嚴(yán)玉萍 鐘晰 王雪峰

（西南大學(xué)柑桔研究所 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所 國(guó)家柑桔工程技術(shù)研究中心，重慶 400712）

黃單胞菌屬細(xì)菌非編碼小RNA的研究進(jìn)展

嚴(yán)玉萍 鐘晰 王雪峰

（西南大學(xué)柑桔研究所 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所 國(guó)家柑桔工程技術(shù)研究中心，重慶 400712）

黃單胞菌屬（Xanthomonas）是一類能引起多種單子葉和雙子葉植物感病的革蘭氏陰性細(xì)菌，嚴(yán)重危害水稻、甘藍(lán)、番茄、柑橘等多種作物，其入侵和增殖依賴于三型分泌系統(tǒng)（Type III Secretion System，T3SS）和其他毒素因子。細(xì)菌非編碼小RNA能通過與靶mRNA互作，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)，或直接與蛋白互作，影響細(xì)胞的各種生理功能。主要介紹了細(xì)菌非編碼小RNA的分類、及其對(duì)細(xì)菌蛋白調(diào)節(jié)、生長(zhǎng)代謝、基因轉(zhuǎn)錄以及毒力調(diào)控等方面的研究進(jìn)展，并重點(diǎn)對(duì)黃單胞菌屬細(xì)菌已鑒定的非編碼小RNA及其生物學(xué)功能進(jìn)行綜述，以期為黃單胞菌引起的作物病害防控提供新的思路。

黃單胞菌；非編碼小RNA；蛋白調(diào)節(jié)；生長(zhǎng)代謝；毒力調(diào)控

細(xì)菌的非編碼小RNA（small non-coding RNA，sRNA），其長(zhǎng)度通常在50-500個(gè)核苷酸之間，由于缺乏編碼蛋白的開放閱讀框（open reading frame，ORF），故在基因組中只被轉(zhuǎn)錄而不編碼蛋白質(zhì)［1］。大部分sRNA位于兩個(gè)編碼蛋白的基因之間，這類sRNA的轉(zhuǎn)錄起始于一段能折疊成穩(wěn)定莖環(huán)結(jié)構(gòu)的序列，終止于不依賴Rho因子的轉(zhuǎn)錄終止子，由于莖環(huán)結(jié)構(gòu)的存在，sRNA相對(duì)比較穩(wěn)定；還有少數(shù)幾個(gè)sRNA是從mRNA的5'或3'非翻譯區(qū)（untranslated region，UTR）剪切而來［2，3］。細(xì)菌sRNA已被證明是眾多調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的重要組成部分，尤其在細(xì)菌轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控中發(fā)揮重要作用，其分類鑒定、作用機(jī)制以及對(duì)細(xì)菌毒力調(diào)控已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)［4，5］。

黃單胞菌屬細(xì)菌屬于薄壁菌門、變形綱中γ-亞綱、假單胞菌科。菌體單端極生鞭毛，直桿狀，專性好氧，能產(chǎn)生一種不溶于水的黃色素，屬于革蘭氏陰性細(xì)菌。第八版的伯杰氏手冊(cè)將黃單胞菌屬分為6個(gè)種，其中的大部分成員都是植物病原菌，能引起如十字花科黑腐病、水稻白葉枯病、水稻條斑病和柑橘潰瘍病等［6，7］。統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，黃單胞菌中的140個(gè)致病變種至少能引起124種單子葉植物和268種雙子葉植物發(fā)病，作為重要的模式病原菌，一直是科學(xué)家們重要的研究對(duì)象［8，9］。近十幾年來，隨著測(cè)序技術(shù)的革新，黃單胞菌的sRNA逐漸被鑒定和研究，本文重點(diǎn)就細(xì)菌sRNA的分類、生物學(xué)功能以及黃單胞菌中已知sRNA參與的生物學(xué)功能進(jìn)行綜述，以期為黃單胞菌引起的作物病害防控提供新的思路。

