石晶萍，黃加秀

（揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司，江蘇 泰州 225321）

動(dòng)態(tài)顯色基質(zhì)法測(cè)定地佐辛注射液中細(xì)菌內(nèi)毒素的含量

石晶萍，黃加秀

（揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司，江蘇 泰州 225321）

目的：采用動(dòng)態(tài)顯色基質(zhì)法測(cè)定地佐辛注射液中的細(xì)菌內(nèi)毒素含量。方法：根據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》（2015年版）四部通則1143細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法，對(duì)樣品進(jìn)行干擾預(yù)實(shí)驗(yàn)和干擾實(shí)驗(yàn)，確定樣品的最小不干擾濃度。結(jié)果：地佐辛注射液可采用稀釋200倍的溶液進(jìn)行定量檢測(cè)。結(jié)論：動(dòng)態(tài)顯色基質(zhì)法可用于檢測(cè)地佐辛注射液中的細(xì)菌內(nèi)毒素含量。

地佐辛注射液；動(dòng)態(tài)顯色基質(zhì)法；細(xì)菌內(nèi)毒素；含量測(cè)定

地佐辛注射液為我公司生產(chǎn)的阿片類受體激動(dòng)-拮抗劑，屬于苯嗎啡烷類衍生物，它是一種起效迅速、能緩解術(shù)后疼痛的強(qiáng)效鎮(zhèn)痛藥物，其鎮(zhèn)痛強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間同嗎啡的效果相當(dāng)，但其成癮性小[1-3]，在臨床中被廣泛應(yīng)用。為了保證其質(zhì)量，避免臨床使用過(guò)程中熱原反應(yīng)的發(fā)生，需嚴(yán)格控制樣品中的細(xì)菌內(nèi)毒素含量，細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法是檢測(cè)供試品中細(xì)菌內(nèi)毒素限量的方法，主要分為凝膠法和光度測(cè)定法，后者包含濁度法和顯色基質(zhì)法[4-5]，本文采用動(dòng)態(tài)顯色基質(zhì)法對(duì)地佐辛注射液細(xì)菌內(nèi)毒素含量檢測(cè)進(jìn)行定量研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品地佐辛注射液，規(guī)格1 mL：5 mg（批號(hào)：14060541、14060641、14060941）以上樣品均由揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司生產(chǎn)。

1.1.2 試劑細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（WSE），效價(jià)80 EU/支（批號(hào)：150601-201681），由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（BET水），50 mL/瓶（批號(hào)：1603310），由湛江安度斯生物有限公司提供。鱟試劑，規(guī)格50-0.005EU/mL，裝量1.25 mL/支（批號(hào)：1412110），由湛江安度斯生物有限公司提供。

1.1.3 儀器LKL064-03型動(dòng)態(tài)試管儀（湛江安度斯生物有限公司），檢測(cè)波長(zhǎng)405 nm；ZH-2型自動(dòng)漩渦混合器（天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠）；FED400烘箱（賓德）。

1.1.4 材料光度法檢測(cè)用反應(yīng)管（規(guī)格：8×75 mm），由湛江安度斯生物有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌內(nèi)毒素限值的確定細(xì)菌內(nèi)毒素限值L ＝K/M，本品為注射劑、說(shuō)明書規(guī)定的臨床最大劑量為20 mg，其K＝5 EU/（kg·h），則M＝20 mg/60（kg·h）；根據(jù)公式計(jì)算限值L＝K/M＝15 EU/mg，企業(yè)出于安全考慮為了更嚴(yán)格控制細(xì)菌內(nèi)毒素，故將地佐辛注射液限值L定為7.5 EU/mg[6]。

1.2.2 鱟試劑靈敏度復(fù)核按《中華人民共和國(guó)藥典》（2015年版）四部附錄細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法[7]鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)項(xiàng)下規(guī)定進(jìn)行，結(jié)果均符合規(guī)定。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性試驗(yàn)取BET水，將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行溶解稀釋，最終得到細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為5.0，0.5，0.05，0.005 EU/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，每稀釋一步均應(yīng)在漩渦混合器上混勻30 s。各取0.1 mL分別加到預(yù)先加有0.1 mL鱟試劑的反應(yīng)管內(nèi)，混合均勻，立即插入LKL064-03型動(dòng)態(tài)試管儀中。溫度為（37±1）℃，每一個(gè)濃度重復(fù)3管，并以BET水作空白對(duì)照。見表1。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性試驗(yàn)結(jié)果

