降膽固醇雙歧桿菌BZ11的篩選及其耐受性評(píng)價(jià)

朱啟會(huì)1，何臘平1，2*，張玲1，高冰3，李翠芹4，熊江1

（1.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550025；2.貴州省農(nóng)畜產(chǎn)品貯藏與加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽(yáng)550025；3.湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院，湖北武漢430068；4.貴州大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550025）

采用平板涂布法從貴州特色香豬糞便中篩選具有降膽固醇能力及耐酸、耐膽鹽和耐氧性能的雙歧桿菌（Bifidobacterium）。從香豬糞便中共篩選出19株具有雙歧桿菌形態(tài)特征的菌株。采用鄰苯二甲醛法測(cè)定其降膽固醇率，得到7株降膽固醇能力較高菌株，其中菌株BZ11降膽固醇率最高可達(dá)（38.52±0.60）%，并對(duì)酸、膽鹽和氧具有較高的耐受性。經(jīng)菌落形態(tài)特征、生理生化試驗(yàn)及16S rRNA序列分析，菌株BZ11被鑒定為動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種（Bifidobacterium animalissubsp.lactis）。

雙歧桿菌BZ11；降膽固醇；篩選；鑒定；耐受性

近年來(lái)，隨著人們生活水品的提高，膽固醇及脂肪的攝取量也隨之增加，從而導(dǎo)致心血管疾病的患病率也不斷增加。據(jù)報(bào)道，全世界每年死于該病的人數(shù)約有1 730萬(wàn)，預(yù)計(jì)到2030年死亡人數(shù)將達(dá)到2 360萬(wàn)[1]。而導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病、腦中風(fēng)等心血管疾病發(fā)生的主要原因就是因?yàn)檠逯械哪懝檀己窟^(guò)高[2]。有研究發(fā)現(xiàn)，與含有正常血脂的人相比較，體內(nèi)膽固醇含量過(guò)高的人患有心腦血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)是其含有正常血脂人的3倍。雙歧桿菌（Bifidobacterium）作為人體腸道內(nèi)重要的益生菌，除了能調(diào)節(jié)腸道胃腸道健康、增強(qiáng)免疫應(yīng)答、抑制病原微生物、抗腫瘤等功能外，也有一定的降膽固醇作用[3-4]。

目前，國(guó)內(nèi)已有雙歧桿菌活菌制劑類(lèi)產(chǎn)品，這些雙歧桿菌主要從國(guó)外引進(jìn)，因此有必要開(kāi)發(fā)篩選新的優(yōu)良雙歧桿菌。貴州特色香豬屬于小型豬，在消化系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、營(yíng)養(yǎng)代謝等方面與人類(lèi)極其相似，是篩選人類(lèi)易于接受和利用的益生菌的理想模型動(dòng)物[5]。而且作為人和動(dòng)物選用的益生菌，必須具有耐酸、耐膽鹽等特性，菌種最好來(lái)源于人或動(dòng)物，更有利于菌株在腸道定植[6]。由于雙歧桿菌一般屬于嚴(yán)格厭氧菌，不過(guò)其中有少數(shù)具有耐氧性，而耐氧雙歧桿菌有利于產(chǎn)品的保藏，所以本試驗(yàn)擬用平板涂布法從貴州特色香豬糞便中分離出具有降膽固醇能力且能耐酸、耐膽鹽和耐氧的雙歧桿菌，以期為其在口服益生菌制劑的應(yīng)用方面奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

香豬糞便：來(lái)源于貴州省貴陽(yáng)市花溪區(qū)生態(tài)園的貴州特色1月齡香豬。

培養(yǎng)基：改良的蛋白胨吐溫酵母膏葡萄糖（peptonetween yeast extract glucose，PTYG）培養(yǎng)基[7]；莫匹羅星鋰鹽改良MRS培養(yǎng)基[8]；降膽固醇培養(yǎng)基[9]。

牛膽鹽（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；膽固醇標(biāo)品（≥99%）：美國(guó)Sigma公司；β-半乳糖苷（X-gal，分析純）：北京鼎國(guó)昌盛科技有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-10超凈工作臺(tái)：蘇州凈化有限公司；LS-B75L立式壓力蒸汽滅菌器：江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司；WJ-1851司水套式二氧化碳培養(yǎng)箱：上海三騰儀器有限公司；101-1ASB電熱鼓風(fēng)干燥箱：北京科偉永興儀器有限公司；DW-86L286立式超低溫保存箱：青島海爾特種電器有限公司；CX21SF1奧林巴斯生物顯微鏡：奧林巴斯（中國(guó)）有限公司；TU-1810PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限公司；YQX-T厭氧培養(yǎng)箱：上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；pHS-3C pH計(jì)：成都世紀(jì)方舟科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌株分離