1 細(xì)菌sRNA的研究進(jìn)展

1.1 細(xì)菌sRNA的分類

根據(jù)生物學(xué)功能及作用機(jī)制可將sRNA分為3類［10-12］：（1）具有持家功能的sRNA，如核糖核酸酶P RNA（RNase P RNA）、轉(zhuǎn)移-信使RNA（transfer-messenger RNA，tmRNA）、4.5S RNA，該類sRNA有的具有催化功能，有的作為其他蛋白的一部分參與代謝調(diào)控［13］。（2）與目標(biāo)mRNA互作調(diào)控基因表達(dá)的sRNA；這類sRNA與mRNA通過堿基互補(bǔ)配對(duì)調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，這種作用機(jī)制的sRNA可分為兩類：順式—編碼的反義sRNA和反式—編碼的反義sRNA［14，15］，前者與mRNA形成完全的互補(bǔ)配對(duì)，抑制靶mRNA翻譯起始或者結(jié)合在靶標(biāo)mRNA的3'端，起到穩(wěn)定靶標(biāo)mRNA的作用［16］；后者與mRNA的5' UTR不完全配對(duì)，影響靶標(biāo)基因的表達(dá)［17，18］。反式—編碼的反義sRNA在伴侶蛋白Hfq（host factor required for phage Qβ RNA replication）的協(xié)助下促進(jìn)其與其靶標(biāo)mRNA互補(bǔ)配對(duì)，調(diào)節(jié)靶標(biāo)基因的翻譯或穩(wěn)定性［19］。（3）與蛋白質(zhì)相互作用影響蛋白質(zhì)功能的sRNA，如6S RNA、CsrB［20，21］。另外，也有研究發(fā)現(xiàn)SgrS和RNAIII具有sRNA和mRNA兩種功能［22，23］。

1.2 細(xì)菌sRNA的功能

1.2.1 細(xì)菌sRNA在蛋白調(diào)節(jié)中的作用

1.2.1.1 調(diào)控外膜蛋白的表達(dá) 革蘭氏陰性細(xì)菌的外膜蛋白（outer membrane proteins，OMP）是寄主與病原物互作的關(guān)鍵因子，sRNA通過與mRNA互作調(diào)控OMP的表達(dá)，進(jìn)而影響病原菌的黏附、浸染和毒素分泌［24，25］。大腸桿菌（Escherichia coli）中的MicC sRNA能與Omp C的mRNA結(jié)合，抑制其mRNA翻譯，控制Omp C的表達(dá)［26］；沙門菌屬（Salmonella）中，高度保守的InvR sRNA在RNA伴侶蛋白Hfq的作用下，抑制外膜孔蛋白Omp D的合成，幫助T3SS錨定在膜上［27，28］。

1.2.1.2 調(diào)節(jié)蛋白活性 1967年，6S RNA在大腸桿菌中作為一類特殊sRNA被發(fā)現(xiàn)，它能夠與σ70-RNA聚合酶相互作用并改變?cè)摼酆厦笇?duì)啟動(dòng)子識(shí)別的特異性［29］。CsrB家族的sRNA CsrB和CsrC能與轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子CsrA蛋白互作形成拮抗反饋通路，并調(diào)節(jié)該蛋白的活性［21，30，31］。

1.2.2 sRNA調(diào)節(jié)細(xì)菌代謝 研究發(fā)現(xiàn)，sRNA能調(diào)節(jié)細(xì)菌的糖代謝和鐵代謝，從而使細(xì)菌能更好的適應(yīng)外界環(huán)境。大腸桿菌中當(dāng)外界葡萄糖含量增高時(shí)，體內(nèi)的sRNA SgrS能負(fù)調(diào)控運(yùn)輸葡萄糖載體ptsG的mRNA的翻譯，最終使得胞內(nèi)葡萄糖含量恢復(fù)正常水平［32，33］。大腸桿菌中鐵代謝同時(shí)受到鐵吸收調(diào)節(jié)蛋白（ferric uptake regulator，F(xiàn)ur）和sRNA RyhB的調(diào)控，在兩者的協(xié)同調(diào)控下，使細(xì)胞內(nèi)Fe2+維持正常水平［34，35］。

1.2.3 細(xì)菌sRNA調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄關(guān)鍵因子 細(xì)菌轉(zhuǎn)錄因子的編碼基因rpoS在遇到生存壓力時(shí)可轉(zhuǎn)錄出大量應(yīng)答基因，作出應(yīng)激反應(yīng)，從而適應(yīng)環(huán)境變化［36，37］。目前發(fā)現(xiàn)有4種sRNA（DsrA、RprA、ArcZ和OxyS）能與rpoS基因的mRNA堿基互補(bǔ)配對(duì)，參與rpoS的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控過程［38］，DsrA、RprA和ArcZ能夠激活RNA聚合酶σ因子（RNA polymerase sigma factor，RpoS）的翻譯，而OxyS則抑制其表達(dá)［39，40］。