將數(shù)據(jù)進(jìn)行線形回歸分析，得回歸性方程：

平行管的CV均＜10%，空白對(duì)照在規(guī)定檢測(cè)時(shí)間外，相關(guān)系數(shù)∣r∣＝0.999 1＞0.980，故標(biāo)準(zhǔn)曲線可靠。

1.2.4 最小有效稀釋濃度（C）的確定供試品的C計(jì)算方式如下：

式中L為細(xì)菌內(nèi)毒素限值7.5 EU/mg，λ為標(biāo)準(zhǔn)曲線細(xì)菌內(nèi)毒素最低濃度0.005 EU/mL。則得出供試品的C為0.000 667 mg/mL（供試液初始濃度5 mg/mL即最大可稀釋7 500倍）。

1.2.5 干擾試驗(yàn)初篩實(shí)驗(yàn)取供試品一瓶，用BET水分別稀至0.1，0.05，0.025，0.012 5 mg/mL（分別稀釋50，100，200，400倍）作為供試品溶液。同時(shí)進(jìn)行同樣稀釋倍數(shù)的稀釋，其中添加中點(diǎn)濃度即0.5 EU/mL的細(xì)菌內(nèi)毒素對(duì)照品溶液作為供試品陽(yáng)性對(duì)照液。

取上述制備的各溶液0.1 mL至含0.1 mL鱟試劑（50-0.005 EU/mL，用BET水復(fù)溶混合）的光度法檢測(cè)用試管中，每個(gè)濃度重復(fù)2管。進(jìn)行自動(dòng)檢測(cè)。同時(shí)以BET水作為陰性對(duì)照。見表2。

標(biāo)準(zhǔn)曲線：

變異系數(shù)在10%以下，相關(guān)系數(shù)∣r∣＝0.999 1＞0.980；空白對(duì)照在規(guī)定檢測(cè)時(shí)間外；為了今后在日常檢測(cè)中回收率能維持一個(gè)較好的水平，初步選擇稀釋倍數(shù)為200倍、回收率在100%左右的供試液做正式干擾試驗(yàn)。

表2 干擾試驗(yàn)初篩實(shí)驗(yàn)結(jié)果

1.2.6 干擾試驗(yàn)取三批供試品（批號(hào)：14060541，14060641，14060941），分別稀釋至200倍作為供試品溶液（即濃度為0.025 mg/mL）。見表3。

標(biāo)準(zhǔn)曲線：

LgTg＝2.682 5－0.278 2 LgC，

CV均在10%以下，相關(guān)系數(shù)∣r∣＝0.998 7＞0.980，空白對(duì)照在規(guī)定檢測(cè)時(shí)間外；回收率為50%～200%，說(shuō)明供試品在稀釋至200倍（即濃度為0.025 mg/mL時(shí)）下，對(duì)鱟試劑與內(nèi)毒素的反應(yīng)無(wú)干擾。

1.2.7 樣品檢驗(yàn)結(jié)果分別采用上述凝膠法和動(dòng)態(tài)顯色基質(zhì)法對(duì)三批樣品進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素含量測(cè)定。見表4。

表3 三個(gè)不同批次樣品的干擾試驗(yàn)結(jié)果

表4 三批樣品檢測(cè)結(jié)果

上述表格中三批樣品光度法結(jié)果：供試品原液內(nèi)毒素含量＜0.100 0 EU/mL，原液規(guī)格為1 mL∶5 mg，則轉(zhuǎn)換為＜0.2 EU/mg，均符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。說(shuō)明該方法可用于日常監(jiān)測(cè)。

