尹孝超 錢海峰 王 立 張 暉 齊希光

(江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122)

米糠固態(tài)發(fā)酵工藝優(yōu)化及其氨基酸變化

尹孝超 錢海峰 王 立 張 暉 齊希光

(江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122)

對米糠進行固態(tài)發(fā)酵，研究其蛋白、脂肪、灰分和總糖含量的變化規(guī)律，以期找到一種有效深度開發(fā)米糠資源的方法。結(jié)果表明：蛋白和灰分含量相比于發(fā)酵前明顯增加，脂肪和總糖含量隨著發(fā)酵時間的延長逐漸降低。以真蛋白含量為響應(yīng)值，對固態(tài)發(fā)酵條件進行響應(yīng)面輔助優(yōu)化，確定最佳發(fā)酵條件為溫度37 ℃，時間102 h，水分含量60%，初始pH 5.5，接種量20 mL/100 g，發(fā)酵米糠的真蛋白含量19.65%，比原米糠提高了41.88%。此外，對米糠的氨基酸組成進行分析，蛋氨酸和蘇氨酸占總氨基酸含量分別提高了73.92%和22.99%。

固態(tài)發(fā)酵；米糠；黑曲霉

米糠是稻谷在加工過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)品，是由糙米經(jīng)碾米獲得的，包含種皮、果皮、胚乳和糊粉層等。中國年產(chǎn)稻米超過2.0×108t，米糠產(chǎn)量在1.2×107t左右，因此米糠資源非常豐富[1]。米糠中含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，蛋白含量12%～16%，脂肪16%～22%，纖維含量8%～12%[2]，以及維生素、多糖等生理活性物質(zhì)。其中米糠蛋白的營養(yǎng)價值可與動物蛋白相媲美，可溶性蛋白約占總米糠的70%，具有低過敏性，其氨基酸組成與FAO/WHO的推薦模式相接近[3-6]。米糠蛋白雖然營養(yǎng)價值高，但是天然米糠中的蛋白質(zhì)與纖維素、半纖維素、植酸鈣等物質(zhì)結(jié)合緊密，不易被利用[7]。而且米糠蛋白的提取和分離純化難度大，限制了米糠蛋白的工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用[8]。在中國，米糠利用還停留在初級階段，被直接作為畜禽飼料，消化利用率低，導(dǎo)致米糠資源未能得到深度開發(fā)。近年來，隨著對米糠資源的開發(fā)，米糠油、米糠多肽、米糠多糖等產(chǎn)品陸續(xù)出現(xiàn)，米糠資源的開發(fā)利用越來越受到研究者的重視。

固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)品的優(yōu)點突出，例如：① 將植物蛋白轉(zhuǎn)變成優(yōu)質(zhì)的菌體蛋白[9]；② 生產(chǎn)效率高，不受自然條件限制[10]；③ 能夠調(diào)節(jié)動物腸道菌群結(jié)構(gòu)，有助于改善消化系統(tǒng)[11]；④ 包含多種酶系，有利于消化吸收[12]；⑤ 設(shè)備簡單，投資少等[13]。黑曲霉菌株產(chǎn)生的酶系豐富且酶活高，如淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶等，且生長速度快，是公認的無毒無害菌株[14]。目前，國內(nèi)外對于固態(tài)發(fā)酵米糠的研究主要集中在靜態(tài)發(fā)酵米糠提取生理活性物質(zhì)方面，對于發(fā)酵米糠中蛋白質(zhì)的富集優(yōu)化鮮有報道。試驗中的翻料可以起到降低物料溫度的作用，同時黑曲霉是好氧真菌，翻料可以促進體系中氣體的交換，更加有利于發(fā)酵的進行。

