徐盼菊，孟凡欣，唐萌，馬虹宇，李月和，申斯樂*

黑虎掌菌粗多糖制備及體外抗氧化活性研究

徐盼菊1，2，孟凡欣1，2，唐萌1，2，馬虹宇1，李月和1，申斯樂1，2*

（1.吉林大學(xué)珠海學(xué)院，廣東珠海519041；2.吉林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林長春130012）

以云南和四川黑虎掌菌子實體為原料，熱水浸提黑虎掌菌子實體粗多糖，并采用響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝。結(jié)果表明，云南黑虎掌菌粗多糖（YSP）的最佳提取條件為提取時間3.1 h，提取溫度91℃，水料比60∶1（mL∶g），多糖得率16.75%；四川黑虎掌菌粗多糖（SSP）的最佳提取條件為提取時間3.1 h，提取溫度93℃，水料比58:1（mL:g），多糖得率13.93%。以YSP和SSP為實驗樣品，VC為陽性對照，羥基自由基、DPPH自由基以及超氧陰離子自由基清除率為檢測指標，評價YSP與SSP的體外抗氧化活性。結(jié)果表明：SSP的羥基、DPPH及超氧陰離子自由基最高清除率分別為86.14%、71.78%和99.98%，均高于對應(yīng)的YSP清除率76.54%、58.52%和99.93%，且其超氧陰離子自由基清除率均高于VC，但羥基自由基和DPPH自由基清除率均低于VC。

黑虎掌菌；響應(yīng)面法；粗多糖；抗氧化活性

機體通過酶系統(tǒng)或者非酶系統(tǒng)產(chǎn)生氧自由基，而氧自由基可以攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA），引發(fā)的脂質(zhì)過氧化作用，并形成脂質(zhì)過氧化物，如丙二醛（malondialdehyde，MDA）、酮基、羥基、過氧化物，以及新的氧自由基等。這些脂質(zhì)過氧化物可以引起細胞損傷，引發(fā)各種疾病，包括帕金森氏病和阿爾茨海默氏病等[1-2]?？寡趸瘎p少氧自由基產(chǎn)生已被證明是針對由脂質(zhì)過氧化引發(fā)的細胞損傷的最佳治療手段。然而，如今最常用的抗氧化劑大多是化學(xué)合成的，存在肝損傷以及引發(fā)癌癥的安全隱患[3]。因此，尋找安全高效的抗氧化劑顯得尤為重要。近幾年來，隨著人們對藥用真菌越來越多的關(guān)注與認識，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)藥用真菌具有安全、無副作用，以及多種生物活性，如增強免疫力、抗腫瘤、抗凝血劑、抗炎、抗病毒等特點，是絕佳的調(diào)節(jié)機體、治療疾病的天然藥物[4]。

黑虎掌菌最早發(fā)現(xiàn)于日本，我國首先發(fā)現(xiàn)于云南景東，是一種著名的藥用真菌，且在中國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中，它作為重要的抗腫瘤、抗氧化以及提高免疫力藥物已經(jīng)被普遍應(yīng)用[5-7]。本研究探究了四川與云南兩產(chǎn)地黑虎掌菌粗多糖的提取工藝，主要涉及其提取時間、溫度及不同水料比對其水溶性粗多糖得率的影響，并利用響應(yīng)面法（response surface methodology，RSM）建立水溶性粗多糖得率與相關(guān)提取因素之間的回歸模型，進行提取條件優(yōu)化。此外，對兩產(chǎn)地黑虎掌菌粗多糖體外抗氧化活性進行檢測與比較，包括1,1-二苯-2-苦基肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl hydrazyl，DPPH）自由基、羥基自由基及超氧化物陰離子自由基清除率。研究結(jié)果可為選取黑虎掌菌資源及其體內(nèi)抗氧化、抗腫瘤和增強免疫力研究奠定理論與實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

黑虎掌菌子實體干品：四川和云南市售。

1.1.2 試劑

無水葡萄糖對照品：上海源葉生物科技有限公司；蒽酮（分析純）：上海源葉生物科技有限公司；無水乙醇（分析純）：天津市大茂化學(xué)試劑廠；濃硫酸（分析純）：廣州市東紅化工廠；DPPH：上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

752-P型紫外可見分光光度計：上?，F(xiàn)科儀器有限公司；RE5298A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋：江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；AR224CN型電子天平：奧豪斯儀器（上海）有限公司制造；Boxun型干燥箱：上?；奂娮涌萍加邢薰尽?/p>

