王志堅，劉勝兵，沈忠飛

（嘉興學(xué)院醫(yī)學(xué)院，浙江嘉興314000）

巴弗洛霉素A1對腦缺血再灌注損傷作用的初步研究

王志堅，劉勝兵，沈忠飛

（嘉興學(xué)院醫(yī)學(xué)院，浙江嘉興314000）

目的：探討預(yù)防性給予SD大鼠巴弗洛霉素A（Bafilomycin A1,Baf A1）對局部腦缺血再灌注損傷(middle cerebral artery occlusion-reperfusion,MCAO/R），是否神經(jīng)保護作用及初步機制研究.方法：健康雄性SD大鼠80只，隨機分為：假手術(shù)組（sham）、對照組（Saline）、氟西汀組（Fluo）和Baf A1組.Fluo組和Baf A1組大鼠于術(shù)前分別給予氟西汀混懸液(2.0mg-1kg-1d-1)灌胃和Baf A1(1.0mg-1kg-1d-1)，連續(xù)14d；sham組和Saline組均于術(shù)前14天開始給予等體積生理鹽水.再灌注24h后，進行神經(jīng)神經(jīng)功能相關(guān)檢測，并用TTC染色法計算腦梗死面積，并提取新鮮腦組織總蛋白采用Western blot檢測自噬相關(guān)蛋白Beclin 1的表達(dá).結(jié)果：Baf A1可顯著降低大鼠腦缺血再灌注后神經(jīng)功能損傷癥狀，減少腦梗死面積，并降低自噬相關(guān)蛋白Beclin 1的表達(dá).結(jié)論：Baf A1對大鼠腦缺血再灌注損傷有一定的保護作用，可能是通過降低自噬性死亡實現(xiàn)的.

Bafilomycin A1；腦缺血再灌注損傷（MCAO/R）；自噬；Beclin 1

腦缺血再灌注損傷是腦組織缺血后再次獲得血液供應(yīng)時引發(fā)的繼發(fā)性神經(jīng)結(jié)構(gòu)和功能損傷，主要與氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等有關(guān)[1,2].而近期研究表明，在腦缺血、炎癥反應(yīng)等應(yīng)激狀態(tài)下，神經(jīng)元內(nèi)Beclin1、LC3-Ⅱ等自噬相關(guān)蛋白表達(dá)增加，自噬溶酶體途徑被激活且參與了腦缺血再灌注損傷[3].研究表明，Baf A1對神經(jīng)功能損傷具有保護作用[4]，但其在腦缺血再灌注損傷中是否起到保護作用還未見報道，本實驗通過觀察Baf A1對腦缺血再灌注損傷的保護作用，通過檢測自噬相關(guān)蛋白Beclin 1的表達(dá)，探究其對自噬的影響，探討其對腦缺血再灌注損傷中的作用機制.

1 材料與方法

1.1 動物

雄性SD大鼠，體重280-300g（浙江大學(xué)實驗動物中心提供）,隨機分為sham組、Saline組、Fluo組和Baf A1組，每組各20只.

1.2 大鼠腦缺血再灌注損傷模型制備

采用改良longa．Zea氏線栓法[5]制備大鼠MCA閉塞的腦缺血再灌注模型.大鼠以10%水合氯醛(0.3ml/100g)腹腔注射麻醉，背位固定，備皮，消毒，行頸部正中切口，逐層分離組織，暴露左側(cè)頸內(nèi)動脈、頸外動脈、頸內(nèi)動脈，結(jié)扎CCA近端、ECA根部，于ICA處備線打一活結(jié).在左側(cè)ICA近顱端夾一微動脈夾，CCA結(jié)扎處遠(yuǎn)端剪一斜口，經(jīng)此插入備好的線栓，并將其緩慢經(jīng)ICA入顱至大腦前動脈(anterior cerebral artery，ACA)以阻斷MCA的血流.結(jié)束后立即結(jié)扎并縫合皮下組織和皮膚，酒精消毒.再灌注24h處死動物.假手術(shù)組只分離、暴露血管，不結(jié)扎頸總動脈及頸外動脈，不插栓線，余同以上兩組.

1.3 神經(jīng)功能評分及大鼠腦梗死面積檢測

采用改良Bederson評分法進行神經(jīng)功能缺損評分[6].后快速斷頭取腦.把腦組織迅速放入-20℃冰箱冷凍，切成2mm的冠狀切片浸入1%TTC溶液，37℃水浴鍋30分鐘，拍照，正常組織呈鮮紅色，梗死組織為白色，計算出梗死體積占大腦體積的百分比.

1.4 Western blot檢測

收集大鼠損傷側(cè)海馬組織，提取組織總蛋白，進行SDS-PAGE電泳.條件為電壓80V跑30min后換110V 70min、凝膠濃度12%和5%.轉(zhuǎn)膜后于5%脫脂奶粉室溫封閉1h，加入抗Beclin 1(1:1000)一抗孵育過夜，，洗膜后加入辣根過氧化物標(biāo)記的二抗(抗兔IgG，HRP，1：1000),顯影定影后用Image J分析蛋白相對表達(dá)量.

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

所有實驗均重復(fù)3次以上，數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism5. 0處理.結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，各組間計量資料的比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），用SNK-q檢驗法進行兩兩比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能評分

按照改良Bederson評分法，統(tǒng)計結(jié)果顯示（圖1）：再灌注24h后，Saline組評分較sham組顯著升高，提示腦缺血再灌注后神經(jīng)功能明顯受損.而Fluo組與Baf A1組評分明顯低于Saline組，F(xiàn)luo組與Baf A1組無明顯差異，提示BafA1明顯降低腦缺血再灌注后的神經(jīng)功能損傷.