本試驗采用黑曲霉菌株固態(tài)發(fā)酵米糠，研究米糠成分在固態(tài)發(fā)酵過程的變化，并對發(fā)酵米糠中的蛋白富集進行響應(yīng)面優(yōu)化試驗，旨在制得一種高蛋白發(fā)酵米糠產(chǎn)品，以及為今后米糠在固態(tài)發(fā)酵方面的深度開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑曲霉(AspergillusnigerF0045)：江南大學(xué)微生物菌種保藏中心；

察氏培養(yǎng)基(活化培養(yǎng)基)：蔗糖 30 g，NaNO33 g，MgSO4·7H2O 0.5 g， KCl 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，K2HPO41 g，瓊脂 15 g，蒸餾水 1 000 mL，調(diào)pH至 7.2；

穩(wěn)定化未脫脂米糠：真蛋白含量13.85%，脂肪含量16.71%，灰分含量7.01%，總糖含量342.33 mg/g，益海嘉里糧油食品有限公司，過40目篩，貯藏于-20 ℃冰箱中；

試驗所用試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

消解儀：HYP-1008型，濟南海能儀器股份有限公司；

全自動凱氏定氮儀：K9860型，濟南海能儀器股份有限公司；

霉菌培養(yǎng)箱：BMJ-160型，上海博迅實業(yè)有限公司；

超凈工作臺：SW-CJ-1FD型，蘇州安泰空氣凈化技術(shù)有限公司；

氨基酸專用高效液相色譜儀：Agilent1260型，日本島津公司；

立式壓力蒸汽滅菌器：YXQ-LS-50 SII型，上海博迅實業(yè)有限公司；

分析天平：BSA224S型，梅特勒-托利多(上海)儀器有限公司；

鼓風(fēng)干燥箱：DHG-9055A型，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；

pH計：STARTER3100/F型，梅特勒-托利多(上海)儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 發(fā)酵米糠菌種的制備 取保存的黑曲霉斜面菌種一環(huán)，接種到試管斜面培養(yǎng)基上，于28 ℃下培養(yǎng)6 d，待斜面長滿黑色孢子后，用無菌蒸餾水洗滌斜面，用接種環(huán)輕輕刮下孢子，收集孢子懸液，用無菌紗布過濾。用血球計數(shù)板計數(shù)，至少計數(shù)3次，取相近的3個值的平均值作為孢子濃度。調(diào)整孢子懸液濃度在4.0×105mL-1。

1.3.2 發(fā)酵米糠的方法 稱取穩(wěn)定化米糠10 g于250 mL三角瓶中，加入蒸餾水調(diào)整基質(zhì)水分含量至60%，瓶口用八層紗布覆蓋。放入滅菌罐121 ℃，20 min。滅菌完后取出，冷卻。加入5 mL已滅菌的營養(yǎng)液(KH2PO42 g/L，MgSO41.5 g/L，NH2CONH25 g/L溶于0.4 mol/L的HCl中[15])和2 mL孢子懸液，攪拌均勻。放置于34 ℃霉菌培養(yǎng)箱中，保持濕度90%，每隔24 h翻料和補水3 mL一次。發(fā)酵72 h后，置于60 ℃烘箱烘干至恒重，保存待測。

1.3.3 發(fā)酵米糠的成分測定方法 發(fā)酵米糠中的真蛋白含量測定參照胡艷麗[16]方法進行，用凱氏定氮法測定真蛋白含量(蛋白轉(zhuǎn)換系數(shù)設(shè)為6.25)。脂肪、灰分和總糖含量的測定分別按GB/T 14772—2008、GB 5009.4—2016和GB/T 15672—2009執(zhí)行。

水解氨基酸含量測定：稱量100.0 mg樣品放入50 mL水解管中，加入8 mL 6 mol/L HCl溶液，充氮氣封管，放入120 ℃烘箱中水解22 h，水解完全后冷卻，加入4.8 mL 10 mol/L NaOH溶液中和并用蒸餾水定容至25 mL，雙層濾紙過濾后，取1 mL濾液10 000 r/min離心10 min，取上清液400 μL上機進樣。

