趙冉冉（上海海事大學附屬北蔡高級中學上海 201204）

探究生物種間關系的實驗活動

趙冉冉（上海海事大學附屬北蔡高級中學上海 201204）

利用釀酒酵母與灰霉菌競爭營養(yǎng)物質的機理來防治紅辣椒灰霉病，從而探討三種生物的種間關系，以加深學生對生物種間關系的理解，豐富實驗課的教學。

種間關系 灰霉菌 釀酒酵母 植物真菌病害 生物防治

文件編號：1003－7586（2017）01－0056－02

生物的種間關系是一個非常有趣的知識點，學生大都有一定的感性認識。人教版高中生物《必修3：穩(wěn)態(tài)與環(huán)境》教科書中，給出了生物種間關系的一些基本概念，并列舉了對應的例子，但例子比較簡單，不利于學生積極性的調動以及手腦結合的運用。為了加深學生對該知識點的理解，增強動手能力，下面以實驗“釀酒酵母對紅辣椒灰霉病的生物防治作用”為例，探討三種生物（紅辣椒、灰霉菌和釀酒酵母）的種間關系。本探究實驗不僅可以彌補該知識點缺乏相關配套實驗的不足，同時還可以作為學生進行探究性學習的一個載體。

1 實驗原理

灰霉菌是一種廣寄主性的、能夠引起多種蔬菜和水果灰霉病的壞死營養(yǎng)型病原真菌。在日常生活中遇到的果蔬長毛，多數是受到了灰霉菌的侵染。研究表明，灰霉菌分生孢子萌發(fā)需要適當的營養(yǎng)條件，植物表面水分中的營養(yǎng)物質可以被灰霉菌和拮抗菌所共用，從而使灰霉菌所能利用的營養(yǎng)物質濃度降低，使其芽管生長速度減慢。酵母菌是灰霉菌的主要拮抗菌，如釀酒酵母菌對灰霉菌就有很好的拮抗作用，可用于灰霉病的生物防治。

2 材料用具

灰霉菌、釀酒酵母：實驗前均于4℃下保存于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基上。

紅辣椒：選用外觀整齊、大小一致、無病蟲害、無機械損傷，未用化學或生物藥劑處理過的果實為實驗材料，實驗前用無菌水洗凈備用。

葡萄糖溶液、質量分數為0.5%的NaCl溶液、體積分數為70%的乙醇溶液、無菌水、PDA培養(yǎng)基、培養(yǎng)皿、試管、無菌打孔器、接種環(huán)、移液槍、量筒、光學顯微鏡、恒溫培養(yǎng)箱、塑料袋、直尺。

3 方法步驟

3.1 釀酒酵母對灰霉菌拮抗作用的體外生物防治實驗

3.1.1 制備PDA有孔培養(yǎng)基

將紅辣椒汁加入融化狀態(tài)的PDA培養(yǎng)基中（每毫升培養(yǎng)基含0.15 g紅辣椒汁），混勻后倒入無菌培養(yǎng)皿中，冷卻至凝固；然后用無菌打孔器在凝固的平板中央打一個直徑4 mm的孔。

3.1.2 配制菌懸液

將釀酒酵母和灰霉菌于28℃下分別培養(yǎng)于PDA斜面上48 h和72 h。用接種環(huán)挑取釀酒酵母菌種，以無菌水稀釋，分別制成濃度為5×106、5×107、5×108、5× 109細胞/mL的釀酒酵母懸浮液；同樣方法配制灰霉菌孢子懸浮液，濃度為5×104孢子/mL。

3.1.3 接種觀察

將20 μL濃度分別為5×106、5×107、5×108、5×109細胞/mL的釀酒酵母懸浮液依次注入到4個PDA平板的孔中，保持1～2 h，使其充分滲入，之后同樣位置注入20mL濃度為5×104作孢子/mL的灰霉菌懸液為實驗組(b～e)；在另一個平板的孔中只注入20 μL濃度為5×104孢子/mL的灰霉菌孢子懸浮液，并充分滲入，作為對照組(a)。28℃下培養(yǎng)5 d，觀察釀酒酵母和灰霉菌的生長情況，記錄灰霉菌菌落直徑。

3.2 釀酒酵母對灰霉菌拮抗作用的體內生物防治實驗

3.2.1 果實處理

將紅辣椒果實于質量分數為0.5%的NaCl溶液中浸泡5 min，以除去表皮污物；然后用無菌水洗凈，空氣干燥后，用體積分數為70%的乙醇溶液處理；最后用無菌打孔器將果實表皮打上傷口（傷口直徑4 mm，深度1 mm），一個果實一個傷口。

3.2.2 接種觀察

將20 μL濃度分別為5×106、5×107、5×108、5×109細胞/mL的釀酒酵母懸浮液依次注入到果實傷口處，1～2 h之后，同樣位置注入20 μL濃度為5×104孢子/mL的灰霉菌懸浮液，作為實驗組(c～f)。對照組a只注入20 μL濃度為5×109細胞/mL的釀酒酵母懸浮液，對照組b只注入20 μL濃度為5×104孢子/mL的灰霉菌孢子懸浮液。將處理后的果實裝入塑料袋，28℃下密封避光保存，5 d后記錄果實表面病灶直徑（病灶直徑用以衡量紅辣椒果實灰霉病的嚴重程度）。

