張亞芳 何鋼 榮廣天 劉賢桂 倪尚格 張世良

（1. 中南林業(yè)科技大學生命科學與技術學院，長沙 410004；2. 中南林業(yè)科技大學林學院，長沙 410004；3. 廣東常瑞林業(yè)有限公司，廣州 510900）

研究報告

雞血藤愈傷組織培養(yǎng)過程中內(nèi)源激素變化研究

張亞芳1何鋼1榮廣天1劉賢桂2倪尚格3張世良3

（1. 中南林業(yè)科技大學生命科學與技術學院，長沙 410004；2. 中南林業(yè)科技大學林學院，長沙 410004；3. 廣東常瑞林業(yè)有限公司，廣州 510900）

旨在建立密花豆組織培養(yǎng)再生體系并測定其再生過程中內(nèi)源激素的動態(tài)變化。利用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）對密花豆嫩葉愈傷組織誘導與不定芽分化過程中的4種內(nèi)源激素：生長素（IAA）、脫落酸（ABA）、玉米素（ZT）和赤霉素（GA3）的含量進行測定和分析。結(jié)果表明，在愈傷組織的誘導過程中，IAA的含量始終處于較高水平，并在愈傷組織生長最旺時達最大，而ABA、ZT和GA3的含量一直保持在較低水平；IAA/ABA對愈傷組織的誘導與生長有著重要的調(diào)節(jié)作用。在愈傷組織的分化過程中，IAA的含量呈先降后升，并在分化成芽期達到最高，且高于愈傷組織誘導期，介于1.15-1.87 μg/g之間；ZT和ABA的含量均呈先升后降趨勢，而GA3則一直呈上升趨勢；IAA/ABA呈先降后升趨勢，對芽的分化與生長有著重要的促進作用；GA3/ABA和ZT/ABA呈先降后升趨勢，協(xié)同促進雞血藤愈傷組織成功分化出不定芽。內(nèi)源激素對愈傷組織的誘導和分化成芽有著重要的影響，合適的濃度和比例能有效的促進外植體的脫分化與再分化，并協(xié)同促進細胞的分裂、分化和生長。

雞血藤；愈傷組織誘導；分化培養(yǎng)；植物內(nèi)源激素

植物組織培養(yǎng)再生植株是一個非常復雜的生長過程，其常受到多種體內(nèi)和體外影響因子的復合調(diào)控。如培養(yǎng)過程中內(nèi)源激素的種類及其比例關系、酶的種類及其活性變化等均對植物組織培養(yǎng)再生植株起著至關重要的作用［1，2］。在植物再生體系的建立過程中，植物激素的調(diào)控作用非常明顯，這在先前對其他物種的研究中均以得到證實［3-7］。但在藥典品雞血藤（Sopatholobus suberechtus Dunn）［8］的植株再生培養(yǎng)研究中，先前的研究僅局限在培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件的篩選、優(yōu)化等方面，而對雞血藤再生體系建立過程中的生理學變化機理與其形態(tài)建成間關系的研究尚鮮有報道。我們擬通過研究雞血藤再生培養(yǎng)過程中愈傷組織形成和分化過程中不同內(nèi)源激素的含量變化，分析激素變化與雞血藤愈傷組織發(fā)生與分化過程的關系，為雞血藤高效再生培養(yǎng)體系的建立和進一步的遺傳轉(zhuǎn)化奠定基礎。

植物內(nèi)源激素的酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）測定已有許多報道［9-11］，但用于雞血藤愈傷組織中內(nèi)源激素的測定尚屬首次。我們采用酶聯(lián)免疫吸附法對雞血藤愈傷組織發(fā)生過程中生長素（indole-3-Acetic Acid，IAA）、脫落酸（abscisic acid，ABA）、玉米素（zeatin，ZT）和赤霉素（gibberellic acid，GA3）4 種植物內(nèi)源激素進行了分離和測定，探索出一套雞血藤內(nèi)源激素分離和測定的方法，從而為雞血藤組織培養(yǎng)再生植株過程中內(nèi)源激素的研究提供關鍵技術方法。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究以藥典品豆科植物密花豆（Sopatholobus suberechtus Dunn），又稱雞血藤為研究對象。以來源于廣州從化市試驗基地人工栽培的雞血藤嫩葉為外植體，在愈傷組織誘導過程中，挑選嫩葉、愈傷組織誘導時期、愈傷組織分化時期材料，每隔7 d取樣一次，經(jīng)液氮速凍后放入超低溫冰箱（-80℃），保存待用。IAA、ABA、ZT、GA3標準品均購于Sigma 公司；其余試劑均為分析純（國藥集團）；實驗用水為超純水。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基與培養(yǎng)方法 愈傷組織誘導：以MS為基本培養(yǎng)基，外源激素為添加NAA 0.50 mg/L、6-BA 0.9 mg/L和KT 0.2 mg/L，另外添加0.1 g/L 維生素C、30 g/L 蔗糖和8 g/L瓊脂，pH5.8；愈傷組織分化：以MS為基本培養(yǎng)基，外源激素為添加NAA 0.4 mg/L、6-BA 2.5 mg/L和GA31.0 mg/L，另外添加8 g/L 瓊脂和 30 g/L 蔗糖，pH5.8；培養(yǎng)條件為：溫度23±2℃，光照強度1 000-1 200 Lx，光照與黑暗培養(yǎng)時間各12 h。每批次接種30瓶，每瓶接種 5塊外植體。

