馬麗蘋MA Li-ping 焦昆鵬 - 羅 磊 向進(jìn)樂,3 -,3 張曉宇 - 樊金玲 - 朱文學(xué) -

(1. 河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471023；2. 河南省食品原料工程技術(shù)研究中心，河南 洛陽(yáng) 471023; 3. 食品加工與安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 洛陽(yáng) 471023)

懷山藥是中國(guó)著名的“四大懷藥”之一，也是補(bǔ)中益氣、物美價(jià)廉的蔬菜品種，主產(chǎn)于河南溫縣、武陟等地，富含糖蛋白、山藥多糖、薯蕷皂苷元、淀粉、各種游離氨基酸和黃酮等生物活性成分[1-2]。

抗性淀粉是指不被健康個(gè)體小腸吸收的膳食淀粉，與其他膳食纖維類似，到達(dá)結(jié)腸后，被用作結(jié)腸微生物的發(fā)酵底物，進(jìn)而對(duì)機(jī)體健康產(chǎn)生各種有益的影響[3]。研究發(fā)現(xiàn)，抗性淀粉具有改善結(jié)腸健康[4-6]、控制糖尿病[7-8]、降低血液膽固醇水平[9-10]、減少生物結(jié)石的形成[11]和增加礦物質(zhì)的吸收[12]等潛力?？剐缘矸劬哂袛D壓特性良好、糊化溫度高、口感好、無異味、能增加食物的脆性和減少含油量等功能特性，因此可作為食品添加劑用于食品工業(yè)，如將其添加到餅干、面條、面包和酸奶等食品中，從而開發(fā)高品質(zhì)功能性食品[13]。

據(jù)報(bào)道[14]，懷山藥淀粉含量高達(dá)20%～30%，是重要的淀粉來源。雖然關(guān)于其他品種山藥淀粉和抗性淀粉的研究已有報(bào)道[15-16]，但山藥淀粉的組成和含量受到山藥品種、生長(zhǎng)條件和環(huán)境因素的影響，同時(shí)對(duì)由其制備的抗性淀粉也產(chǎn)生一定的影響。目前關(guān)于懷山藥的研究大多集中在粗加工[1,17]、化學(xué)成分[18-19]和育種[20-21]等方面，而對(duì)其抗性淀粉的研究鮮見報(bào)道。因此，本研究應(yīng)用壓熱法制備懷山藥抗性淀粉，分析并闡明其基本理化性質(zhì)、化學(xué)結(jié)構(gòu)、熱特性和體外消化性等，以期為懷山藥抗性淀粉的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

懷山藥：購(gòu)自河南焦作市溫縣；

豬胰α-淀粉酶：10 units/mg，美國(guó)Sigma公司；

直鏈淀粉：美國(guó)Sigma公司；

耐高溫α-淀粉酶：4萬U/g，江蘇銳陽(yáng)生物科技有限公司；

糖化酶：10萬U/g，江蘇銳陽(yáng)生物科技有限公司；

透析袋：截留分子量3 500，合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；

其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器設(shè)備

紫外可見分光光度計(jì)：UV1800型，日本島津公司；

傅里葉變換紅外光譜：VERTEX70型，德國(guó)Bruck公司；

差示掃描量熱儀：DSC1型，瑞士Mettler-Toledo公司；

X-射線衍射儀：D8A型，德國(guó)Bruck公司；

多管架自動(dòng)平衡離心機(jī)：TDZ5-WS型，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：101型，天津躍進(jìn)器械廠；

電熱恒溫水浴鍋：HH-4型，北京科偉永興儀器有限公司；

分析天平：FA1004型，上海上平儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 懷山藥原淀粉的制備 新鮮的懷山藥經(jīng)清洗、去皮和切片后浸泡于5%～6%的抗壞血酸溶液中15 min，勻漿后用0.2 mol/L的NaOH溶液調(diào)pH值至8.5，攪拌1 h后過60目篩，自來水反復(fù)沖洗濾渣至澄清狀后，調(diào)節(jié)濾液pH值至7.0，靜置2 h，取下層懸濁液于4 500 r/min離心10 min，將沉淀置于55 ℃干燥箱中烘干至恒重，研碎后即可得到懷山藥淀粉。制備的懷山藥淀粉經(jīng)雙波長(zhǎng)法測(cè)定直鏈淀粉含量為24.40%。