取新鮮香豬糞便10 g，加入90 mL無(wú)菌水中，振蕩搖勻后，用生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)玫?0-2g/mL、10-3g/mL、10-4g/mL稀釋液。分別取各稀釋濃度樣液0.1 mL涂布于莫匹羅星鋰鹽改良MRS培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)2～3 d。挑取在莫匹羅星鋰鹽改良MRS培養(yǎng)基上表面光滑、邊緣完整、乳白色、具有柔軟質(zhì)地的菌落接種到涂有X-gal的PTYG平板上37℃培養(yǎng)1 d，挑取深藍(lán)色菌落于PTYG平板上進(jìn)行純化培養(yǎng)。為篩選到耐氧的雙歧桿菌，若無(wú)特別說(shuō)明，本實(shí)驗(yàn)所有的微生物的培養(yǎng)環(huán)境皆為20%二氧化碳-80%空氣的環(huán)境。

1.3.2 形態(tài)學(xué)鑒定

挑取單菌落進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢。將具有雙歧桿菌典型形態(tài)特征的菌落進(jìn)行傳代培養(yǎng)及菌種保藏并進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.3.3 降膽固醇能力測(cè)定

膽固醇降解能力測(cè)定采用鄰苯二甲醛（o-phthalaldehyde，OPA）法[10]。菌株種子液按3%（V/V）接種于含膽固醇100 μg/mL的MRS液體培養(yǎng)基中，在37℃的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，12 000 r/min離心10 min，取上清液，測(cè)定膽固醇?xì)埩袅俊?/p>

1.3.4 耐酸耐膽鹽試驗(yàn)

耐酸試驗(yàn)：將待測(cè)菌株種子液按5%（V/V）的接種量接種于pH7.0及pH3.0的改良液體培養(yǎng)基中，于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)2 h后，用生理鹽水稀釋后取稀釋液涂布于改良PTYG平板上，在二氧化碳培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)48 h后進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，每個(gè)處理做3個(gè)平行。菌株存活率（N）計(jì)算公式如下：

式中：N1表示pH3.0培養(yǎng)2 h的活菌數(shù)對(duì)數(shù)值，lg（CFU/mL）；N0表示pH7.0培養(yǎng)2 h的活菌數(shù)對(duì)數(shù)值，lg（CFU/mL）。

耐膽鹽試驗(yàn)：將待測(cè)菌株種子液按5%（V/V）的接種量接種于含0.3%（W/V）牛膽鹽和不含牛膽鹽的改良液體培養(yǎng)基中，37℃二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)，且分別在0 h和24 h于改良PTYG平板上進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，每個(gè)處理做3個(gè)平行。

1.3.5 氧耐受性

將待測(cè)菌株種子液涂布于PTYG平板上，分別于普通培養(yǎng)箱和20%CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)24 h后，進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。對(duì)比兩者生長(zhǎng)情況及活菌數(shù)以判斷其耐氧性。每個(gè)處理做3個(gè)平行。

1.3.6 生理生化鑒定

取經(jīng)革蘭氏染色為陽(yáng)性、具有明顯雙歧桿菌特性的菌株，按常規(guī)方法進(jìn)行過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)、糖發(fā)酵試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)[11]，對(duì)菌株做進(jìn)一步鑒定。

1.3.7 16S rRNA分子生物學(xué)鑒定

DNA的提?。翰捎肊zup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒，方法根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)。聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增：引物為27F：AGTTTGATCMTG GCTCAG1492RGGTTACCTTGTTACGACTT，具體試驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)[12]報(bào)道。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳分析后測(cè)序，所得序列在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）中比對(duì)，選取相似性較高的菌株的16S rRNA序列，用MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分離純化及形態(tài)學(xué)鑒定

從香豬糞便中分離得到19株疑似雙歧桿菌菌株。通過(guò)菌落形態(tài)觀(guān)察，篩選出的菌株菌落較小、表面光滑、邊緣整齊、呈乳白色凸起狀。革蘭氏染色為陽(yáng)性，較小，有多種形態(tài)：Y型、V型、L型、短桿狀、彎曲弧狀（圖1），與雙歧桿菌（Bifidobacterium）形態(tài)特征一致[13]。

圖1 菌落形態(tài)（A）和鏡檢（B）結(jié)果Fig.1 Results of colony morphology(A)and microscopy(B)

2.2 降膽固醇試驗(yàn)

