趙冉冉（上海海事大學(xué)附屬北蔡高級中學(xué)上海 201204）

探究生物種間關(guān)系的實(shí)驗(yàn)活動(dòng)

趙冉冉（上海海事大學(xué)附屬北蔡高級中學(xué)上海 201204）

利用釀酒酵母與灰霉菌競爭營養(yǎng)物質(zhì)的機(jī)理來防治紅辣椒灰霉病，從而探討三種生物的種間關(guān)系，以加深學(xué)生對生物種間關(guān)系的理解，豐富實(shí)驗(yàn)課的教學(xué)。

種間關(guān)系 灰霉菌 釀酒酵母 植物真菌病害 生物防治

文件編號：1003－7586（2017）01－0056－02

生物的種間關(guān)系是一個(gè)非常有趣的知識(shí)點(diǎn)，學(xué)生大都有一定的感性認(rèn)識(shí)。人教版高中生物《必修3：穩(wěn)態(tài)與環(huán)境》教科書中，給出了生物種間關(guān)系的一些基本概念，并列舉了對應(yīng)的例子，但例子比較簡單，不利于學(xué)生積極性的調(diào)動(dòng)以及手腦結(jié)合的運(yùn)用。為了加深學(xué)生對該知識(shí)點(diǎn)的理解，增強(qiáng)動(dòng)手能力，下面以實(shí)驗(yàn)“釀酒酵母對紅辣椒灰霉病的生物防治作用”為例，探討三種生物（紅辣椒、灰霉菌和釀酒酵母）的種間關(guān)系。本探究實(shí)驗(yàn)不僅可以彌補(bǔ)該知識(shí)點(diǎn)缺乏相關(guān)配套實(shí)驗(yàn)的不足，同時(shí)還可以作為學(xué)生進(jìn)行探究性學(xué)習(xí)的一個(gè)載體。

1 實(shí)驗(yàn)原理

灰霉菌是一種廣寄主性的、能夠引起多種蔬菜和水果灰霉病的壞死營養(yǎng)型病原真菌。在日常生活中遇到的果蔬長毛，多數(shù)是受到了灰霉菌的侵染。研究表明，灰霉菌分生孢子萌發(fā)需要適當(dāng)?shù)臓I養(yǎng)條件，植物表面水分中的營養(yǎng)物質(zhì)可以被灰霉菌和拮抗菌所共用，從而使灰霉菌所能利用的營養(yǎng)物質(zhì)濃度降低，使其芽管生長速度減慢。酵母菌是灰霉菌的主要拮抗菌，如釀酒酵母菌對灰霉菌就有很好的拮抗作用，可用于灰霉病的生物防治。

2 材料用具

灰霉菌、釀酒酵母：實(shí)驗(yàn)前均于4℃下保存于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基上。

紅辣椒：選用外觀整齊、大小一致、無病蟲害、無機(jī)械損傷，未用化學(xué)或生物藥劑處理過的果實(shí)為實(shí)驗(yàn)材料，實(shí)驗(yàn)前用無菌水洗凈備用。

葡萄糖溶液、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的NaCl溶液、體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液、無菌水、PDA培養(yǎng)基、培養(yǎng)皿、試管、無菌打孔器、接種環(huán)、移液槍、量筒、光學(xué)顯微鏡、恒溫培養(yǎng)箱、塑料袋、直尺。

3 方法步驟

3.1 釀酒酵母對灰霉菌拮抗作用的體外生物防治實(shí)驗(yàn)

3.1.1 制備PDA有孔培養(yǎng)基

將紅辣椒汁加入融化狀態(tài)的PDA培養(yǎng)基中（每毫升培養(yǎng)基含0.15 g紅辣椒汁），混勻后倒入無菌培養(yǎng)皿中，冷卻至凝固；然后用無菌打孔器在凝固的平板中央打一個(gè)直徑4 mm的孔。

3.1.2 配制菌懸液

將釀酒酵母和灰霉菌于28℃下分別培養(yǎng)于PDA斜面上48 h和72 h。用接種環(huán)挑取釀酒酵母菌種，以無菌水稀釋，分別制成濃度為5×106、5×107、5×108、5× 109細(xì)胞/mL的釀酒酵母懸浮液；同樣方法配制灰霉菌孢子懸浮液，濃度為5×104孢子/mL。

3.1.3 接種觀察

將20 μL濃度分別為5×106、5×107、5×108、5×109細(xì)胞/mL的釀酒酵母懸浮液依次注入到4個(gè)PDA平板的孔中，保持1～2 h，使其充分滲入，之后同樣位置注入20mL濃度為5×104作孢子/mL的灰霉菌懸液為實(shí)驗(yàn)組(b～e)；在另一個(gè)平板的孔中只注入20 μL濃度為5×104孢子/mL的灰霉菌孢子懸浮液，并充分滲入，作為對照組(a)。28℃下培養(yǎng)5 d，觀察釀酒酵母和灰霉菌的生長情況，記錄灰霉菌菌落直徑。

3.2 釀酒酵母對灰霉菌拮抗作用的體內(nèi)生物防治實(shí)驗(yàn)

3.2.1 果實(shí)處理

將紅辣椒果實(shí)于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的NaCl溶液中浸泡5 min，以除去表皮污物；然后用無菌水洗凈，空氣干燥后，用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液處理；最后用無菌打孔器將果實(shí)表皮打上傷口（傷口直徑4 mm，深度1 mm），一個(gè)果實(shí)一個(gè)傷口。