1.3.2 懷山藥抗性淀粉的制備及純化

(1) 懷山藥抗性淀粉制備：配制25%淀粉懸濁液，置于高壓滅菌鍋中，115 ℃ 壓熱處理100 min，冷卻到室溫后，置于4 ℃冰箱老化6 h，然后80 ℃烘干，粉碎并過60目篩，即得懷山藥粗抗性淀粉。按文獻(xiàn)[22]所述方法測(cè)得抗性淀粉得率為13.41%。

(2) 酶解純化懷山藥抗性淀粉：稱取一定質(zhì)量懷山藥粗抗性淀粉，加蒸餾水，用pH 6.0的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液調(diào)節(jié)pH值到6.0～7.0，然后加入過量的耐高溫α-淀粉酶，90 ℃酶解2 h，冷卻至室溫后，4 mol/L檸檬酸調(diào)pH值到4.0～5.0，加入過量糖化酶，60 ℃水解1 h后，4 000 r/min離心10 min，棄去上清液，然后依次用95%，85%，75%的乙醇沖洗沉淀，4 000 r/min離心10 min，棄上清，50 ℃烘干，粉碎，即可得到純化的懷山藥抗性淀粉。

1.3.3 電鏡掃描 依次稱量已充分干燥的淀粉樣品，然后再用導(dǎo)電膠把樣品固定在銅臺(tái)上，噴金后用掃描電鏡觀察并拍攝。

1.3.4 熱力學(xué)特性分析 將淀粉樣品與水按照1∶3 (g/mL)的比例配成淀粉乳，取少量加入標(biāo)準(zhǔn)鋁坩堝，稱重壓蓋后，于4 ℃密封平衡1 d。測(cè)量同時(shí)，用空坩堝做空白參照。測(cè)量溫度范圍：20～130 ℃，升溫速率為10 ℃/min。用Thermal analysis 軟件計(jì)算得出起始溫度To、峰值溫度Tp、終止溫度Tc和糊化焓ΔH的變化情況。

1.3.5 淀粉的碘吸收特性 稱取20 mg淀粉樣品，置于具塞試管中，用無水乙醇潤(rùn)濕樣品后，再用1 mL 2 mol/L的氫氧化鉀充分溶解樣品，然后加入10 mL蒸餾水，調(diào)節(jié)pH值至6.0～7.0，加蒸餾水至50 mL，反復(fù)倒置混合均勻后，吸取上述溶液25 mL于100 mL容量瓶中，再加入80 mL蒸餾水和2 mL碘試劑，蒸餾水定容后立刻混合均勻，在波長(zhǎng)450～800 nm 內(nèi)進(jìn)行掃描。

1.3.6 紅外光譜的分析 將淀粉樣品和溴化鉀置于105 ℃烘干后，樣品和溴化鉀按1∶100的比例加入瑪瑙研缽中研好后置于壓片機(jī)中壓片，取出樣品薄片在400～4 000 cm-1波段進(jìn)行紅外掃描。

1.3.7 X-衍射分析 采用X-射線衍射儀測(cè)定淀粉的晶體特性。衍射條件：特征射線CuKα，加速電壓40 kV，管電流30 mA，測(cè)量角度2θ為5°～70°，掃描速度4°/min。

1.3.8 淀粉的透明度和持水性

(1) 透明度：用蒸餾水將淀粉樣品配成濃度為1%的淀粉乳，沸水糊化15 min，糊化過程中不斷添加蒸餾水以保持淀粉乳體積不發(fā)生變化，冷卻到室溫后，在620 nm波長(zhǎng)處分別測(cè)定放置0，1，3，6，12 h時(shí)淀粉糊的吸光率。用蒸餾水作為空白參比，設(shè)其透光率為100%，以淀粉糊的透光率值表示淀粉糊的透明度。

(2) 持水性：將50 mg淀粉樣品分散于10 mL水中，置于45，55，65，75，85 ℃水浴1 h，冷卻至室溫后，6 000 r/min離心15 min，棄掉上清液，擦干離心管內(nèi)、外壁所附著的水分后，稱沉淀質(zhì)量，按式(1)計(jì)算持水力。

(1)