將分離得到的菌株進(jìn)行降膽固醇試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，分離得到的菌株對(duì)膽固醇的降解率在7.29%～38.52%之間，其中膽固醇降解率＞20%的菌株有7株，＜10%的有3株，10%～20%之間有9株。不同菌株對(duì)膽固醇的降解率各不相同。宋小娟等[14]利用平板涂布法從牛干巴中篩選降膽固醇乳酸菌，其膽固醇降解率為8%～26%。趙佳銳等[15]篩選得到的雙歧桿菌其膽固醇降解率在7.72%～45.39%之間，有10株菌的膽固醇降解率在30%以上。本試驗(yàn)結(jié)果符合常規(guī)，豐富了雙歧桿菌的菌種資源。但是作為腸道益生菌，還需進(jìn)行耐酸耐膽鹽試驗(yàn)，因此選取膽固醇降解率較高的7株菌（即BZ11、BZ8、BZ12、BZ28、BZ40、BZ44、BZ45）進(jìn)行耐酸耐膽鹽試驗(yàn)，以進(jìn)一步確定其益生特性。

表1 不同菌株的體外膽固醇降解率Table 1 Cholesterol-lowering rate of different strainsin vitro

2.3 耐酸耐膽鹽試驗(yàn)2.3.1耐酸能力

表2 菌株耐酸能力Table 2 Ability of acid tolerance of strains

通過(guò)口服補(bǔ)充益生菌時(shí)，在到達(dá)作用部位前，菌株必然經(jīng)過(guò)胃，并在胃液中短暫停留，而人的胃液呈酸性，pH值為3.0左右，空腹pH值可達(dá)1.5[16]，作為益生菌需要有較強(qiáng)的耐酸能力。試驗(yàn)選取7株降膽固醇能力較高菌株在pH3.0和pH7.0的模擬人工胃液中進(jìn)行耐酸試驗(yàn)，根據(jù)食物在胃液中的停留時(shí)間確定培養(yǎng)時(shí)間為2 h，通過(guò)測(cè)定活菌數(shù)計(jì)算各菌株存活率，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，7株試驗(yàn)菌株在pH3.0條件下培養(yǎng)2h活菌率均在90%以上，表明所篩選的7株菌均具有一定的耐酸能力，其中菌株BZ45存活率最高，為98.70%。

2.3.2 耐膽鹽能力

雙歧桿菌主要定植于腸道，而正常人體的小腸膽汁鹽含量在0.03～0.3 g/kg，因此本試驗(yàn)在培養(yǎng)基中加入0.3%（W/V）牛膽鹽模擬腸液，測(cè)定菌株對(duì)膽鹽的耐受能力，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 菌株在含有0.3%的牛膽鹽培養(yǎng)基和不含膽鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后菌落數(shù)Fig.2 Colony count of strains in medium wit 0.3%bile salt medium and without bile salt medium for 24 h

由圖2可知，菌株BZ11對(duì)膽鹽有一定的耐受能力，在含有0.3%膽鹽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后活菌數(shù)對(duì)數(shù)值為7.81，與不含膽鹽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后活菌數(shù)對(duì)數(shù)值8.43相比仍有92.65%的存活率。這可能是因?yàn)榉蛛x篩選出的菌株均來(lái)自于動(dòng)物腸道，作為腸道內(nèi)的正常菌群，本身就會(huì)具有一定的耐膽鹽能力。但是不同菌株對(duì)膽鹽耐受能力不同，菌株BZ40、BZ28、BZ44在含有0.3%膽鹽的培養(yǎng)基中的活菌數(shù)是在不含膽鹽培養(yǎng)基中活菌數(shù)的82.81%。為挑選出更適于添加到食品中的菌株，需進(jìn)一步測(cè)定菌株的耐氧能力。

2.4 氧耐受性

雙歧桿菌是一種專(zhuān)性厭氧、不產(chǎn)芽孢的革蘭氏陽(yáng)性桿菌[17]。當(dāng)將其作為功能性成分添加到食品中時(shí)，由于周?chē)h(huán)境中氧化壓力的存在，不可避免的會(huì)對(duì)其活菌數(shù)及益生特性產(chǎn)生影響。為判斷所篩選菌株的耐氧性能，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步對(duì)比了所篩菌株在普通培養(yǎng)箱和20%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后其生長(zhǎng)狀況及活菌數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，所分離的菌株都有一定的耐氧能力，不過(guò)菌株BZ11耐氧性能和生長(zhǎng)性能均最好的，結(jié)合菌株的降膽固醇率、耐酸耐膽鹽性能，選擇菌株BZ11作為目標(biāo)菌株，進(jìn)行生理生化特征及分子生物學(xué)鑒定。