1.3 方法

1.3.1 多糖提取純化

（1）熱水浸提

取黑虎掌菌子實體，烘干至質(zhì)量恒定，用粉碎機粉碎（過65目篩），準確稱取0.5 g，按預(yù)先設(shè)定水料比加入蒸餾水，充分溶解混勻，放入恒定溫度的水浴鍋中熱水浸提，到預(yù)定提取時間后，取出冷卻，離心機離心（4 000 r/min，20 min）取上清液。

（2）多糖醇沉

取上述提取上清液，加入3倍體積的無水乙醇溶液，充分振蕩混勻30 min，4℃冰箱靜置過夜，離心去上清，沉淀冷凍干燥，得到粗多糖干品。

1.3.2 多糖含量測定

蒽酮-濃硫酸法測定多糖含量（蒽酮試劑：精密稱取0.1 g蒽酮，加80%濃H2SO4100 mL使溶解，搖勻。當日配制使用）。

（1）葡萄糖標準曲線制作

精密稱取無水葡萄糖對照品10 mg，用蒸餾水定容至10 mL；取7支具塞試管，按15 μg/mL、30 μg/mL、45 μg/mL、60 μg/mL、75 μg/mL、90 μg/mL精密配制一系列不同質(zhì)量濃度的葡萄糖標準溶液，取上述各質(zhì)量濃度溶液2 mL于干燥潔凈試管中，在每支試管中立即加入蒽酮試劑6 mL，振蕩混勻，置于沸水浴中加熱15 min。取出，迅速浸于冰水浴中冷卻15 min。以第1管為空白，在波長625 nm處測定其余各管吸光度值，每個濃度做3個重復(fù)。以標準葡萄糖含量（x）為橫坐標，以吸光度值（y）為縱坐標，繪制葡萄糖標準曲線。

（2）樣品含量測定

精確吸取2 mL樣品多糖溶液置于干燥潔凈試管中，加入蒽酮試劑6 mL，振蕩混勻，置于沸水浴中加熱15 min。取出，迅速浸于冰水浴中冷卻15min，3個重復(fù)取平均值。在波長625 nm處迅速測定各管吸光度值。根據(jù)葡萄糖含量的標準曲線，由樣品溶液吸光度值計算各樣品溶液中糖的質(zhì)量濃度，并計算多糖得率，其計算公式如下：

1.3.3 單因素試驗[8-9]

（1）水料比對多糖得率的影響

利用不同水料比熱水浸提黑虎掌菌粗多糖，水料比取值范圍為20∶1～100∶1（mL∶g），提取溫度為90℃，提取時間2 h，計算黑虎掌菌粗多糖得率。

（2）提取時間對多糖得率的影響

利用不同提取時間熱水浸提黑虎掌菌粗多糖，提取時間（h）取值范圍為1～4 h，提取溫度為90℃，水料比為60∶1（mL∶g），計算黑虎掌菌粗多糖得率。

（3）提取溫度對多糖得率的影響

利用不同的提取溫度熱水浸提黑虎掌菌多糖，提取溫度（℃）取值范圍為60～100℃，水料比為60∶1（mL∶g），提取時間為3 h，計算黑虎掌菌粗多糖得率。

1.3.4 Box-Behnken設(shè)計

利用Design-Expert7.0軟件進行Box-Behnken設(shè)計，通過建立二次多項式模型確定最佳條件和最優(yōu)得率，并進行驗證試驗[10]。

1.3.5 抗氧化活性測定

（1）DPPH自由基清除率測定[11-12]

制備不同質(zhì)量濃度（0.01～0.50g/L）的黑虎掌菌多糖溶液，分別移取各樣品溶液樣品2 mL，再與2 mL 0.1 mmoL/L DPPH溶液混合，振蕩，在溫室下避光放置30 min，然后在波長517nm處測定吸光度值。以維生素C（vitaminC，VC）作為陽性對照，且用無水乙醇調(diào)零。DPPH自由基清除率計算公式如下：

式中：Ac為對照組吸光值，即2 mL蒸餾水加2 mL 0.1mmol/L DPPH溶液；Ai為樣品組吸光值，即2 mL樣品液加2 mL 0.1 mmol/L DPPH溶液；Aj為空白組吸光度值，即2 mL樣品液加2 mL無水乙醇。