2 討論

細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法是用鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素產(chǎn)生凝聚反應(yīng)的機(jī)制，以判斷供試品中細(xì)菌內(nèi)毒素是否符合規(guī)定的一種方法。該法與熱原法比較具有靈敏度高、重現(xiàn)性好、標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)過(guò)程短，且可完成多批次供試品檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)[8]。動(dòng)態(tài)顯色基質(zhì)法可以測(cè)出產(chǎn)品中細(xì)菌內(nèi)毒素含量[9]，可以更真實(shí)更客觀反應(yīng)藥品的內(nèi)在質(zhì)量。因此可以采用動(dòng)態(tài)顯色基質(zhì)法，監(jiān)控產(chǎn)品中細(xì)菌內(nèi)毒素的具體含量，確保地佐辛注射液制劑的細(xì)菌內(nèi)毒素水平在安全范圍內(nèi)。

[1] 刑剛.地佐辛治療輸尿管結(jié)石性腎絞痛的效果分析[J].臨床醫(yī)學(xué)研究與實(shí)踐,2016,1(15):31-32.

[2] 潘英麗.用地佐辛和曲馬多對(duì)剖宮產(chǎn)術(shù)中出現(xiàn)寒戰(zhàn)癥狀的產(chǎn)婦進(jìn)行治療的效果對(duì)比[J].當(dāng)代醫(yī)藥論叢,2016,14(17):33-34.

[3] 郭鳳林,柴小青.右美托咪定地佐辛單獨(dú)或聯(lián)合用藥對(duì)腔鏡下胃癌根治患者術(shù)后蘇醒期的影響[J].安徽醫(yī)學(xué),2016,37(9):1075-1078.

[4] 彭燕,張玲莉,王宗春.顯色基質(zhì)法檢測(cè)乳酸左氧氟沙星氯化鈉注射液細(xì)菌內(nèi)毒素含量[J].中國(guó)藥師,2013,16(10):1597-1599.

[5] 曾云勝,張玲莉,彭燕.顯色基質(zhì)法檢測(cè)乳酸環(huán)丙沙星氯化鈉注射液的細(xì)菌內(nèi)毒素[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2015,12(18):92-95.

[6] 朱佳麗,段鵬,曹慧,等.動(dòng)態(tài)濁度法定量測(cè)定碘克沙醇中細(xì)菌內(nèi)毒素的含量[J].中國(guó)藥師,2016,19(2):384-387.

[7] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(2015年版)四部[S].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2015:154-157.

[8] 王璐,張紅宇. 劉勤凝膠法和光度法測(cè)定燈盞花素注射液中細(xì)菌內(nèi)毒素的含量[J].昆明醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2010,31(2):39-43.

[9] 馬平,馬國(guó)榮,吳菊壽,等.凝膠法和動(dòng)態(tài)濁度法在b型流感嗜血桿菌結(jié)合疫苗細(xì)菌內(nèi)毒素控制中的應(yīng)用比較[J].中國(guó)醫(yī)藥指南,2013,11(34):17-19.

本文編輯：蘇日力嘎

Determination of Bacterial Endotoxin Content in Dezocine Injection by Kinetic Chromogenic Substrate Method

Shi Jing-ping, Huang Jia-xiu
（Yangtze River Pharmaceutical Group Co., Ltd., Jiansu Taizhou 225321, China）

Objective：To determine the bacterial endotoxin content in dezocine injection by dynamic chromogenic substrate method.Methods：According to the requirements in Bacterial Endotoxin Test in the Chinese Pharmacopoeia (Volume Ⅳ, 2015 edition), pre-interference and interference tests were perforemd to determine the minimum sample concentration without interference.Results：Dezocine injection may be quantitatively determined after being diluted 200 folds.Conclusion：Dynamic chromogenic substrate method may be used for the determination of bacterial endotoxin content in dezocine injection.

Dezocine Injection; Kinetic Chromogenic Substrate Method; Bacterial Endotoxin; Content Determination

R927.12

A

10.3969/j.issn.2096-3327.2017.02.008

2016 - 09 - 25

石晶萍，女，副主任藥師。研究方向：藥品檢驗(yàn)與質(zhì)量管理。通訊作者E-mail：sjp@yangzijiang.com