1.2.2 樣品中內(nèi)源激素提取［10-13］（1）提?。簻蚀_稱取樣品材料 0.5-1.0 g，加入2 mL提取液（80%甲醇溶液，內(nèi)含1 mol/L的二叔丁基對甲苯酚），在液氮中研成粉末，轉(zhuǎn)入10 mL試管，再用2 mL提取液分次將研缽沖洗干凈，一并轉(zhuǎn)入試管中，混勻后密封置4℃條件下浸提4 h，后3 500 r/min離心8 min，取上清液，剩余沉淀加1 mL提取液混勻，于4℃條件下再提取1 h后離心并合并上清液。（2）萃?。簩⑸锨逡哼^C-18固相萃取柱。具體步驟是：1 mL 80%甲醇→上樣→收集樣品→移開樣品后用100%甲醇（5 mL）洗柱→100%乙醚（5 mL）洗柱→100%甲醇（5 mL）洗注→循環(huán)。（3）真空干燥：將過柱后的樣品轉(zhuǎn)入5 mL離心管中經(jīng)真空干燥除去提取液中甲醇，用樣品稀釋液定容至1 mL，充分混勻后4℃離心，得上清液即為內(nèi)源激素提取液。

1.2.3 樣品中內(nèi)源激素含量測定 激素測定采用間接酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）［10-13］，酶聯(lián)免疫試劑盒和96孔板由中國農(nóng)業(yè)大學作物化學控制實驗室提供。具體操作步驟按說明書進行。

1.2.4 結(jié)果計算 以最常用的Logit曲線來計算ELISA結(jié)果。Logit值的計算公式如下：

其中，B0為0 μg/L孔的顯色值，B為其他濃度的顯色值。 測定樣品根據(jù)其logit值可從圖上找出其濃度所對應的自然對數(shù)，經(jīng)反對數(shù)即得其激素濃度（μg/L）。進一步將樣品中的激素濃度換算成激素含量（A，μg/g·fw）［12］。具體換算公式為：

式中，V2為提取樣品上清液總體積；V1為經(jīng)氮氣吹干后上清液體積；V3為吹干后樣品經(jīng)稀釋液定容后體積；W為樣品鮮重；N為樣品中激素濃度（μg/L）；B為樣品稀釋倍數(shù)。

所有實驗及結(jié)果測定均按生物學重復進行3次。所得實驗數(shù)據(jù)采用 Excel和SPSS數(shù)據(jù)分析軟件進行處理、繪圖并進行方差及相關性分析。

2 結(jié)果

2.1 雞血藤愈傷組織誘導過程中內(nèi)源激素的動態(tài)變化

為了研究雞血藤愈傷組織誘導與培養(yǎng)過程中內(nèi)源激素的變化特性，接種后每7 d取一次樣，約14 d后雞血藤嫩葉開始形成愈傷組織，21-28 d時愈傷組織生長處于最旺盛階段，并繼續(xù)培養(yǎng)到35 d時進行繼代培養(yǎng)，采樣測定各樣品中內(nèi)源激素含量。

結(jié)果（圖1）表明，嫩葉中的IAA水平相對較高，為1.14 μg/g，ABA含量較小，僅為0.117 μg/g，ZT和GA3的含量介于二者之間。在愈傷組織的誘導過程中，IAA的含量始終處于較高的水平，介于0.715-1.62 μg/g之間，并在愈傷組織生長最旺盛的時候（28 d）達到最大；ABA的含量一直處于最低水平，且在誘導過程中含量無明顯變化；ZT含量呈現(xiàn)先降后升，在14 d時達到最低；GA3含量在誘導過程中呈先降后升再降的趨勢。