（2）羥基自由基清除率測定

采用鄰二氮菲比色法，以VC作為陽性對照。取1 mL 0.75 mmol/L鄰二氮菲的無水乙醇溶液加入2 mL 0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH=7.4）和1mL去離子水。充分混均后加入1 mL 0.75 mmol/L的FeSO4，混勻再加入1 mL0.01%（v/v）的H2O2。37℃水浴1 h后，在波長536 nm處測定其吸光度值為A1。以1 mL去離子水取代損傷管中的H2O2，設(shè)為對照管，重復(fù)上述步驟，測A2。1 mL樣品液代替損傷管中的去離子水，設(shè)為樣品管，測其吸光度值A(chǔ)3。取2 mL0.2 mol/L的磷酸緩沖液（pH=7.4）和1 mL樣品液混合，加入3 mL去離子水，設(shè)為樣品參比，測其吸光度值A(chǔ)4。羥基自由基清除率計算公式如下：

（3）超氧陰離子自由基清除率測定[13-14]

取pH=8.2 0.05 mol/L的Tris-HCl緩沖液4.6 mL于試管中，置25℃水浴預(yù)熱20 min后，加不同濃度（0.01～5 g/L）的樣品液1 mL，10 mmol/L鄰苯三酚0.4 mL，混勻后25℃水浴4 min，立即用濃鹽酸0.1 moL終止反應(yīng)。以pH=8.2的Tris-HCl緩沖液調(diào)零點，并在波長325 nm處測定吸光度值，記為A。用水1mL取代樣品液，設(shè)為模型對照組，測定的吸光度值記為A0。樣品參比組為用0.4 mLTris-HCl緩沖液代替10 mmoL/L鄰苯三酚，測定吸光度值記為A1。超氧陰離子自由基清除率計算公式如下：

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

每個實驗都進行三次重復(fù)，實驗數(shù)據(jù)均以平均值±標準差表示。采用Design-Expert7.0軟件進行數(shù)據(jù)分析、統(tǒng)計及作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標準曲線

葡萄糖標準曲線與標準方程結(jié)果見圖1。

圖1 葡萄糖標準曲線Fig.1 Standard curve of glucose

由圖1可得，葡萄糖標準曲線方程為：y=0.008x+0.0054，其相關(guān)系數(shù)R2=0.9986，且在葡萄糖質(zhì)量濃度為0～90μg/mL范圍內(nèi)二者線性關(guān)系良好。

2.2 單因素試驗

2.2.1 水料比對黑虎掌菌多糖得率的影響

水料比對熱水浸提黑虎掌菌提取多糖得率的影響見圖2。由圖2可知，當水料比由20∶1（mL∶g）增加到60∶1（mL∶g）后，云南黑虎掌菌多糖得率由12.28%增加到13.53%，而四川黑虎掌菌多糖得率由11.18%增加到12.58%，且之后隨著水料比的增加其多糖得率均無明顯變化。因此，確定黑虎掌菌粗多糖得率的最佳水料比為60∶1（mL∶g）。

圖2 水料比對熱水浸提黑虎掌菌粗多糖得率的影響Fig.2 Effect of water to material ratio on crude polysaccharides yield fromS.imbricatus

2.2.2 提取時間對多糖得率的影響

提取時間對熱水浸提黑虎掌菌提取多糖得率的影響見圖3。由圖3可知，當提取時間由1 h增加到3 h后，云南黑虎掌菌多糖得率由12.83%增加到14.33%；四川黑虎掌菌多糖得率由11.23%增加到13.88%，且之后隨著提取時間的增加其黑虎掌菌多糖的得率均減小。因此，黑虎掌菌多糖最佳提取時間為3.0 h。

圖3 提取時間對熱水浸提黑虎掌菌粗多糖得率的影響Fig.3 Effect of extraction time on crude polysaccharides yield fromS.imbricatus

2.2.3 提取溫度對多糖得率的影響

圖4 提取溫度對熱水浸提黑虎掌菌粗多糖得率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on crude polysaccharides yield fromS.imbricatus

提取溫度對熱水浸提黑虎掌菌提取多糖得率的影響見圖4。由圖4可知，當提取溫度由60℃增加到90℃后，云南黑虎掌菌多糖得率由14.33%增加到15.38%；四川黑虎掌菌多糖得率由12.13%增加13.48%，且之后隨著提取溫度的增加其黑虎掌菌多糖的得率均減小。因此，黑虎掌菌多糖最佳提取溫度為90℃。