式中：

WHC——持水力，%；

m1——沉淀質(zhì)量，g；

m2——樣品質(zhì)量，g。

1.3.9 體外消化特性分析 采用In-Vitro 模型系統(tǒng)研究懷山藥原淀粉和抗性淀粉的消化特性。

(1) 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：參照史苗苗等[23]的方法制備得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=1.456 3x+0.062 7，R2=0.994 4。

(2) 體外消化性能測(cè)定：參照史苗苗等[23]的方法略加修改如下：稱取淀粉樣品200 mg，加入20 mL磷酸鹽緩沖液和15 mL豬胰α-淀粉酶(260 U/mL)溶液，混勻后裝入透析袋中，然后將透析袋置于盛有400 mL磷酸鹽緩沖液的燒杯中，再在37 ℃恒溫震蕩水浴中進(jìn)行消化反應(yīng)，然后分別于1，2，3，4，5，6 h時(shí)取出一定量的消化滲析液，稀釋一定倍數(shù)后，測(cè)定其中麥芽糖含量。按式(2)～(4)計(jì)算整個(gè)體系中消化產(chǎn)物量、還原糖釋放量和平均消化速度。

CHO=C×D×(435-S)×0.001，

(2)

(3)

(4)

式中：

C——標(biāo)準(zhǔn)曲線得出的麥芽糖含量，mg；

D——消化液的稀釋倍數(shù)；

CHO——體系中產(chǎn)生的水解糖的含量，mg；

435——整個(gè)體系的溶液體積，mL；

S——每次取出的消化液體積，mL；

0.001——換算系數(shù)；

V——平均消化速度，mg/(g·h)；

W1——樣品的質(zhì)量，g；

W0——總干物質(zhì)的量，g；

H——反應(yīng)時(shí)間，h。

2 結(jié)果與分析

2.1 淀粉的超微結(jié)構(gòu)

由圖1(a)可知，原淀粉表面光滑，顆粒完整，呈不規(guī)則且大小不一的橢球型、球形、三角形等多種形態(tài)。通過壓熱法制備的抗性淀粉[圖1(b)]顆粒特征消失，呈現(xiàn)疏松的片層狀結(jié)構(gòu)。出現(xiàn)此現(xiàn)象可能是高溫使淀粉發(fā)生糊化，導(dǎo)致其顆粒結(jié)構(gòu)被破壞，而直鏈淀粉則從淀粉顆粒中溶出，待冷卻時(shí)，直鏈淀粉會(huì)重新排列形成雙螺旋結(jié)構(gòu)而形成非常穩(wěn)定的結(jié)晶結(jié)構(gòu)，進(jìn)而在耐高溫α-淀粉酶和糖化酶的作用下，粗抗性淀粉中的可溶性淀粉顆粒被酶解，從而使純化抗性淀粉呈現(xiàn)表面疏松的片狀結(jié)構(gòu)[24]。懷山藥抗性淀粉表面疏松的結(jié)構(gòu)可能也是其吸水能力增加的原因之一。

2.2 淀粉的熱力學(xué)特性

懷山藥原淀粉及其抗性淀粉的DSC圖譜見圖2，其對(duì)應(yīng)曲線參數(shù)見表1。由表1可知，懷山藥原淀粉的糊化溫度為76.41～89.49 ℃，在83.33 ℃處有吸熱峰，糊化焓為74.47 J/g；抗性淀粉的糊化溫度高于原淀粉，為103.77～109.64 ℃，在107.21 ℃處有吸熱峰，糊化焓為141.44 J/g。懷山藥抗性淀粉的糊化溫度高于原淀粉，與玉米、小麥和馬鈴薯淀粉及其抗性淀粉的熱特性相似[25]，但與這些抗性淀粉相比，懷山藥抗性淀粉的吸熱峰溫度較低，可能與其晶體結(jié)構(gòu)不致密、結(jié)晶度不高有關(guān)。淀粉顆粒經(jīng)壓熱處理制備抗性淀粉時(shí)，淀粉鏈重排形成更致密的結(jié)晶結(jié)構(gòu)，因此在糊化時(shí)沒有發(fā)生吸水膨脹，也就沒有形成糊化吸熱峰?？剐缘矸鄣木w結(jié)構(gòu)熱穩(wěn)定性高，因此需要更多的熱量使其發(fā)生非晶化相變，故導(dǎo)致其相變吸熱峰吸熱焓增大[26]。懷山藥抗性淀粉具有較高的熱穩(wěn)定性，可以經(jīng)受大多數(shù)食品加工過程。