圖1 愈傷組織誘導過程中4種內(nèi)源激素含量動態(tài)變化

同時，對4種內(nèi)源激素含量間的比例關系進行了分析。從圖2可得出，IAA/ABA愈傷組織的誘導中浮動明顯，表現(xiàn)為先降后升再降。在0-14 d呈下降，在14-28 d間表現(xiàn)為上升，28 d后又呈現(xiàn)下降。可見IAA/ABA的比值在愈傷組織的誘導與生長中起著重要的調(diào)節(jié)作用。IAA/ZT、IAA/GA3和ZT/ABA也呈現(xiàn)先降后升的變化趨勢，但變化不明顯。而GA3/ABA和GA3/ZT則在整個誘導過程中均表現(xiàn)為相對穩(wěn)定。各激素及其間的比例關系共同調(diào)節(jié)著雞血藤愈傷組織的生成。

圖2 雞血藤愈傷組織誘導過程中內(nèi)源激素間比例變化

2.2 雞血藤愈傷組織分化過程中內(nèi)源激素的動態(tài)變化

對愈傷組織分化培養(yǎng)過程中生長情況良好的分化組織進行跟蹤與測定，對0、7、14、21、28、35和42 d的分化苗分別取樣測定IAA、ABA、ZT和GA3四種內(nèi)源激素的含量，通過比較和判斷得出雞血藤愈傷組織分化成苗過程中內(nèi)源激素之間的關系。

測定結(jié)果如圖3，IAA含量在分化培養(yǎng)過程中表現(xiàn)為先降后升，含量介于1.15-1.87 μg/g之間，在0-21 d內(nèi)呈下降趨勢，在21 d后快速上升，推斷得出在分化初期的不定芽誘導階段，機體所需的IAA量不高，但在不定芽的生長階段則需要較多的IAA來促進芽的生長。

ABA在分化培養(yǎng)過程中表現(xiàn)為先升后降，但總的含量相對處于較低水平，含量在0.152-0.503 μg/g之間，在分化培養(yǎng)初期至14 d時含量最高，可見ABA對不定芽的誘導起著極為重要的作用。

ZT在愈傷組織的分化培養(yǎng)過程中表現(xiàn)為先升后降趨勢，含量的變化范圍在0.651-1.12 μg/g之間。在0-28 d之間，呈現(xiàn)不斷上升，而在后期（28 d后）處于不定芽的生長階段，ZT含量出現(xiàn)了較明顯的下降?？梢婋u血藤在愈傷組織誘導過程中ZT含量較低，而在分化培養(yǎng)階段，尤其是在不定芽的誘導中所需要的含量較高，這可能是導致ZT含量在分化培養(yǎng)前期出現(xiàn)明顯上升的主要原因。

圖3 愈傷組織分化不定芽過程中內(nèi)源激素的動態(tài)變化

GA3在愈傷組織分化培養(yǎng)過程中一直表現(xiàn)為相對平穩(wěn)的上升趨勢，含量從0.548 μg/g上升到1.03 μg/g?？梢?，GA3的含量在愈傷組織誘導階段的含量很低，而在分化不定芽的培養(yǎng)中所需的GA3的含量較高，尤其是不定芽的生成后，芽體的生長需要一定量的GA3。

同時，對4種內(nèi)源激素含量間的比例關系進行了分析。從圖4可知，IAA/ABA愈傷組織的分化培養(yǎng)中有很大的波動，在0-14 d明顯下降，在14-21 d間無明顯變化，21 d后呈現(xiàn)大幅上升?？梢奍AA/ ABA的比值對芽的分化與生長有著重要的促進作用。GA3/ABA和ZT/ABA也均呈先下降后上升的變化趨勢，且在14 d時達到最低，而IAA/GA3、IAA/ZT和 GA3/ZT則在整個分化培養(yǎng)過程中均呈現(xiàn)出一個相對平穩(wěn)的態(tài)勢，協(xié)同促進雞血藤愈傷組織成功分化出不定芽。