2.3 Box-Behnken設(shè)計[15-16]

根據(jù)Box-Benhnken的中心組合試驗設(shè)計原理，綜合單因素試驗結(jié)果，提取溫度、提取時間和水料比為熱水浸提黑虎掌菌多糖得率的三個主要影響因素，分別以X1、X2和X3代表，每一個自變量（即3個影響因素）的低、中、高實驗水平分別以-1、0、1進行編碼（結(jié)果見表1）。以黑虎掌菌多糖得率為響應(yīng)值（Y），云南和四川的黑虎掌菌多糖提取試驗方案及結(jié)果分別見表2和表3。

表1 Box-Behnken試驗因素水平及編碼Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments

表2 云南黑虎掌菌粗多糖提取條件優(yōu)化Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiments for YSP extraction conditions optimization

利用軟件Design-Export7.0對表2與表3的試驗結(jié)果進行二次多項回歸擬合，得到黑虎掌菌多糖得率對提取溫度（X1）、提取時間（X2）、水料比（X3）的二次多項回歸模型分別為：

云南黑虎掌菌：Y=+16.82+0.19X1+0.31X2+0.11X3-0.15X1X2-0.27X1X3-0.17X2X3-0.74X12-1.64X22-0.96X32

四川黑虎掌菌：Y=+13.93+0.16X1+0.14X2-0.11X3-0.05X1X2+0.025X1X3-0.037X2X3-0.23X12-0.24X22-0.29X32

2.4 Box-Benhnken試驗方差分析

對不同地區(qū)黑虎掌菌Box-Benhnken試驗的模型進行方差分析，結(jié)果如表4、表5所示。

表4 Box-Behnken設(shè)計云南黑虎掌菌多糖得率方差分析結(jié)果Table 4 Variance analysis results of Box-Behnken experiments for YSP yield

表5 Box-Behnken設(shè)計四川黑虎掌菌多糖得率方差分析結(jié)果Table 5 Variance analysis results of Box-Behnken experiments for SSP yield

由表4、5可知，回歸方差分析顯著性檢驗表明此兩個模型回歸極顯著（P云南=0.001 1＜0.01；P四川=0.003 1＜0.01），其中提取溫度、時間以及溫度與時間之間的交互作用對云南黑虎掌菌粗多糖得率有顯著的影響（P＜0.05）；而對于四川多糖得率，提取溫度、時間以及水料比表現(xiàn)出顯著的影響（P＜0.05），且兩個模型的決定系數(shù)R2云=0.979 1；R2四= 0.968 2，說明該模型與實際試驗擬合較好，自變量與響應(yīng)值之間線性關(guān)系顯著，調(diào)整決定系數(shù)R2adj云=0.941 5；R2adj四= 0.911 1，說明該模型能解釋94.15%云南黑虎掌以及91.11%四川黑虎掌菌響應(yīng)值的變化，擬合程度良好，誤差較小。以上結(jié)果表明，采用響應(yīng)曲面法進行的優(yōu)化試驗所得回歸方程模型可以用來分析預(yù)測虎掌菌多糖提取工藝結(jié)果。

2.4 響應(yīng)曲面分析

各因素交互作用對云南和四川黑虎掌菌多糖得率影響的響應(yīng)面和等高線結(jié)果見圖5和圖6。通過軟件分析，得到云南黑虎掌菌粗多糖提取的最佳條件為時間3.09 h，提取溫度91.12℃，水料比為60.33∶1（mL∶g），且在此條件下云南黑虎掌菌粗多糖得率理論值可達16.85%；四川黑虎掌菌粗多糖提取的最佳條件為時間3.14 h，提取溫度93.11℃，水料比為58.15∶1（mL∶g），在此條件下四川黑虎掌菌粗多糖得率理論值可達13.99%。為驗證此優(yōu)化方案，根據(jù)實際操作條件，選擇云南黑虎掌菌的提取時間為3.1 h，提取溫度為91℃，水料比為60∶1（mL∶g）；四川黑虎掌菌選擇條件為提取時間為3.1 h，提取溫度為93℃，水料比為58∶1（mL∶g）。在各最適條件下，云南黑虎掌菌的多糖得率為16.75%；四川黑虎掌菌為13.93%，因此采用Box-Behneken優(yōu)化得到的水提取云南黑虎掌菌粗多糖條件參數(shù)準確可靠，具有實用價值。

圖5 提取溫度、時間、水料比交互作用對云南黑虎掌菌多糖得率影響的響應(yīng)面和等高線Fig.5 Response surface plots and contour line of effects of interaction between extraction temperature,time,and liquid to solid ratio on YSP yield