圖1 缺血再灌注24h后神經(jīng)功能評分

2.2 腦梗死體積檢測

由圖2可知，sham組大鼠腦組織未形成明顯梗死灶；Saline組梗死體積明顯高于sham組，可見腦缺血再灌注后出現(xiàn)明顯的大腦梗死.而Fluo組與Baf A1組明顯低于Saline組，F(xiàn)luo組與Baf A1組無明顯差異，因此，Baf A1作用后明顯降低大鼠缺血再灌注后的大腦梗死體積.

圖2 缺血再灌注24h后腦梗死體積比

2.3 自噬相關(guān)蛋白Beclin 1表達(dá)水平檢測

免疫印跡結(jié)果（圖3），Saline組海馬區(qū)Beclin 1表達(dá)與sham組相比明顯增加，而Fluo組與Baf A1組較Saline組明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，F(xiàn)luo組與Baf A1組無明顯差異.

圖3 缺血再灌注24h后自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)

3 討論

Baf A1是一種來源于灰色鏈霉素的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，常通過抑制H+-ATP酶質(zhì)子泵抑制后期自噬[7]，并抑制腫瘤細(xì)胞生長和增殖[8].研究表明，Baf A1對神經(jīng)功能損傷具有保護作用，但其在腦缺血再灌注損傷中是否起到保護作用還未見報道.

本實驗通過預(yù)防性的應(yīng)用Baf A1觀測其對腦神經(jīng)的保護作用，結(jié)果顯示，與Saline組相比，Baf A1組大鼠神經(jīng)功能缺失顯著降低，表明Baf A1可明顯改善腦缺血再灌注損傷后大鼠的神經(jīng)功能缺損，發(fā)揮保護神經(jīng)的作用.同時，本實驗還采用了TTC染色法觀察梗死體積，與Saline組相比，Baf A1組腦缺血再灌注損傷的腦梗死體積明顯縮小，進一步表明Baf A1對腦缺血再灌注損傷具有保護作用.

目前關(guān)于腦缺血再灌注中的自噬調(diào)控作用和機制尚沒有一致的說法或解釋.有一部分學(xué)者認(rèn)為，藥物作用激活細(xì)胞自噬可以緩解或者減少再灌注后腦的梗死體積，簡言之，激活細(xì)胞自噬可以對腦缺血再灌注產(chǎn)生保護作用[9].Beclin 1是自噬起始的關(guān)鍵調(diào)控基因之一，其表達(dá)的多少可以反映自噬水平的高低.我們發(fā)現(xiàn)，Baf A1預(yù)處理，自噬相關(guān)蛋白Beclin 1表達(dá)下調(diào)，說明Baf A1可能通過抑制前期和后期自噬對大腦功能發(fā)揮保護作用.

綜上，Baf A1可明顯減輕腦缺血再灌注損傷，保護大腦功能，通過抑制細(xì)胞自噬可能是作用機制之一，但是具體的作用機制還有待于進一步的研究.

〔1〕Woodruff TM,Thundyil J,Tang SC,et al.Pathophysiology,treatment,and animal and cellular models of human ischemic stroke.Mol Neurodegener.2011,6(1):11.

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〔3〕Rami A,Langhagen A,Steiger S.Focal cerebral ischemia induces upregulation of Beclin1 and autophagylike cell death.Neurobiol Dis.2007;29:132-141.

〔4〕伏春艷，王志堅，沈忠飛，等.巴弗洛霉素A對抑郁大鼠行為及海馬腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的影響.四川大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2017（48）:50-53.

〔5〕LongaEZ，PR，CarlsonS．Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy．in rats．Stroke，1989; 20：84-89

〔6〕Bederson J B，Pitts L H，Tsuji M，et al.Rat middle cerebral artery occlusion：evaluation of the model and development of a neurologic examination.Stroke，1986;17：472-476.

〔7〕Mauvezin C,Neufeld TP.Bafilomycin A1 disrupts autophagic flux by inhibiting both V-ATPase-dependent acidification and Ca-P60A/SERCA-dependent autophagosome-lysosome fusio.Autophagy.2015;11:1437-8.

〔8〕Yuan N,Song L,Zhang SP,Lin WW,Cao Y,Xu F,Fang YX,Wang Z,Zhang H,Li X,Wang ZJ,Cai JY,Wang J, Zhang Y,Mao XL,Zhao WL,Hu SY,Chen SN,Wang JR.Bafilomycin A1 targets both autophagy and apoptosis pathways in pediatric B-cell acute lymphoblastic leukemia. Haematologica.2015;100:345-56.

〔9〕Zhao G,Zhang W,Li L Pinocembrin Protects the Brain against Ischemia-Reperfusion Injury and Reverses the Autophagy Dysfunction in the Penumbra Area. Molecules.2014,19(10):15786-98.

R651

：A

：1673-260X（2017）03-0042-02

2016-11-24

浙江省實驗動物科技計劃項目（2014C37019）；嘉興市科技局項目（2015AY23066）；嘉興學(xué)院校SRT計劃項目（SRT2016C097）

王志堅，女，漢，1987-07，碩士，嘉興學(xué)院實驗師，研究方向：腦缺血再灌注損傷