圖4 愈傷組織分化不定芽培養(yǎng)過程中4種內(nèi)源激素含量間的比例變化

3 討論

在雞血藤愈傷組織的培養(yǎng)過程中，IAA的含量始終高于其他3種內(nèi)源激素，并在愈傷組織生長最旺時和分化成芽期達到最大。ABA的含量在愈傷組織誘導階段始終保持最低水平，但在分化培養(yǎng)階段呈現(xiàn)明顯的先升后降趨勢，表明ABA含量的升高對愈傷組織的分化有明顯的促進作用，這與盛艷萍等［14］的研究結(jié)果基本一致。ZT和GA3的含量在愈傷組織誘導時期保持在相對較低水平，而在分化培養(yǎng)階段均呈現(xiàn)明顯的上升，表明較高濃度的ZT和GA3有利于愈傷組織的分化。

IAA/ABA比值在愈傷組織的誘導階段要高于分化培養(yǎng)階段，說明高IAA/ABA比值有利于愈傷組織的誘導，而低IAA/ABA比值則更能有效促進愈傷組織的分化成芽，馬怡迪等［15］研究者們也得出過類似的結(jié)論。IAA/ZT和IAA/GA3比值在愈傷組織的形成階段要高于分化成芽階段，說明高IAA/ZT和IAA/GA3比值能促進愈傷組織的形成，低IAA/ZT和IAA/GA3則更適合愈傷組織的分化。GA3/ABA比值在誘導階段保持相對穩(wěn)定，但在分化階段則稱先降后升趨勢，且低GA3/ABA比值更有利于不定芽的形成。GA3/ZT在整個培養(yǎng)過程中整體表現(xiàn)為相對穩(wěn)定的水平，只是在愈傷組織的誘導階段比分化培養(yǎng)階段略高。ZT/ABA在愈傷組織誘導階段表現(xiàn)為先降后升并趨于穩(wěn)定，而在分化培養(yǎng)階段則呈先降后升趨勢，且在分化培養(yǎng)階段下降更為明顯，表明低ZT/ABA更有利于愈傷組織分化不定芽。在后續(xù)的研究工作中，將進一步對雞血藤愈傷組織誘導與不定芽分化過程中外源激素與內(nèi)源激素間的作用關系進行深入探究。

4 結(jié)論

測定了雞血藤愈傷組織誘導與不定芽分化過程中IAA、ABA、ZT和GA3這4 種內(nèi)源激素的動態(tài)變化，得出適宜的內(nèi)源激素濃度及其比例關系對外植體的脫分化與再分化有著明顯調(diào)節(jié)作用，協(xié)同促進細胞的分裂、分化和生長。

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（責任編輯 狄艷紅）

Changes of Endogenous Hormones During the Culture of Callus from Sopatholobus suberechtus

ZHANG Ya-fang1HE Gang1RONG Guang-tian1LIU Xian-gui2NI Shang-ge3ZHANG Shi-liang3
（1. College of Life Science and Technology/Central South University of Forestry and Technology，Changsha 410004；2. College of Forestry/ Central South University of Forestry and Technology，Changsha 410004；3.Guangdong Changrui Forestry Co. Ltd.，Guangzhou 510900）

This work is to establish a regenerative system of Sopatholobus suberechtus tissue and determine the dynamic changes of endogenous hormones during the regeneration process. The enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）was used to determine and analyze the dynamic changes of four endogenous hormones（IAA，ABA，ZT，and GA3）contents during the callus induction and differentiation. As results，the content of IAA always kept at a high level and reached maximum when the callus growth was the most exuberant in the process of callus induction；while the contents of ABA，ZT and GA3steadily remained at low levels；and IAA/ABA presented an important regulatory role on callus induction and growth. Further，the content of IAA decreased at first and rose then，reached the highest with 1.15-1.87 μg/g while differentiated to bud，and higher than that in callus induction period. ZT and ABA showed rising trend at first and then down later，while GA3tended to rise continuously. Also IAA/ABA decreased at first and rose then，playing an important role in promoting bud differentiation and growth. GA3/ABA and ZT/ABA decreased at first and rose then，and promoted the successful differentiation of callus tissue to the adventitious bud in synergistic effects. In conclusion，the four kinds of endogenous hormones have important influences on callus induction and adventitious bud differentiation，the appropriate concentration and ratio of them may effectively promote the explants dedifferentiation and re-differentiation，and they synergistically promote cell division，differentiation and growth.

Sopatholobus suberechtus Dunn；callus induction；differentiation culture；plant endogenous hormones

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.03.010

2016-07-05

國家林業(yè)公益性行業(yè)科技專項（201304807）

張亞芳，女，碩士，研究方向：生物化學與分子生物學；E-mail：3496219103@qq.com

何鋼，男，教授，碩士生導師，研究方向：林業(yè)生物技術；E-mail：hegang262@163.com