Figure 2 The thermodynamic characteristic curve of raw starch and resistant starch fromDioscoreaoppositeThunb. cv. Huaiqing

2.3 淀粉的碘吸收特性

直鏈淀粉的最大吸收峰在600～640 nm，支鏈淀粉的最大吸收峰在520～560 nm[27]。由圖3可知，抗性淀粉-碘復(fù)合物的最大吸收峰在580 nm，位于直鏈淀粉與支鏈淀粉之間，且由直鏈淀粉處向支鏈淀粉處偏移，表明懷山藥淀粉經(jīng)壓熱處理后改變了直鏈淀粉構(gòu)象，其絡(luò)合碘分子的數(shù)目減少，顏色變淺，吸光值減小，最大吸收波長(zhǎng)向較短波長(zhǎng)方向移動(dòng)。另外，抗性淀粉-碘復(fù)合物的吸收峰比原淀粉窄，說明懷山藥抗性淀粉的分子質(zhì)量分布比較集中[28]。

Figure 3 Iodine absorption curves of raw starch and its RS fromDioscoreaoppositeThunb. cv. Huaiqing

2.4 淀粉的紅外光譜分析

由圖4可知，原淀粉和抗性淀粉均有以下吸收峰：3 365.87 cm-1和3 433.84 cm-1處為締合—OH的伸縮振動(dòng)峰；2 933.55 cm-1和2 936.25 cm-1處為飽和—CH的伸縮振動(dòng)峰；1 653.66 cm-1和1 651.80 cm-1處為醛基C═O的伸縮振動(dòng)峰；1 161.93 cm-1和1 158.92 cm-1處為與伯醇羥基相連的C—O伸縮振動(dòng)峰；993.79 cm-1和1 000.82 cm-1處為與仲醇羥基相連的C—O—C伸縮振動(dòng)峰；861.99 cm-1和857.00 cm-1處為D-吡喃葡萄糖的吸收帶峰。比較原淀粉和抗性淀粉紅外圖譜也可發(fā)現(xiàn)，懷山藥淀粉在929.38 cm-1處有D-吡喃葡萄糖的非對(duì)稱伸縮振動(dòng)，在766.68 cm-1處有D-吡喃葡萄糖的對(duì)稱性伸縮振動(dòng)，而懷山藥抗性淀粉在這些波段均沒有吸收峰，說明原淀粉經(jīng)壓熱處理后D-吡喃結(jié)構(gòu)被破壞?？傮w而言，壓熱處理前后淀粉的化學(xué)結(jié)構(gòu)相似，沒有生成新的基團(tuán)，說明壓熱法制備懷山藥抗性淀粉主要發(fā)生了物理變化。

2.5 淀粉的結(jié)晶結(jié)構(gòu)

根據(jù)淀粉顆粒X射線衍射圖，可以將淀粉樣品劃分為A、B、C 3 種結(jié)晶型，其中C型普遍認(rèn)為是A型與B型的混合物[15]。 由圖5可知，懷山藥原淀粉的X-衍射圖譜分別在2θ為5.76°，11.40°左右有中強(qiáng)衍射峰，在2θ為15.12°，17.25°，23.03°左右有強(qiáng)衍射峰，證明懷山藥原淀粉屬于C型淀粉，與已報(bào)道的淮山藥淀粉和長(zhǎng)山藥淀粉晶型一致[15,29]。而懷山藥抗性淀粉僅在16.85°，22.49°有較強(qiáng)衍射峰，而且峰形較為彌散，表明壓熱處理使懷山藥淀粉的分子結(jié)構(gòu)被打亂后重新排列，導(dǎo)致結(jié)晶結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，具體表現(xiàn)為部分特征峰的消失。

2.6 淀粉的透明度和持水性

淀粉糊的透明度能夠反映淀粉與水互溶能力以及膨脹程度，直接影響淀粉產(chǎn)品的用途、外觀和可接受性。淀粉糊的透明度常用透光率表示，透光率越高，則淀粉糊的透明度越好，所加工的淀粉產(chǎn)品亮度越高[30]。由圖6(a)可知，懷山藥原淀粉糊在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的透光率均比其抗性淀粉的高，與張麗芬等[29]報(bào)道的淮山藥抗性淀粉結(jié)果一致。這可能是由于抗性淀粉中直鏈淀粉含量高，而直鏈淀粉分子相互締合使光線散射增強(qiáng)造成的。因此，懷山藥抗性淀粉比較適合應(yīng)用于黏稠且透明度低的飲料中，以增加飲料的懸浮度和不透明度。