1.2.4 細(xì)菌sRNA在毒力調(diào)控中的作用 sRNA能調(diào)控病原菌毒力基因的表達(dá)。RNAIII可作為mRNA翻譯溶血素蛋白，同時(shí)也是發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)在金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的致病性方面具有調(diào)控功能的sRNA［41］。金黃色葡萄球菌A蛋白（staphylococal protein A，Spa）和α溶血素是該菌中重要的毒素因子，Spa是細(xì)胞壁抗原的主要成分，能刺激抗體的產(chǎn)生，它與金黃色葡萄球菌的抗吞噬作用有關(guān)［42］；α溶血素是對(duì)人類致病起主要作用的溶血素，它能攻擊血紅細(xì)胞，破壞細(xì)胞膜，使細(xì)胞裂解。Spa和α溶血素都受到RNAIII的調(diào)控，并影響該菌的毒性。

2 黃單胞菌sRNA研究進(jìn)展

黃單胞菌屬的細(xì)菌大多數(shù)屬于植物病原菌，作為模式病原物，主要研究集中在：引起辣椒-番茄細(xì)菌性瘡痂病的瘡痂病病原菌（Xanthomonas euvesicatoria、X. vesicatoria、X. perforans和 X. gardneri）、引起水稻細(xì)菌性條斑病的水稻細(xì)菌性條斑病菌（X. oryzae pv. Oryzicola、Xooc）、引起水稻白葉枯病的水稻白葉枯病菌（X. oryzae pv. Oryzae、Xoo）、引起十字花科植物病害的十字花科黑腐病菌（X. campestris pv. Campestris、Xcc）、引起柑橘潰瘍病的柑橘潰瘍病菌（X. citri subsp. Citri、Xcc）［43］等。

黃單胞菌屬的病原菌依賴T3SS使植物發(fā)病，該分泌系統(tǒng)由hrp基因簇編碼，該基因簇包括兩部分：一部分由hrpX和hrpG組成；另一部分包含23個(gè)基因簇，是黃單胞菌入侵寄主的關(guān)鍵通道［44，45］。隨著深度測(cè)序技術(shù)的不斷進(jìn)步，人們對(duì)黃單胞菌中sRNA的認(rèn)識(shí)也逐漸深入。目前，對(duì)于辣椒-番茄細(xì)菌性瘡痂病菌、水稻白葉枯病菌及十字花科黑腐病菌3個(gè)致病種的黃單胞菌屬的sRNA研究較多［46］，發(fā)現(xiàn)部分sRNA與黃單胞菌的致病性相關(guān)，且受HrpG和HrpX蛋白調(diào)控。

這兩點(diǎn)，在我后來的導(dǎo)演闡述里明確地告訴大家了。有了這兩點(diǎn)作為藝術(shù)原則，我們就開始進(jìn)入藝術(shù)創(chuàng)作了，從文本的切磋、修改，到聲腔、音樂、舞美、燈光、服裝以及演員的表演等各方面，都統(tǒng)一在這兩個(gè)藝術(shù)原則的要求之下去進(jìn)入再創(chuàng)造。

2.1 辣椒-番茄細(xì)菌性瘡痂病菌（Xcv85-10）中的sRNA

除了細(xì)菌中廣泛存在的tRNA和rRNA，2010年Findeiss等［47］在Xcv85-10菌株中發(fā)現(xiàn)和報(bào)道了質(zhì)粒轉(zhuǎn)運(yùn)反義RNA（plasmid transferred anti-sense RNA，PtaRNA1），2011年其利用dRNA-seq和Northern blot在Xcv85-10中鑒定出23個(gè)sRNA［48］，包括16個(gè)基因間隔區(qū)的sRNA即sX1-15和6S，7個(gè)順式—編碼反義RNA，即asX1-7，如表1。

表1 Xcv85-10中的24個(gè)sRNA及其功能［47-49］

I型毒素-抗毒素系統(tǒng)（toxin-antitoxin system，TA）中毒素是蛋白，抗毒素為反義RNA，是由編碼毒素的基因反向轉(zhuǎn)錄而來。在Xcv85-10菌株中發(fā)現(xiàn)Xcv2162/ptaRNA1屬于I型TA，Xcv2162在跨膜區(qū)域編碼小蛋白，并具有毒素典型特征；PtaRNA1作為抗毒素，Xcv2162/ptaRNA1兩者在細(xì)胞中協(xié)同發(fā)揮作用，以保持細(xì)胞能更好的適應(yīng)外界環(huán)境以及維持代謝平衡。PtaRNA1具有70個(gè)核苷酸，是Xcv85-10菌株中組成型表達(dá)sRNA，由5'莖環(huán)結(jié)構(gòu)以及長(zhǎng)的3'發(fā)卡結(jié)構(gòu)構(gòu)成其二級(jí)結(jié)構(gòu)，具有水平基因轉(zhuǎn)移（horizontal gene transfer，HGT）特征，以質(zhì)粒為載體，通過頻繁的橫向轉(zhuǎn)移擴(kuò)散［47］。該類sRNA的發(fā)現(xiàn)豐富了sRNA種類、對(duì)sRNA有了更深的認(rèn)識(shí)。