表3 菌株耐氧能力Table 3 Ability of oxygen tolerance of strains

2.5 生理生化鑒定

對(duì)菌株BZ11進(jìn)行生理生化鑒定，結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，菌株BZ11吲哚試驗(yàn)為陰性，不產(chǎn)過(guò)氧化氫酶，不產(chǎn)硫化氫，與雙歧桿菌屬的特征相符。結(jié)合菌株形態(tài)特征與國(guó)標(biāo)GB 4789—2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)》及伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)進(jìn)行對(duì)比，表明菌株BZ11被初步鑒定為動(dòng)物雙歧桿菌（Bifidobacterium animalis）。

表4 菌株BZ11的生理生化試驗(yàn)鑒定結(jié)果Table 4 Identification results of physiological and biochemical experiments of strain BZ11

2.6 16S rRNA鑒定

采用瓊脂糖凝膠對(duì)菌株BZ11的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)。將所測(cè)得的16S rRNA基因序列提交到NCBI，通過(guò)Blast工具在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，選取20株同源性較高菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 基于16S rRNA序列菌株BZ11的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of strain BZ11 based on 16S rRNA sequence

由圖3可知，菌株BZ11所在的最大分支中其所包括的菌株均為雙歧桿菌，菌株BZ11的16SrRNA序列與動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種（Bifidobacterium animalissubsp.lactis）AD011以及動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種（Bifidobacterium animalissubsp. lactis）YIT 4121的同源性達(dá)到100%，且屬于同一個(gè)最小分支中，因此菌株BZ11的鑒定結(jié)果為動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種（Bifidobacterium animalissubsp.lactis），并進(jìn)行了專(zhuān)利保藏（保藏號(hào)：CGMCC No.10224）。

3 結(jié)論

本研究采用含有莫匹羅星鋰鹽的MRS培養(yǎng)基和含有X-gal的PTYG培養(yǎng)基，在20%二氧化碳～80%空氣環(huán)境中培養(yǎng)，根據(jù)菌落菌株形態(tài)特征，對(duì)香豬糞便樣品進(jìn)行初篩，然后采用鄰苯二甲醛（OPA）法對(duì)所篩選菌株進(jìn)行降膽固醇試驗(yàn)，選取膽固醇降解率高的菌株。再將降膽固醇性能好的菌株分別進(jìn)行耐酸性、耐膽鹽和耐氧試驗(yàn)，最終從貴州省特色小香豬糞便樣品中分離篩選出一株降膽固醇能力高，耐酸、耐膽鹽和氧耐受好的菌株BZ11，并經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化試驗(yàn)和16SrRNA序列分析，菌株BZ11被鑒定為動(dòng)物雙歧桿菌乳亞種（Bifidobacterium animalissubsp.lactis），豐富了雙歧桿菌的菌種資源，為其在口服益生菌制劑方面的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

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Screening and tolerance evaluation of cholesterol-loweringBifidobacteriumBZ11

ZHU Qihui1,HE Laping1,2*,ZHANG Ling1,GAO Bing3,LI Cuiqin4,XIONG Jiang1
(1.School of Liquor and Food Engineering,Guizhou University,Guiyang 550025,China;2.Key Laboratory of Agricultural and Animal Products Store&Processing of Guizhou Province,Guizhou University,Guiyang 550025,China; 3.College of Bioengineering and Food Science,Hubei University of Technology,Wuhan 430068,China; 4.School of Chemistry and Chemical Engineering,Guizhou University,Guiyang 550025,China)

Bifidobacteriumwith the ability of cholesterol-lowering and the tolerance of acid,cholate and oxygen was screened from Guizhou Xiang pig faeces by spread-plate method.A total of 19 strains were screened.The cholesterol-lowering rate of strains was detected by phthalic aldehyde method,and 7 strains with high cholesterol-lowering ability were obtained.The cholesterol-lowering rate of strain BZ11 was up to(38.52±0.60)%, and the strain had higher tolerance of acid,cholate and oxygen.By colonial morphology,physiological biochemical experiments and 16S rRNA sequence analysis,strain BZ11 was identified asBifidobacterium animalissubsp.lactis.

BifidobacteriumBZ11;cholesterol-lowering;screening;identification;tolerance

TS261.1

0254-5071（2017）03-0054-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.03.012

2016-11-24

國(guó)家自然科學(xué)基金（31160002）；黔科合重大專(zhuān)項(xiàng)字[2015]6004-5號(hào)

朱啟會(huì)（1992-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)榘l(fā)酵工程。

*通訊作者：何臘平（1972-），男，教授，博士，研究方向?yàn)榘l(fā)酵工程、生物催化與生物轉(zhuǎn)化。