淀粉持水性表示羥基與淀粉分子鏈由共價(jià)結(jié)合所產(chǎn)生的結(jié)合水量的大小。由圖6(b)可知，當(dāng)水浴溫度低于75 ℃時(shí)，懷山藥抗性淀粉的持水性大于原淀粉的持水性，即抗性淀粉具有更大的持水能力，可能是抗性淀粉制備過程中，糊化后淀粉分子在凝沉過程中分子重排形成具有疏松的片層結(jié)構(gòu)[圖1(b)]，短直鏈淀粉分子增多，從而使葡萄糖單元外側(cè)的親水羥基增多，因而吸水能力增強(qiáng)。然而當(dāng)水浴溫度為85 ℃時(shí)，原淀粉的持水性明顯增加，顯著高于抗性淀粉的，可能是由于該溫度高于懷山藥淀粉的糊化溫度(83.3 ℃)，原淀粉糊化時(shí)大量吸水造成的。

2.7 淀粉的體外消化性

相同時(shí)間內(nèi)，消化產(chǎn)物量越多，表示越容易消化。由圖7(a)可知，原淀粉與抗性淀粉消化產(chǎn)物的量均隨消化時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。但與原淀粉相比，經(jīng)相同消化時(shí)間后，抗性淀粉消化產(chǎn)物的量明顯低于原淀粉的，可能是抗性淀粉形成了較穩(wěn)定的晶格，胰淀粉酶較難與其發(fā)揮作用。表2說明隨著消化時(shí)間的延長(zhǎng)，原淀粉和抗性淀粉還原糖釋放率增加，但抗性淀粉增加幅度較小，說明抗性淀粉更耐消化。

Figure 7 Digested product amount andaverage digestion rate of raw starch and resistant starch

由圖7(b)可知，隨著消化時(shí)間的延長(zhǎng)原淀粉與抗性淀粉的消化速率都減小，尤其是前3 h，二者的平均消化速率下降較快，而3 h之后，消化速率呈現(xiàn)緩慢下降趨勢(shì)。在相同消化時(shí)間時(shí)，抗性淀粉的平均消化速率均明顯小于原淀粉的。試驗(yàn)所用的豬胰α-淀粉酶為內(nèi)切酶，能夠?qū)Φ矸鄣摩?1,4糖苷鍵進(jìn)行無規(guī)則的水解產(chǎn)生更多的還原糖，但是隨著消化時(shí)間的延長(zhǎng)，大的淀粉分子被水解成小的分子，與酶結(jié)合的位點(diǎn)減少，反應(yīng)速率就減慢，產(chǎn)物的生成速率減慢，但整個(gè)體系的產(chǎn)物量是增加的[16]。豬胰α-淀粉酶在水解淀粉時(shí)，酶分子首先擴(kuò)散到淀粉顆粒表面與淀粉鏈的特定區(qū)域結(jié)合進(jìn)行分子的固定，然后催化淀粉鏈水解。與原淀粉相比，抗性淀粉因淀粉鏈經(jīng)過蜷曲折疊形成了堅(jiān)實(shí)的抗酶解的晶體結(jié)構(gòu)，因而更耐消化[23]。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用堿法制備懷山藥淀粉，繼而采用壓熱法制得其抗性淀粉。與原淀粉相比，懷山藥抗性淀粉顆粒特征消失，表面疏松呈片層結(jié)構(gòu)，在一定溫度范圍內(nèi)持水性增加，熱穩(wěn)定性更高且在體外更耐消化。因此，懷山藥淀粉經(jīng)改性后，淀粉糊性質(zhì)得到顯著改善，更適用于食品加工，尤其是黏稠食品、低透明度飲料、果凍和乳制品等領(lǐng)域。

后期將進(jìn)一步研究懷山藥抗性淀粉在機(jī)體內(nèi)的抗消化作用、益生作用及其機(jī)制，深入探討其腸道保健潛力，為懷山藥淀粉資源的有效利用提供理論依據(jù)。

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