1.3.4 固態(tài)發(fā)酵對米糠成分的影響 研究固態(tài)發(fā)酵對米糠中蛋白、脂肪、灰分和總糖含量的影響。選擇在溫度34 ℃、接種量20 mL/100 g米糠、初始pH 5.5和初始水分含量60%的條件下進行米糠固態(tài)發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后，將樣品放入60 ℃烘箱烘干至恒重，保存待測。測定方法見1.3.3。

1.3.5 發(fā)酵條件的單因素試驗設(shè)計

(1) 發(fā)酵溫度：在接種量1 mL，發(fā)酵時間96 h，裝料量10 g，初始pH 5.5，初始水分含量50%的條件下，考察發(fā)酵溫度(28，31，34，37，40 ℃)對發(fā)酵米糠真蛋白含量的影響。

(2) 接種量：在發(fā)酵溫度28 ℃，發(fā)酵時間96 h，裝料量10 g，初始pH 5.5，初始水分含量50%的條件下，考察接種量(1，2，3，4，5 mL)對發(fā)酵米糠真蛋白含量的影響。

(3) 發(fā)酵時間：在發(fā)酵溫度28 ℃，接種量1 mL，裝料量10 g，初始pH 5.5，初始水分含量50%的條件下，考察發(fā)酵時間(48，72，96，120，144 h)對發(fā)酵米糠真蛋白含量的影響。

(4) 裝料量：在發(fā)酵溫度28 ℃，接種量1 mL，發(fā)酵時間96 h，初始pH 5.5，初始水分含量50%的條件下，考察裝料量(10，15，20 g)對發(fā)酵米糠真蛋白含量的影響。

(5) 初始pH：在發(fā)酵溫度28 ℃，接種量1 mL，發(fā)酵時間96 h，裝料量10 g，初始水分含量50%的條件下，考察初始pH(5.0，5.5，6.0，6.5，7.0)對發(fā)酵米糠真蛋白含量的影響。

(6) 初始水分含量：在發(fā)酵溫度28 ℃，接種量1 mL，發(fā)酵時間96 h，裝料量10 g，初始pH 5.5的條件下，考察初始水分含量 (40，50，60，70，80%)對發(fā)酵米糠真蛋白含量的影響。

1.3.6 Plackett-Burman試驗設(shè)計 在單因素結(jié)果分析的基礎(chǔ)上，利用Design-Expert.8.0.5軟件，設(shè)計Plackett-Burman(PB)試驗，以初始pH、裝料量、初始水分含量、時間、溫度和接種量為影響因素，設(shè)置高低兩個水平，高水平為低水平的1.25倍。以發(fā)酵米糠中真蛋白含量為響應(yīng)值，根據(jù)各因素的顯著性，篩選出最主要的因素進行固態(tài)發(fā)酵條件的響應(yīng)面優(yōu)化試驗。

1.3.7 響應(yīng)面試驗設(shè)計 由PB試驗優(yōu)化得到的3個最顯著的因素(溫度、時間、初始水分含量)設(shè)計響應(yīng)面試驗，利用Design-Expert.8.0.5軟件進行Box-Behnken中心組合試驗設(shè)計。得到二次回歸方程，確定最佳固態(tài)發(fā)酵條件組合。

1.3.8 驗證實驗和數(shù)據(jù)分析 根據(jù)二次回歸方程得出的最佳發(fā)酵條件組合，設(shè)計驗證實驗。以上試驗均做3組平行。PB試驗和Box-Behnken中心組合試驗數(shù)據(jù)分析及處理由Design-Expert.8.0.5軟件和SPASS軟件輔助完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 固態(tài)發(fā)酵對米糠成分的影響