3.3 營養(yǎng)競爭實驗

取5支試管，各加入2 mL 0.15 g/mL的紅辣椒汁；在其中3支試管中依次加入2mL 0.1、0.5、1.0g/mL的葡萄糖溶液，再將50 μL濃度為5×109細胞/mL的釀酒酵母懸浮液和50 μL濃度為5×104孢子/mL的灰霉菌孢子懸浮液共同接種于以上試管中，記為實驗組（c～e）；余下2支試管，其中1支加入50 μL濃度為5×109細胞/mL的釀酒酵母懸浮液和50 μL濃度為5× 104孢子/mL的灰霉菌孢子懸浮液，記為對照組b；另1支只加入50 μL濃度為5×104孢子/mL的灰霉菌孢子懸浮液，記為對照組a。所有試管均于28℃下培養(yǎng)16 h。顯微觀察，計算孢子萌發(fā)率（灰霉菌每復制1次至少有50個孢子）。

4 實驗結果

4.1 體外實驗中不同濃度釀酒酵母懸浮液對灰霉菌生長的抑制作用

用體外平板實驗來確定釀酒酵母抑制作用的最適濃度。對照組平板（a）上灰霉菌菌落的直徑為4.6 cm；實驗組平板（b～e）上灰霉菌菌落的直徑隨釀酒酵母懸浮液濃度的升高(5×106、5×107、5×108、5×109細胞/mL)而逐漸減小，從3.7 cm降至2.2 cm。

4.2 體內實驗中不同濃度釀酒酵母懸浮液對灰霉菌生長的抑制作用

體內實驗的結果顯示出類似的酵母懸浮液濃度對灰霉菌生長的抑制作用。對照組（b）辣椒果實的病灶直徑為1.3 cm；實驗組（c-f）果實病灶直徑隨釀酒酵母懸浮液濃度的升高(5×106、5×107、5×108、5×109細胞/mL)而逐漸減小，從1.1 cm降到0.6 cm。

圖1所示病變區(qū)域一開始有水樣點，然后水樣點逐漸擴散成灰棕色、質地如海綿的區(qū)域，表面覆有灰霉菌菌絲和孢子。釀酒酵母生長速度越快，就越干擾灰霉菌的生長，并競爭營養(yǎng)物質。然而，只接種釀酒酵母的紅辣椒果實沒有出現病變（圖1a），這就表明，釀酒酵母不影響紅辣椒活細胞的生長，但是它會在植物受傷部位生長。

4.3 灰霉菌和釀酒酵母之間的營養(yǎng)競爭

圖1 不同濃度釀酒酵母懸浮液對紅辣椒果實病灶直徑的影響

28 ℃條件下，顯微觀察到對照組a灰霉菌分生孢子萌發(fā)率為91.2%，對照組b的萌發(fā)率為24.6%。結果表明，酵母菌干擾灰霉菌孢子萌發(fā)的過程。然而，孢子萌發(fā)率在葡萄糖質量濃度為0.1 g/mL時為35.7%，當濃度上升到0.5 g/mL時，萌發(fā)率為56.2%，上升到1.0 g/mL時，萌發(fā)率為70.5%。這表明，釀酒酵母抑制灰霉菌生長的能力隨葡萄糖濃度升高而降低。

5 結論與建議

灰霉菌引起紅辣椒果實病變，表明了兩者的寄生關系。釀酒酵母利用紅辣椒果實的營養(yǎng)物質，保護其細胞免受病原菌感染，說明了兩者的互利共生關系。釀酒酵母通過爭奪養(yǎng)分而抑制灰霉菌孢子萌發(fā)，可解釋兩者的競爭關系，但二者對養(yǎng)分的爭奪并不是唯一的機制，釀酒酵母也可產生酒精和毒素殺死灰霉菌，灰霉菌也能產生抗真菌劑殺死釀酒酵母。

筆者建議學生在學校實驗室中進行該實驗，實驗過程中所使用到的灰霉菌和釀酒酵母對學生沒有危害。在實驗材料的選取上，學生可以嘗試使用番石榴、番茄或蘋果進行實驗，將會得到和用紅辣椒做實驗相同的結果。該實驗的進行不僅可以使學生了解到生物的3個主要種間關系（寄生、競爭、互利共生），并且還可以給學生一個批判性思考低等生物（微生物）和高等生物（植物）之間關系的機會。

［1］孟祥東,傅俊范,嚴雪瑞等.灰霉病菌（Botrytis cinerea）生物防治研究進展[J].沈陽農業(yè)大學學報,2003,34(6):472-475.

［2］Arun Chanchaichaovivat a,Bhinyo Panijpan a&Pintip Ruenwongsa a.Yeast biocontrol of a fungal plant disease:a model for studying organism interrelationships[J].The Journal of Biological Education.2008,43(1):36-40.

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