9800倍差異極顯著(P<0.01)，NRas是正常細胞組的1.3658倍差異顯著(P<0.05)，TYR是正常細胞組的1.8498倍差異顯著(P<0.05)。【結(jié)論】EDN3促進白色來源的黑色素細胞增殖但對色素合成的限速酶TYR未產(chǎn)生促進作用；EDN3促進黑色來源的黑色素細胞增殖并可能促進黑色素生成。

內(nèi)皮素3（EDN3）；綿羊；毛色；黑色素細胞

0 引言

【研究意義】內(nèi)皮素（endothelin，EDN）是一類由內(nèi)皮細胞合成分泌的活性肽包括 EDN1、EDN2、EDN3，各亞型的功能因分布部位不同而有一定的差異，主要作用為參與血管擴張劑的釋放及促進細胞有絲分裂[1-3]。EDN3對心血管系統(tǒng)的穩(wěn)定及血壓的調(diào)節(jié)有一定的作用[4]。在毛色形成的主要部位，EDN3由角化細胞及內(nèi)皮細胞合成分泌，并通過EDNRB與黑色素細胞結(jié)合通過一系列的分子調(diào)控，最后作用于MITF（小眼畸形轉(zhuǎn)錄因子）從而影響黑色素的合成及轉(zhuǎn)運[5]?！厩叭搜芯窟M展】已有研究表明，在不同物種不同部位的色素沉著均顯示 EDN3有明顯的調(diào)控作用[6]。其中在細胞水平的研究顯示，EDN3與KIT信號途徑對黑色素細胞發(fā)育存在必不可少的協(xié)同作用[7]，EDN3對黑色素細胞前體的遷移及增殖有較大的影響，并與生長因子一起成為形成成熟的黑色素細胞必要的因子[8]。EDN3對已成熟的羊駝黑色素細胞有促進增殖分化的作用，明顯促進黑色素細胞數(shù)量的變化[9]。另有研究稱EDN3對黑色素細胞分泌的黑色素小體的轉(zhuǎn)運有一定的影響[10]。體外培養(yǎng)的黑色素細胞在EDN3 的刺激下，細胞數(shù)量顯著增加黑色素的合成也相應(yīng)的增多。EDN3及其受體所組成的信號通路參與黑色素的合成并發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[11]。EDN3在黑色素瘤以及人類的皮膚色素過度沉著等疾病中均發(fā)揮作用，主要表現(xiàn)在對黑色素細胞前體細胞的分化及已成熟細胞的增殖均有影響[12-13]。關(guān)于內(nèi)皮素家族及其受體的研究進展顯示其對體外培養(yǎng)的黑色素細胞的促增殖作用較明顯，對于色素合成的相關(guān)基因有一定的促表達作用。但在不同毛色綿羊皮膚中的組織定位及表達的分析顯示EDN3在黑色及白色皮膚中表達有異[14]?！颈狙芯壳腥朦c】在體外培養(yǎng)的不同毛色綿羊皮膚來源的黑色素細胞中EDN3的作用是否有所不同，仍未見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究通過對不同毛色的綿羊皮膚來源的黑色素細胞進行試驗，分析EDN3對黑色素細胞的作用，進一步補充EDN3的作用機制。

1 材料與方法

本試驗于2014年11月至2015年2月在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)羊駝生物工程實驗室進行。

1.1 試劑

MELM(2201)(SCIENCELL)，胰酶（1﹕250）（solarbio），胎牛血清（杭州四季青公司），RNA提取試劑盒，反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara 公司產(chǎn)品），QuantiFast SYBR Green PCR Kit（ QIAGEN 公司產(chǎn)品），EDN3，EDRB抗體（生工生物公司產(chǎn)品），NRas抗體（生工生物公司產(chǎn)品），TYR抗體（生工生物公司產(chǎn)品）。

1.2 材料

綿羊黑色素細胞（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)羊駝生物工程實驗室提供），分別為白色綿羊皮膚來源與黑色綿羊皮膚來源(皮膚取自1歲左右小尾寒羊介休羊場提供）。

