田鶴　王雅光　閻麗菁

[摘要]目的觀察小鼠腎集合管發(fā)育過程中細胞凋亡與整合素α2的表達，探討小鼠集合管發(fā)育過程中整合素α2及細胞凋亡的作用。方法應(yīng)用免疫組織化學(xué)及灰度值測量、TUNEL染色及細胞凋亡指數(shù)檢測方法對胚齡（E）17、18d及生后日齡（P）1、3、7、14、21、40d的小鼠腎集合管中整合素α2的表達和細胞凋亡情況進行觀察分析。結(jié)果整合素α2于E17d的集合管開始出現(xiàn)，至P7d達到高峰，之后無明顯含量的變化。TUNEL染色顯示細胞凋亡最早出現(xiàn)于Pld的集合管，PTd達到最高峰，之后無明顯變化。結(jié)論整合素α2及細胞凋亡對集合管的發(fā)育過程起一定的作用，整合素α2對細胞凋亡有一定的影響作用。

[關(guān)鍵詞]整合素α2；細胞凋亡；集合管；腎發(fā)育；小鼠

[中圖分類號]R692

[文獻標志碼]A

[文章編號]2095-0616（2016）23-38-03

整合素（integrin）是細胞粘附分子的一種，在腎臟有20余種整合素的表達。整合素α2是一種表達在腎小管和集合管上皮細胞中的整合素，對腎小管上皮細胞的分化及細胞與細胞外基質(zhì)的粘附起一定的作用。細胞凋亡也稱作程序性細胞死亡，是特殊的細胞死亡過程，由基因調(diào)控，發(fā)生機制十分復(fù)雜。發(fā)育生物學(xué)相關(guān)研究證實腎臟等機體器官的發(fā)生發(fā)育過程中包含著細胞凋亡，且有著較為嚴格的時空順序。研究發(fā)現(xiàn)整合素α2能夠促使腫瘤細胞表達凋亡相關(guān)蛋白，整合素相關(guān)的鈣離子的內(nèi)流，磷酸化的發(fā)生等與細胞凋亡的激發(fā)有密切的關(guān)系。目前，關(guān)于腎發(fā)育過程中細胞凋亡與整合素時空性表達的關(guān)系尚未見報道。本研究通過免疫組織化學(xué)、細胞灰度值測量、TUNEL染色和細胞凋亡指數(shù)測定觀察分析整合素α2在小鼠腎臟集合管發(fā)育過程中的表達變化和細胞凋亡情況，探討在腎集合管發(fā)育過程中整合素α2和細胞凋亡的作用及相互關(guān)系。

1.資料和方法

1.1一般資料

2015年6月～2016年6月期間由錦州醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)研究院動物部提供健康的昆明小鼠，2月齡，雌雄各半，體重25～30g。小鼠雌雄1：1同窩飼養(yǎng)，以觀察陰道栓脫落的方式確定雌鼠受孕時間，將陰道栓脫落的最早時間記為胚齡（embryonicdays，E）0d。以觀察到仔鼠出生的最早時間記為生后（postnatal days，P）0d。選取胚齡17、18d的胎鼠和生后1、3、7、14、21、40d的仔鼠，每組5只。兔抗小鼠整合素α2抗體購自Abcam公司，sP免疫組化試劑盒購自福建邁新公司，TUNEL試劑盒購自Sigma公司。

1.2方法

1.2.1標本制備10%水合氯醛（100g/L）麻醉孕鼠，剖腹取胎鼠，胚齡17、18d的胎鼠后壁剖開取全腎，生后1、3、7、14、21、40d的仔鼠取出腎臟后切成小塊固定。腎臟標本放入4%多聚甲醛中固定，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟定向包埋，切5um厚度的切片，用于免疫組織化學(xué)染色和TUNEL染色。

1.2.2免疫組織化學(xué)染色及灰度值測量石蠟切片常規(guī)免疫組織化學(xué)染色檢測整合素α2在不同發(fā)育階段小鼠腎組織集合管中的表達變化，陽性反應(yīng)產(chǎn)物呈棕黃色。用細胞圖像分析系統(tǒng)對陽性反應(yīng)切片進行圖像分析，以灰度值來表示整合素α2蛋白的表達量，灰度值越大表示整合素α2的含量越少，染色越淺。以切片背景色為參照，對集合管進行分析。每個日齡動物選取5個組織塊，每個組織塊選取5張切片，每張切片系統(tǒng)隨機取5個陽性視野，在400倍光鏡下分析。