2.1.1 固態(tài)發(fā)酵對米糠中真蛋白含量的影響 由圖1可知，真蛋白含量在發(fā)酵72 h時達到最大值，之后隨著發(fā)酵時間的延長逐漸降低。發(fā)酵過程中真蛋白含量的增加主要由外加氮源的加入和蛋白質(zhì)“濃縮效應(yīng)”[17]共同完成。外加氮源的加入使得黑曲霉利用無機氮源合成自身的菌體蛋白，提高了發(fā)酵米糠的真蛋白含量。與此同時，在發(fā)酵過程中黑曲霉的生長呼吸作用，產(chǎn)生了二氧化碳和水，使得發(fā)酵產(chǎn)物的質(zhì)量減少，出現(xiàn)了蛋白質(zhì)的“濃縮效應(yīng)”。

發(fā)酵前期，菌體生長代謝活動較旺盛，利用基質(zhì)中無機氮源和有機氮源進行自身菌體蛋白的合成，蛋白含量增加。此時基質(zhì)中菌體的蛋白合成能力大于蛋白分解能力。發(fā)酵后期，菌體進入衰亡期，此時菌體的蛋白分解能力大于蛋白合成能力，所以蛋白含量會有所下降，此時蛋白含量的下降可能是真菌對蛋白分解作用和基質(zhì)“濃縮作用”共同完成。Silveira等[18]利用根霉固態(tài)發(fā)酵脫脂米糠，粗蛋白含量提高了69%。Schmidt等[15]利用米根霉半固態(tài)發(fā)酵米糠，粗蛋白含量較未發(fā)酵米糠提高了53%?？傊虘B(tài)發(fā)酵對真蛋白含量有積極的影響。

2.1.2 固態(tài)發(fā)酵對米糠中脂肪和灰分含量的影響 由圖2可知，米糠未發(fā)酵之前的脂肪含量為16.91%，脂肪含量隨著發(fā)酵時間的延長逐漸降低，經(jīng)過96 h的固態(tài)發(fā)酵之后，脂肪含量降到11.48%，固態(tài)發(fā)酵過程中脂肪含量的降低可能是由于脂肪被真菌利用，用來合成自身的生物膜系統(tǒng)中的磷脂[19]。Larine等[20]利用米根霉固態(tài)發(fā)酵米糠120 h，脂肪含量從15.2%降至7.4%，降低了51.32%，差異顯著(P<0.05)。固態(tài)發(fā)酵可以降低米糠中的脂肪含量，而米糠的酸敗問題主要是脂肪酶分解脂肪造成的。所以，固態(tài)發(fā)酵可以作為一種潛在的米糠保存方式。

由圖2還可知，灰分含量隨發(fā)酵時間的延長逐漸增加。發(fā)酵120 h后測定發(fā)酵米糠中灰分含量，其含量從原來的7.01%增加到8.91%，增加了27.10%。主要是由于黑曲霉利用米糠中的營養(yǎng)物質(zhì)進行生長代謝，真菌生物量增加，米糠中大分子物質(zhì)被菌體利用分解，基質(zhì)中小分子物質(zhì)增加，無機物增多。Larine等[20]利用米根霉固態(tài)發(fā)酵米糠120 h時，灰分含量從9.4%增加到13.9%，增加了47.87%，表現(xiàn)出顯著性差異(P<0.05)。與本研究結(jié)果趨勢一致。

2.1.3 固態(tài)發(fā)酵對米糠中總糖含量的影響 由圖3可知，發(fā)酵過程中總糖含量持續(xù)下降，發(fā)酵96 h后，米糠中的總糖含量從342.33 mg/g降至221.67 mg/g，降低了35.25%，差異顯著(P<0.05)。表明基質(zhì)中的糖類被菌體利用，分解產(chǎn)生能量和小分子物質(zhì)供菌體進行生長代謝活動。發(fā)酵初期，菌體生長較快，在菌體生長過程中產(chǎn)生的纖維素酶、淀粉酶等對多糖的降解作用，導(dǎo)致總糖含量下降較快。發(fā)酵后期基質(zhì)已不再適合菌體生長，菌體分解利用糖類變慢，總糖含量下降速度減緩。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果與分析