1.3 方法

1.3.1 黑色素細胞的復(fù)蘇與傳代 從液氮罐中取出細胞凍存管并快速置于提前加熱至37℃的水浴鍋中，輕輕搖動使其迅速融化。待細胞完全融化并酒精消毒后置于超凈臺，加入培養(yǎng)基輕輕吹打使細胞懸浮，將該細胞懸液轉(zhuǎn)移至15mL離心管，4℃，1 000 r/min離心10 min。棄去上清液，加入黑色素培養(yǎng)基輕輕吹打懸浮細胞后接種于6孔細胞培養(yǎng)板，靜置于5% CO2培養(yǎng)箱，37℃培養(yǎng)，24 h后觀察細胞貼壁情況并更換新鮮培養(yǎng)基。

1.3.2 黑色素細胞活力的測定 采用四甲基偶氮噻唑藍比色法（MTT法)[15]。取對數(shù)生長期細胞，0.25%胰酶+EDTA消化，分別計數(shù)并調(diào)節(jié)細胞濃度為1×104個/mL接種于96孔板靜置培養(yǎng)24 h，更換為添加有不同濃度 EDN3的黑色素培養(yǎng)基，置于 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。每孔加入5mg·mL-1的MTT溶液200μL，放置培養(yǎng)箱孵育4 h，棄去上清液，每孔加二甲基亞砜（DMSO）150μL。在酶標儀上以490nm 波長測各孔吸光度值計算添加不同濃度EDN3后細胞的增值率。促增殖率＝（添加EDN3 A490值-無EDN3A490值）/（無EDN3 A490值－培養(yǎng)基A490值）×100%[14]。

1.3.3 Real-time PCR檢測 使用RNA提取試劑盒提取細胞總RNA，測定濃度后按照Takara公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成 cDNA。根據(jù) GenBank上的綿羊EDNRB、NRas和TYR序列，利用Premier 5.0 軟件設(shè)計引物并通過NCBI初步檢測引物的特異性。引物由北京華大基因公司合成。引物序列見表1。按照Applied Biosystems公司熒光定量試劑盒進行擴增，反應(yīng)結(jié)束通過 2－△△CT法計算目的基因在不同毛色綿羊皮膚中的相對表達水平?！鰿T目的基因= CT目的基因－CT內(nèi)參基因，△△CT = △CT白色綿羊組－△CT黑色綿羊組，各個目的基因mRNA表達差別倍數(shù)以2－△△CT表示。

表1 目的基因引物序列及PCR擴增條件Table 1 Sequence of premiers and conditions for PCR amplification

1.3.4 蛋白免疫印跡試驗 用碧云天蛋白裂解液提取細胞總蛋白，檢測總蛋白濃度，上樣調(diào)整一致后進行SDS﹣聚丙烯酰胺凝膠電泳。濃縮膠與分離膠電泳條件分別為恒壓80V與120V，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)至NC膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，用5%封閉蛋白干粉室溫封閉1h，加入EDNRB（1﹕1 000）、NRas（1﹕500）、TYR（1﹕1 000）和β-actin（1﹕1 000）一抗4℃過夜孵育。水平搖床上用TBST清洗NC膜，10min×3次。根據(jù)一抗來源選擇HRP標記的二抗（1﹕10 000）37℃搖床孵育1 h。二抗孵育結(jié)束后，用TBST漂洗NC膜5min×6次。使用康為高靈敏度ECL顯色后暗室曝光，得到有條帶的膠片掃描并分析。用Image-ProPlus 6.0軟件對綿羊色素細胞免疫印跡結(jié)果進行分析。蛋白含量=條帶面積×平均灰度，目的蛋白相對定量值=目的蛋白含量/β-actin蛋白含量。數(shù)據(jù)均用Means±SE表示，用SPSS軟件進行單因素方差分析，P<0.05差異顯著，P<0.01差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 黑色素細胞的形態(tài)學(xué)觀察