sX13長(zhǎng)度為115個(gè)核苷酸，存在于基因間隔區(qū)，同源性分析發(fā)現(xiàn)，該sRNA僅存在于黃單胞科，且具有高度保守性。功能研究發(fā)現(xiàn)，在溫度、鹽離子濃度驟變的情況下，sX13能大量積累，以適應(yīng)不同的環(huán)境。缺失sX13的菌株在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)緩慢，hrp基因的表達(dá)降低，這影響了細(xì)菌的T3SS中蛋白的活性，進(jìn)而使得突變株發(fā)病遲緩?；蛐酒治鲞€表明sX13能調(diào)控63個(gè)基因，包括信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、運(yùn)動(dòng)、轉(zhuǎn)錄與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控以及毒力基因的表達(dá)，其功能的發(fā)揮不依賴Hfq蛋白［49］。

另外，sX3和asX5為辣椒-番茄細(xì)菌性瘡痂病菌特有，sX6有341個(gè)核苷酸能編碼80個(gè)氨基酸。sX12具有78個(gè)核苷酸，受到HrpX的誘導(dǎo)表達(dá)，在細(xì)胞平臺(tái)期積累，通過獲得sX12缺失突變菌株，發(fā)現(xiàn)與野生型相比其在平板上生長(zhǎng)緩慢，且在植物上發(fā)病延遲，說明它與sX13一樣能影響Xcv85-10菌株的毒力［48］。

2.2 水稻白葉枯病菌（XooPX099）中的sRNA

Liang等［50］在XooPX099中發(fā)現(xiàn)了8個(gè)sRNA，命名為：sRNA-Xoo1到sRNA-Xoo8，如表2。其中sRNA-Xoo1、sRNA-Xoo2、sRNA-Xoo3發(fā)揮作用依賴于Hfq蛋白，構(gòu)建hfq基因缺失突變體，通過雙向電泳（two-dimensional electrophoresis，2-DE）將突變體與野生型相關(guān)蛋白分離，分析與之相關(guān)蛋白的表達(dá)量，hfq基因的缺失使得與sRNA-Xoo1、sRNAXoo2相關(guān)的很多代謝蛋白表達(dá)量顯著降低。

sRNA-Xoo1來自基因間隔區(qū)，長(zhǎng)度為103個(gè)核苷酸。缺失該sRNA使得6個(gè)蛋白表達(dá)上調(diào)，包括外膜蛋白、伴侶蛋白以及其他酶類物質(zhì)，改變氨基酸代謝、蛋白合成、物質(zhì)運(yùn)輸、基因轉(zhuǎn)錄等；16個(gè)蛋白的表達(dá)下調(diào)，對(duì)細(xì)菌的代謝、氨基酸合成等產(chǎn)生影響。

sRNA-Xoo3來自基因間隔區(qū)，長(zhǎng)度為93個(gè)核苷酸。缺失sRNA-Xoo3可以降低參與氧化還原過程中的還原酶和過氧化物歧化酶，而參與ATP合成相關(guān)的酶以及調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝、氨基酸合成相關(guān)的蛋白都增加。

sRNA-Xoo4來自基因間隔區(qū)，長(zhǎng)度為145個(gè)核苷酸。sRNA-Xoo4缺失突變體中有9個(gè)與基因轉(zhuǎn)錄、rRNA合成等過程中相關(guān)蛋白下調(diào)，參與物質(zhì)運(yùn)輸?shù)耐饽さ鞍妆磉_(dá)上調(diào)。

表2 XooPX099中的8個(gè)sRNA及其功能［50］

2.3 十字花科黑腐病菌（Xcc8004）中的sRNA

Jiang等［51］于2010年報(bào)道了Xcc8004中4個(gè)sRNA，命名為sRNA-Xcc1到sRNA-Xcc4；An等［52］通過Northern blot技術(shù)發(fā)現(xiàn)了8個(gè)sRNA，命名為：sRNA-Xcc15、sRNA-Xcc16、sRNA-Xcc18、sRNAXcc28、sRNA-Xcc20到sRNA-Xcc24，如表3。