2.2.1 Plackett-Burman試驗設(shè)計及結(jié)果分析 以真蛋白含量為響應(yīng)值，設(shè)計米糠固態(tài)發(fā)酵條件的響應(yīng)面優(yōu)化試驗。由單因素試驗結(jié)果分析得出Plackett-Burman(PB)試驗設(shè)計方案見表1，對初始pH、裝料量、初始水分含量、時間、溫度和接種量進行顯著性分析，設(shè)置高水平為低水平的1.25倍。利用Design-Expert.8.0.5軟件輔助分析PB試驗結(jié)果。由表2可知，6個因素對固態(tài)發(fā)酵米糠中真蛋白含量的影響順序為：溫度>時間>初始水分含量>裝料量=接種量>初始pH。根據(jù)ANOVA分析，得出該模型顯著(P=0.003 6<0.05)，R2=0.952 6，說明該模型有95.26%的數(shù)據(jù)可信。

2.2.2 響應(yīng)面設(shè)計試驗結(jié)果及分析 由PB試驗得出的影響固態(tài)發(fā)酵米糠中真蛋白含量的3個顯著性因素，利用Design-Expert.8.0.5軟件進行Box-Behnken的中心組合試驗設(shè)計，以溫度、時間和初始水分含量為因素，設(shè)計三因素三水平的試驗方案，設(shè)計方案見表3、4。試驗結(jié)果分析由Design-Expert.8.0.5軟件輔助完成。

根據(jù)響應(yīng)面ANOVA結(jié)果分析得到因素A、B、C的二次回歸方程：

Y=19.7-0.14A+0.69B-0.53C+0.29AB-0.82AC+0.7BC-0.53A2-1.05B2-1.3C2。

(1)

由表5可知，P=0.000 9<0.01，表明模型以真蛋白含量為響應(yīng)值時，該模型極顯著。失擬項P=0.191 4>0.1，表明試驗結(jié)果和模型方程擬合良好。相關(guān)系數(shù)R2=0.949 4，表明有94.94%的數(shù)據(jù)可以由模型方程解釋。CV越小，說明模型置信度越好。該模型變異系數(shù)CV=2.4%，說明模型方程能夠較好地反映真實的試驗值。校正決定系數(shù)為0.884 4，說明該模型可以解釋88.44%的數(shù)據(jù)變異。綜上所述，該模型為固態(tài)發(fā)酵條件提供了一個很好的選擇。

? 同一列數(shù)據(jù)不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

?R2=0.952 6。

由回歸方程得到的固態(tài)發(fā)酵最佳條件：溫度37.18 ℃，時間102.86 h，初始水分含量58.52%，得到真蛋白含量為19.83%，比原米糠蛋白含量提高了43.17%。驗證實驗選擇條件發(fā)酵時間37 ℃，時間102 h，初始水分含量60%，接種量20 mL/100 g米糠，初始pH 5.5，裝料量150 g，固態(tài)發(fā)酵在托盤中進行，得到發(fā)酵米糠的真蛋白含量為19.65%。比原米糠蛋白含量提高了41.88%。試驗結(jié)果與預(yù)測試驗結(jié)果相差不大，說明固態(tài)發(fā)酵優(yōu)化工藝有效。

? 同一列數(shù)據(jù)不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.3 發(fā)酵米糠中17種常規(guī)水解氨基酸含量的變化

考慮到發(fā)酵米糠的適口性、外觀性以及發(fā)酵成本等因素，根據(jù)實際情況選擇縮短發(fā)酵時間，降低發(fā)酵溫度來抑制孢子的形成并降低能耗，最終選擇發(fā)酵溫度34 ℃，發(fā)酵時間72 h，初始水分含量60%，初始pH 5.5，接種量20 mL/100 g米糠，得到的真蛋白含量為18.15%，較原米糠提高了31.05%。此條件下發(fā)酵米糠中黑曲霉孢子得到很好的抑制，發(fā)酵成本降低，品質(zhì)達到很好的改善。在此條件下測定氨基酸含量的變化。