兩種來源的黑色素細胞復(fù)蘇及傳代后，均呈雙樹突或三樹突狀且正常貼壁生長、狀況良好，添加EDN3后，細胞無明顯的形態(tài)學(xué)變化（圖1）。

2.2 EDN3對細胞增殖率的影響

利用 MTT法測得細胞增值率的結(jié)果顯示兩種來源的黑色素細胞在EDN3的刺激下增值率均有所提高，但以EDN3在1×10-8mol·L-1濃度時細胞的增殖率變化最為明顯，且濃度過高時（1×10-7，1×10-6）反而會有一定的抑制作用。比較兩種細胞的增值率顯示白色皮膚來源的黑色素細胞在 EDN3為 1×10-8mol·L-1時的增殖率明顯高于黑色皮膚來源的黑色素細胞（圖2）。

2.3 EDNRB、NRas及TYR mRNA的變化

通過qRT-PCR方法檢測了1×10-8mol·L-1濃度的EDN3對EDNRB、NRas及TYR mRNA相對表達量的影響。統(tǒng)計結(jié)果分析顯示：添加EDN3的白色來源細胞內(nèi) EDNRB mRNA 的相對表達量為1.8007±0.1434是正常細胞組的 1.7992倍，NRas mRNA的相對表達量為1.8552±0.0999是正常細胞組的1.8536倍差異極顯著（P<0.01），但TYR mRNA的相對表達量為1.0005±0.0358相較正常組細胞未發(fā)生明顯變化。添加EDN3的黑色來源細胞內(nèi)EDNRB mRNA的相對表達量為2.2542±0.1598是正常細胞組的2.2512倍，NRas mRNA的相對表達量為1.3950± 0.0329是正常細胞組的1.3859倍，TYR mRNA的相對表達量為15.6190±0.3239是正常細胞組的15.5710倍差異極顯著（P<0.01）。與正常培養(yǎng)的細胞相比，添加 EDN3的細胞色素相關(guān)基因的表達量均發(fā)生了變化。EDN3的受體EDNRB和下游基因NRas mRNA的表達量有顯著的增加（圖3-A、B），但TYR mRNA的表達量僅有黑色皮膚來源的黑色素細胞有極顯著的增加，白色皮膚來源的黑色素細胞未發(fā)生明顯的變化（圖3-C）。

圖1 綿羊黑色素細胞的形態(tài)Fig. 1 The morphology of sheep melanocytes

圖2 不同濃度EDN3對細胞增值率的影響Fig. 2 Proliferation of sheep melanocytes induced by different concentrations of EDN3

2.4 Western blot 實驗結(jié)果

通過Western blot方法檢測了1×10-8mol·L-1濃度的EDN3對EDNRB、NRas及TYR 蛋白表達量的影響（圖4-A）。結(jié)果分析顯示：添加EDN3的白色來源細胞內(nèi)EDNRB 蛋白表達量為9.5724±2.1927是正常細胞組的 3.0827倍差異極顯著（P<0.01），NRas蛋白表達量為 2.1856±0.3264是正常細胞組的 1.2936倍差異顯著（P<0.05），TYR蛋白表達量為3.0818± 0.5227是正常細胞組的1.0024倍，未發(fā)生明顯變化。添加EDN3的黑色來源細胞內(nèi)EDNRB 蛋白表達量為12.2360±2.9357是正常細胞組的3.9800倍差異極顯著（P<0.01），NRas蛋白表達量為3.2779±0.2466是正常細胞組的1.3658倍差異顯著（P<0.05），TYR蛋白表達量為5.2662±1.0464是正常細胞組的1.8498倍差異顯著（P<0.05）。EDN3的受體EDNRB和下游基因NRas 的蛋白表達量有顯著的增加（圖4-B、C），但 TYR 的蛋白表達量僅有黑色皮膚來源的黑色素細胞有顯著的增加，白色皮膚來源的黑色素細胞未發(fā)生明顯的變化（圖4-D）。