1.2.3TUNEL染色及細胞凋亡指數(shù)檢測石蠟切片脫蠟至水，滴加蛋白酶K室溫孵育15min，滴加TUNEL混合溶液37℃孵育1h，沖洗，滴加轉(zhuǎn)化劑-POD 37°C孵育30min，沖洗，DAB顯色，鏡下觀察，隨時終止。蘇木精染色細胞核5min，脫水透明，樹膠封片。TUNEL陽性染色定位于細胞核內(nèi)，呈不同程度棕黃色。每一日齡小鼠腎臟標本取5張切片，每張切片隨機選取5個集合管，在細胞圖像分析儀上記數(shù)TUNEL陽性細胞數(shù)量和集合管總細胞數(shù)，計算凋亡指數(shù)AIfApoptosis Index，AI=TUNEL陽性細胞數(shù)/細胞總數(shù)。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理

統(tǒng)計分析用SPSSl9.0軟件完成，計量資料以（x±s）表示，采用t檢驗，計數(shù)資料以百分比表示，采用X²檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1免疫組化染色灰度值測量結(jié)果

對整合素α2免疫組織化學(xué)染色陽性切片進行灰度值測量，經(jīng)過統(tǒng)計分析得到結(jié)果如下：胚齡17d，小鼠腎臟中出現(xiàn)集合管，此時可見整合素α2微弱表達，灰度值較強，隨后，在胚齡18d以及生后1、3、7d的集合管中，整合素α2的表達強度逐漸增強，灰度值逐漸減小。生后7d，整合素α2的表達達到頂峰后，表達量趨于穩(wěn)定。見表1。

2.2TUNEL染色及細胞凋亡指數(shù)檢測結(jié)果

TUNEL染色陽性的細胞為凋亡細胞，計數(shù)小鼠腎集合管中凋亡細胞和總細胞數(shù)，統(tǒng)計凋亡指數(shù)。生后1d，集合管細胞開始出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象，細胞凋亡指數(shù)為（33.46±3.59）%，生后7d凋亡達到高峰，凋

3.討論

細胞凋亡是1972年由Kerr首先提出的一種細胞自我消亡的形式，是基因控制的一種生理性細胞死亡。在一些組織和較為精細器官的發(fā)育過程中，細胞凋亡有控制細胞數(shù)量，去除多余和異常細胞的作用。TUNEL是目前比較常用的檢測細胞凋亡的形態(tài)學(xué)手段，本研究也應(yīng)用TUNEL染色觀察小鼠腎集合管發(fā)育過程中的細胞凋亡情況，并進行了凋亡指數(shù)的計算。結(jié)果顯示，在生后1d小鼠腎臟集合管中可見TUNEL陽性細胞，至生后7d陽性細胞數(shù)量最多，凋亡指數(shù)最高，隨后至生后40d，細胞凋亡無明顯變化。這些結(jié)果說明生后1～7d是集合管發(fā)育的主要階段，盡管此時細胞數(shù)量已夠，但可能還需要通過凋亡來清除因增生而過剩的細胞，凋亡有利于管腔的形成，也可以調(diào)控集合管的發(fā)育速度。生后7～40d，集合管細胞不再分支，進入到發(fā)育完善時期，以生長和成熟為主。

同時本研究也應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法結(jié)合細胞圖像分析技術(shù)觀察了整合素α2在集合管發(fā)育過程中的表達變化，結(jié)果顯示在胚齡17d的剛發(fā)生的集合管中即出現(xiàn)整合素α2的陽性細胞，表達在集合管上皮細胞的胞漿內(nèi)和膜上，至生后7d表達量達到頂峰，隨后表達強度無明顯改變。這些研究結(jié)果表明在小鼠腎集合管發(fā)育過程中，細胞凋亡與整合素α2有一定的相關(guān)性。集合管發(fā)育早期，整合素α2可能影響上皮細胞的分化，影響集合管的分支形態(tài)發(fā)生。生后1～7d是集合管快速發(fā)育的時期，整合素α2也在這一時期有含量上的明顯變化，與細胞凋亡同時在生后7d達到高峰，這表明整合素α2可能介導(dǎo)集合管發(fā)育過程中的細胞凋亡，具體的影響機制還有待于進一步的研究。