?R2=0.949 4，AdjR2=0.884 4，CV=2.40%，Adeq Precision=12.647。

由表6可知，發(fā)酵過程中氨基酸含量在不斷增加，原米糠中氨基酸含量為11.76%，發(fā)酵72 h后氨基酸總量達到15.22%，較原米糠增加了29.42%，差異顯著(P<0.05)。蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價值取決于氨基酸種類和含量，其中必需氨基酸的含量是評價蛋白質(zhì)質(zhì)量的一個重要指標(biāo)。發(fā)酵72 h時，限制性氨基酸蛋氨酸、蘇氨酸占總氨基酸含量顯著增加(P<0.05)，分別增加了73.92%和22.99%。發(fā)酵96 h時，總氨基酸含量略有下降，主要是基質(zhì)中大部分營養(yǎng)物質(zhì)被利用，此時發(fā)酵體系中菌體對蛋白的分解能力大于蛋白合成能力。總的來說，固態(tài)發(fā)酵能夠有效改善氨基酸組成，使必需氨基酸和限制性氨基酸較發(fā)酵前都有所提高。因此，固態(tài)發(fā)酵對米糠中的氨基酸組成起到了很好的改善作用。

3 結(jié)論

(1) 固態(tài)發(fā)酵對米糠成分的改善有一定作用。在一定的發(fā)酵時間內(nèi)，蛋白和灰分含量隨著發(fā)酵時間的延長逐漸增加，脂肪和總糖含量則逐漸降低。這為今后米糠在固態(tài)發(fā)酵方面的應(yīng)用和發(fā)展提供了一定的理論基礎(chǔ)。

? 同一行數(shù)據(jù)不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

(2) 固態(tài)發(fā)酵過程中真蛋白的富集優(yōu)化試驗表明，最佳發(fā)酵條件為：溫度37 ℃，時間102 h，初始水分含量60%，初始pH 5.5，接種量20 mL/100 g米糠，此時發(fā)酵米糠的真蛋白含量19.65%，比原米糠提高了41.88%。因此，固態(tài)發(fā)酵米糠可以作為一種生產(chǎn)高蛋白發(fā)酵產(chǎn)品的潛在方式。

(3) 固態(tài)發(fā)酵過程中富集真蛋白的來源和性質(zhì)還需進一步進行研究和分析。

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Effect of solid-state fermentation on the ingredients of rice bran

YIN Xiao-chaoQIANHai-fengWANGLiZHANGHuiQIXi-guang

(SchoolofFoodScienceandTechnology,JiangnanUniversity,Wuxi,Jiangsu214122,China)

In this paper, the changes of protein, lipid, ash and total sugar of rice bran after solid-state fermentation were studied for deep development of rice bran resources. The results showed that the contents of protein and ash increased significantly after fermentation. Moreover, the contents of lipid and total sugar decreased gradually with fermentation time. The optimized fermentation condition was: 37 ℃, 102 h, moisture content of 60%, initial pH 5.5, inoculation amount of 20 mL/100 g, with the true protein content as the response value. In this condition，the true protein content of fermented rice bran was 19.65%,increased 41.88% compared with the raw rice bran. In addition, the results of amino acid analysis showed that the contents of methionine and threonine were increased by 73.92% and 22.99% respectively compared with the original rice bran.

Solid-state fermentation; Rice bran;Aspergillusniger

十二五863計劃(編號：2013AA102203-07)

尹孝超，男，江南大學(xué)在讀碩士研究生。

錢海峰(1973—)，男，江南大學(xué)副教授，博士。 E-mail: qianhaifeng@jiangnan.edu.cn

2017-01-04

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.03.009