圖3 EDN3對EDNRB、NRas、TYR mRNA表達量的影響Fig. 3 The relative mRNA expression of the EDNRB, NRas and TYR genes in melanocytes treated by EDN3

圖4 EDNRB、NRas及TYR蛋白表達印跡分析Fig. 4 Western blot analysis of the expression of EDNRB,NRas and TYR protein

3 討論

本試驗通過添加不同濃度的 EDN3，對比黑白來源的黑色素細胞有不同的增值率，顯示白色來源的黑色素細胞在EDN3的刺激下有較高的增值率。同時通過qRT-PCR以及Western Bolt方法對黑色素細胞合成黑色素的相關(guān)基因分析表明EDN3促進黑色來源的黑色素細胞相關(guān)基因和蛋白的表達量顯著增加，對白色來源的黑色素細胞也有一定的促進作用，但與色素合成密切相關(guān)的酪氨酸酶并未產(chǎn)生促進效果。結(jié)果提示，EDN3對兩者細胞均有促進細胞增殖和基因表達的作用，但對白色來源的細胞以促進增殖為主對色素合成并無較大的影響。對黑色來源的色素細胞有明顯促進色素合成的作用。已有的研究表明內(nèi)皮素家族中的EDN2、EDN3對羊、羊駝體外培養(yǎng)的黑色素細胞均有促進增殖及黑色素合成作用[9,16]。動物體內(nèi)轉(zhuǎn)基因過表達 EDN3同樣顯示在EDN3的刺激下，黑色素細胞前體細胞和已分化成熟的黑色素細胞在數(shù)量上均有一定的增多，隨后色素的持續(xù)沉著需要EDN3的維持[17]。貓科動物的研究顯示EDN3對后期表型花紋的形成有促進作用，EDN3從胚胎時期至毛色的形成對黑色素細胞有維持的作用[18]。

轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)的EDN3信號用以維持皮膚黑色素細胞的存在，在毛囊中的黑色素細胞受EDN3受體信號的支持不僅增加細胞數(shù)量還促進酪氨酸酶的表達從而促進其增加色素合成的能力[19]。EDNRA對于EDN1和EDN2有非常高的親和力，但對EDN3的親和力較小; 與此相反，EDNRB對三者都具有相似的高親和力[20-21]。研究發(fā)現(xiàn)紫外線的持續(xù)照射會引起皮膚色素沉著加深，其機制包括紫外線引起角化細胞持續(xù)分泌EDN1、EDN3與EDNRB結(jié)合后加速色素合成[12，22]。EDNRB在綿羊皮膚中是主要參與介導(dǎo)黑色素細胞增殖的受體，并且參與黑色素的生成[23]。EDN1的作用機制是在黑色素合成過程中磷酸化MITF并增加TYR等酶的表達量，在黑色素的轉(zhuǎn)運機制中誘導(dǎo)黑色素細胞向角化細胞轉(zhuǎn)運的黑素小體的增加，這種誘導(dǎo)機制可通過抑制內(nèi)皮素受體的功能禁止[13,24-25]。同時中等濃度的EDN3會產(chǎn)生與EDN1相似的功能及影響。本試驗添加 EDN3體外培養(yǎng)的細胞顯示黑色素細胞合成色素相關(guān)的基因在 EDN3的刺激下表達均有所提高，但白色皮膚來源的黑色素細胞中TYR的表達未發(fā)生變化。這一結(jié)果提示 EDN3發(fā)揮類似EDN1的作用，促進正常色素的合成及轉(zhuǎn)運，但是白色毛發(fā)的形成未有色素顆粒的正常生成，猜測白色皮膚來源的黑色素細胞合成黑色素的過程受到其他基因調(diào)控，致使色素生成的限速酶合成受到限制。據(jù)此可以推測白色綿羊最終毛色表型的形成在色素合成的過程中受到調(diào)控，但是內(nèi)皮素家族對色素細胞的作用僅為色素基因的一部分，在不同年齡不同動物形成白色毛發(fā)的機制可能會存在差異，尚未明確仍需進一步研究。