表3 Xcc8004中的12個(gè)sRNA及其功能［51，52，54］

可擴(kuò)散信號(hào)分子（diffusible signal factor，DSF）作為新發(fā)現(xiàn)的群體感應(yīng)信號(hào)，該家族的所有信號(hào)分子的主要化學(xué)成分都是順式-2-不飽和脂肪酸。rpf家族的基因與DSF緊密相關(guān)，RpfF參與DSF的合成，RpfC/RpfG組成雙組分感應(yīng)系統(tǒng)參與DSF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。DSF對(duì)十字花科黑腐病菌胞外酶、胞外多糖等毒素因子的調(diào)節(jié)有重要作用［53］。

sRNA-Xcc1來源于基因間隔區(qū)，長(zhǎng)度為88個(gè)核苷酸。在十字花科黑腐病菌中sRNA-Xcc1與辣椒-番茄細(xì)菌性瘡痂病菌中PtaRNA1一樣以質(zhì)粒為載體通過HGT轉(zhuǎn)運(yùn)，sRNA-Xcc1具有獨(dú)立的啟動(dòng)子，其轉(zhuǎn)錄方向與其他基因間隔區(qū)的啟動(dòng)子方向相反。sRNA-Xcc1，受到HrpX和HrpG調(diào)控，缺失HrpX和HrpG引起sRNA-Xcc1的表達(dá)下調(diào)，并推測(cè)該sRNA可能與十字花科黑腐病菌的毒力調(diào)控有關(guān)［54］

sRNA-Xcc15/16/28受到DSF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中RpfF和RpfG的系統(tǒng)控制［52］，該系統(tǒng)又與細(xì)菌的致病性密切相關(guān)，單獨(dú)缺失某一個(gè)sRNA都不影響Xcc8004的毒力，同時(shí)缺失sRNA-Xcc15/16/28則會(huì)大大降低該菌的毒力。

3 展望

近年來，通過深度測(cè)序技術(shù)在黃單胞菌屬少數(shù)幾個(gè)致病變種中發(fā)現(xiàn)了一定數(shù)量的sRNA，這些sRNA有的與致病相關(guān)，如sX12和sX13，還有少數(shù)發(fā)揮特殊作用的sRNA，如PtaRNA1行使抗毒素功能，但大部分已發(fā)現(xiàn)的黃單胞菌屬中的sRNA功能并不清楚。為深入解析黃單胞菌屬病原中sRNA的種類及其功能，今后在該研究領(lǐng)域有必要開展以下研究：（1）利用深度測(cè)序、交聯(lián)免疫沉淀等技術(shù)進(jìn)一步開展黃單胞菌中sRNA的鑒定，尤其是針對(duì)引起重要經(jīng)濟(jì)危害的該屬病原開展相關(guān)研究。如柑橘潰瘍病是我國(guó)檢疫性病害，該病對(duì)我國(guó)乃至全球柑橘產(chǎn)業(yè)造成了巨大的危害，但目前尚未見柑橘潰瘍病菌sRNA的研究報(bào)道。（2）開展黃單胞菌屬內(nèi)及相近屬間比較轉(zhuǎn)錄組分析，更好的發(fā)掘進(jìn)化保守性的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)及功能性的sRNA［55，56］。（3）加快sRNA功能研究步伐，解析其在黃單胞菌生理與環(huán)境適應(yīng)響應(yīng)，以及病原-寄主互作中的作用機(jī)制；同時(shí)在深入了解sRNA作用機(jī)制基礎(chǔ)上，開展RNA調(diào)控研究，以期為該類病害防控提供新的思路。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Research Progress on Small Non-coding RNA of the Xanthomonas spp.

YAN Yu-ping ZHONG Xi WANG Xue-feng
（National Citrus Engineering Research Center，Citrus Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences，Citrus Research Institute of Southwest University，Chongqing 400712）

The gram-negative plant-pathogenic bacterium of the genus Xanthomonas infects a variety of monocotyledonous plants and dicotyledonous plants，such as rice，cabbage，tomato，citrus and other economic crops. Type III secretion system and other virulence determinants contribute to the infection and proliferation of Xanthomonas. The majority of bacterial small non-coding RNAs（sRNAs）modulates the expression of target mRNAs by base pairing mechanisms，or affects various physiological functions of the cell by binding directly with the protein. This review summarizes the recent study advances in the classification and the effects of sRNA on bacterial protein regulation，metabolism，transcription and virulence regulation，focusing on the identified sRNAs of Xanthomonas and their biological functions，which aims at providing new ideas for controlling crop’s diseases caused by Xanthomonas.

Xanthomonas；small non-coding RNA；protein regulation；metabolism；virulence regulation

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.03.004

2016-06-13

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（XDJK2014A001）

嚴(yán)玉萍，女，碩士研究生，研究方向：分子植物病理學(xué)；E-mail：838711762@qq.com

王雪峰，男，副研究員，研究方向：分子植物病理學(xué)；E-mail：wangxuefeng@cric.cn