圖6 提取溫度、時間、水料比交互作用對四川黑虎掌菌多糖得率影響的響應(yīng)面和等高線Fig.6 Response surface plots and contour line of effects of interaction between extraction temperature,time,and liquid to solid ratio on SSP yield

2.5 抗氧化試驗結(jié)果

不同地區(qū)的黑虎掌菌多糖以及VC對DPPH自由基、超氧陰離子自由基以及羥基自由基的影響見圖7。由圖7可知，黑虎掌菌粗多糖對DPPH自由基、超氧陰離子自由基以及羥基自由基清除率均表現(xiàn)出一種濃度依賴性，并在一定的濃度范圍內(nèi)，隨著濃度的增加，其清除率不斷升高。其中四川黑虎掌菌粗多糖對DPPH自由基、超氧陰離子自由基以及羥基自由基的最高清除率分別為86.14%、71.78%和99.98%，均高于對應(yīng)的同濃度下云南黑虎掌菌多糖的清除率76.54%、58.52%和99.93%，且兩產(chǎn)地粗多糖的羥基自由基最高清除率均高于VC，但是兩產(chǎn)地黑虎掌菌粗多糖的DPPH自由基和超氧陰離子自由基最高清除率均低于VC。

圖7 黑虎掌菌粗多糖/VC對DPPH自由基（A）、羥基自由基（B）及超氧陰離子自由基（C）清除率Fig.7 Scavenging rate ofSarcodon imbricatuscrude polysaccharide and VC on DPPH free radical(A)hydroxyl free radical(B) superoxide anion free radical(C)

3 結(jié)論

本研究采用經(jīng)響應(yīng)面法優(yōu)化黑虎掌菌子實體粗多糖熱水浸提工藝，篩選出一個黑虎掌菌子實體粗多糖得率較高的條件組合，云南粗多糖：提取時間為3.1 h，提取溫度為91℃，水料比為60∶1（mL∶g），經(jīng)驗證試驗得到多糖得率為16.75%；四川粗多糖：提取時間為3.1 h，提取溫度為93℃，水料比為58∶1（mL∶g），經(jīng)驗證試驗得到多糖得率為13.93%。此外，體外抗氧化試驗結(jié)果顯示：黑虎掌菌子實體粗多糖對于DPPH自由基、超氧陰離子自由基和羥基自由基都具有較高的清除活性，是抗氧化劑的一個較好的潛在資源。本項研究為黑虎掌菌子實體多糖體內(nèi)抗氧化活性及抗氧化作用機制的分析研究提供了實驗和理論依據(jù)，是黑虎掌菌子實體粗多糖抗氧化、增強免疫及抗腫瘤活性研究的第一步。

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Preparation of polysaccharides fromSarcodon imbricatusand theirin vitroantioxidant activity

XU Panju1,2,MENG Fanxin1,2,TANG Meng1,2,MA Hongyu1,LI Yuehe1,SHEN Sile1,2*
(1.Zhuhai College,Jilin University,Zhuhai 519041,China;2.College of Life Science,Jilin University,Changchun 130012,China)

YunnanSarcodon imbricatuspolysaccharides(YSP)and SichuanS.imbricatuspolysaccharides(SSP)were extracted from fruit body of S.imbricatus,and the extraction process was optimized by response surface method.The optimum extraction conditions were confirmed as follows: for YSP:extraction time 3.1 h,temperature 91℃,liquid to solid ratio 60∶1(ml∶g),and the polysaccharide yield was 16.75%;For SSP:extraction time 3.1 h,temperature 93℃,liquid to solid ratio 58:1(ml∶g),and the polysaccharides yield was 13.93%.Furthermore,using YSP and SSP as experimental samples,VC as the positive control,thein vitroantioxidant activities of polysaccharides on hydroxyl free radical,DPPH free radical and superoxide anion free radical were investigated.The results showed that the highest scavenging rates of SSP to hydroxyl,DPPH and superoxide anion radicals were 86.14%,71.78%and 99.98%,respectively,which were higher than that of YSP(76.54%,58.52%and 99.93%).The superoxide anion free radical scavenging rate of both polysaccaride were higher than VC,but the DPPH free radical and hydroxyl free radical scavenging rate were lower than VC.

Sarcodon imbricatus;response surface method;crude polysaccharides;antioxidant activity

R284.1

0254-5071（2017）03-0150-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.03.030

2017-01-24

徐盼菊（1990-），女，碩士研究生，研究方向為真菌活性成分藥理活性。

*通訊作者：申斯樂（1963-），女，教授，博士，研究方向為分子與細胞生物學(xué)。