另有研究顯示體外培養(yǎng)的神經(jīng)嵴細胞在干細胞生長因子和EDN3的共同刺激或僅有EDN3刺激下均可分化發(fā)育為黑色素細胞，單獨由干細胞生長因子刺激分化發(fā)育為未成熟細胞[26-28]。這一結(jié)果提示 EDN3對早期黑色素細胞的形成有至關(guān)重要的作用，本試驗結(jié)果提示EDN3對已成熟的黑色素細胞有促進細胞增殖和色素生成的作用，但對白色來源的黑色素細胞以促進細胞增殖為主。EDN3在不同時期發(fā)揮不同的功能，對不同來源的細胞也會產(chǎn)生不同的作用。不能正常合成黑色素的細胞在EDN3的作用下相關(guān)基因的表達量有所增加，但影響色素合成的主要基因未發(fā)生變化，具體機制仍有待研究。

4 結(jié)論

內(nèi)皮素3可促進白色來源的黑色素細胞增殖但對色素合成的限速酶 TYR未產(chǎn)生促進作用；內(nèi)皮素 3可促進黑色來源的黑色素細胞增殖并可能促進黑色素生成。

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（責(zé)任編輯 林鑒非）

Effect of EDN3 on of Sheep Skin Melanocytes with Different Coat Colors in Vitro

LI YaNan, ZHAO BingLing, WANG HaiDong, CHEN TianZhi, LIU Ying, CHANG LuCheng, DONG ChangSheng
(College of Animal Science and Veterinary Medicine, Taigu 030801, Shanxi)

【Objective】 The objective of this study is to explore the effects of EDN3 in vitro on sheep melanocytes with different coat colors and to find the mechanisms of production of melanin and their differences. 【Method】 Melanocytes from black and white coat colors were cultured in vitro, and MTT assay was used to detect different cell proliferation rates by affected EDN3. After extraction of total RNA and total protein of both cells, the total RNA was reversely transcribed to cDNA, and then the effect of EDN3 on mRNA relative expression of EDNRB, NRas and TYR was analyzed by RT-PCR, and Western blot was performed to ensure whether EDN3 had influence on the protein expression of EDNRB, NRas and TYR. Significant difference was analyzed by using statistical method with software SPSS19.0. 【Result】 MTT assay showed that EDN3 promoted cells proliferation from both black and white coat colors. RT-PCR revealed that compared with the control group, the relative expressions of EDNRB and NRasmRMA in EDN3 group from white coat color were significantly increased by 1.7992 folds and 1.8536 folds respectively (P<0.01), while TRY mRNA had no significant difference. In cells from black coat color, the expressions of EDNRB, NRas and TYR were all induced significantly with multiples of 2.2512, 1.3859 and 15.5710 respectively (P<0.01). The result of Western blot in EDN3 group was consistent with RT-PCR, the EDNRB protein expression from white coat color was 3.0827 times of control group (P<0.01), and the NRas protein expression was 1.2936 fold of control group (P<0.05), while TYR had no change. The protein expressions in cells from black coat color of EDNRB, NRas and TYR were observably added up to 3.9800 time (P<0.01), 1.3658 and 1.8498 times (P<0.05), respectively. 【Conclusion】 EDN3 promoted melanocytes proliferation from both black and white coat colors, while had no effect on TYR which is a rate-limiting enzyme of pigment synthesis in cells from white coat colors, and might play a role in producing melanin in cells isolated from black coat color.

EDN3; sheep; coat color; melanocytes

2016-03-01；接受日期：2017-01-22

國家自然科學(xué)基金（31302049），國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃（“863”計劃，2013AA102506）

聯(lián)系方式：李亞楠，Tel：18404966095；E-mail：18404966095@163.com。趙兵令，Tel：18404981230；E-mail：921695051@qq.com；李亞楠與趙兵令為同等貢獻作者。通信作者董常生，Tel：0354-6288980；E-mail：csdong18@163.com