3.2.2 接種觀察

將20 μL濃度分別為5×106、5×107、5×108、5×109細(xì)胞/mL的釀酒酵母懸浮液依次注入到果實(shí)傷口處，1～2 h之后，同樣位置注入20 μL濃度為5×104孢子/mL的灰霉菌懸浮液，作為實(shí)驗(yàn)組(c～f)。對照組a只注入20 μL濃度為5×109細(xì)胞/mL的釀酒酵母懸浮液，對照組b只注入20 μL濃度為5×104孢子/mL的灰霉菌孢子懸浮液。將處理后的果實(shí)裝入塑料袋，28℃下密封避光保存，5 d后記錄果實(shí)表面病灶直徑（病灶直徑用以衡量紅辣椒果實(shí)灰霉病的嚴(yán)重程度）。

3.3 營養(yǎng)競爭實(shí)驗(yàn)

取5支試管，各加入2 mL 0.15 g/mL的紅辣椒汁；在其中3支試管中依次加入2mL 0.1、0.5、1.0g/mL的葡萄糖溶液，再將50 μL濃度為5×109細(xì)胞/mL的釀酒酵母懸浮液和50 μL濃度為5×104孢子/mL的灰霉菌孢子懸浮液共同接種于以上試管中，記為實(shí)驗(yàn)組（c～e）；余下2支試管，其中1支加入50 μL濃度為5×109細(xì)胞/mL的釀酒酵母懸浮液和50 μL濃度為5× 104孢子/mL的灰霉菌孢子懸浮液，記為對照組b；另1支只加入50 μL濃度為5×104孢子/mL的灰霉菌孢子懸浮液，記為對照組a。所有試管均于28℃下培養(yǎng)16 h。顯微觀察，計(jì)算孢子萌發(fā)率（灰霉菌每復(fù)制1次至少有50個(gè)孢子）。

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4.1 體外實(shí)驗(yàn)中不同濃度釀酒酵母懸浮液對灰霉菌生長的抑制作用

用體外平板實(shí)驗(yàn)來確定釀酒酵母抑制作用的最適濃度。對照組平板（a）上灰霉菌菌落的直徑為4.6 cm；實(shí)驗(yàn)組平板（b～e）上灰霉菌菌落的直徑隨釀酒酵母懸浮液濃度的升高(5×106、5×107、5×108、5×109細(xì)胞/mL)而逐漸減小，從3.7 cm降至2.2 cm。

4.2 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中不同濃度釀酒酵母懸浮液對灰霉菌生長的抑制作用

體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示出類似的酵母懸浮液濃度對灰霉菌生長的抑制作用。對照組（b）辣椒果實(shí)的病灶直徑為1.3 cm；實(shí)驗(yàn)組（c-f）果實(shí)病灶直徑隨釀酒酵母懸浮液濃度的升高(5×106、5×107、5×108、5×109細(xì)胞/mL)而逐漸減小，從1.1 cm降到0.6 cm。

圖1所示病變區(qū)域一開始有水樣點(diǎn)，然后水樣點(diǎn)逐漸擴(kuò)散成灰棕色、質(zhì)地如海綿的區(qū)域，表面覆有灰霉菌菌絲和孢子。釀酒酵母生長速度越快，就越干擾灰霉菌的生長，并競爭營養(yǎng)物質(zhì)。然而，只接種釀酒酵母的紅辣椒果實(shí)沒有出現(xiàn)病變（圖1a），這就表明，釀酒酵母不影響紅辣椒活細(xì)胞的生長，但是它會(huì)在植物受傷部位生長。

4.3 灰霉菌和釀酒酵母之間的營養(yǎng)競爭

圖1 不同濃度釀酒酵母懸浮液對紅辣椒果實(shí)病灶直徑的影響

28 ℃條件下，顯微觀察到對照組a灰霉菌分生孢子萌發(fā)率為91.2%，對照組b的萌發(fā)率為24.6%。結(jié)果表明，酵母菌干擾灰霉菌孢子萌發(fā)的過程。然而，孢子萌發(fā)率在葡萄糖質(zhì)量濃度為0.1 g/mL時(shí)為35.7%，當(dāng)濃度上升到0.5 g/mL時(shí)，萌發(fā)率為56.2%，上升到1.0 g/mL時(shí)，萌發(fā)率為70.5%。這表明，釀酒酵母抑制灰霉菌生長的能力隨葡萄糖濃度升高而降低。

5 結(jié)論與建議

灰霉菌引起紅辣椒果實(shí)病變，表明了兩者的寄生關(guān)系。釀酒酵母利用紅辣椒果實(shí)的營養(yǎng)物質(zhì)，保護(hù)其細(xì)胞免受病原菌感染，說明了兩者的互利共生關(guān)系。釀酒酵母通過爭奪養(yǎng)分而抑制灰霉菌孢子萌發(fā)，可解釋兩者的競爭關(guān)系，但二者對養(yǎng)分的爭奪并不是唯一的機(jī)制，釀酒酵母也可產(chǎn)生酒精和毒素殺死灰霉菌，灰霉菌也能產(chǎn)生抗真菌劑殺死釀酒酵母。

筆者建議學(xué)生在學(xué)校實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行該實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)過程中所使用到的灰霉菌和釀酒酵母對學(xué)生沒有危害。在實(shí)驗(yàn)材料的選取上，學(xué)生可以嘗試使用番石榴、番茄或蘋果進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，將會(huì)得到和用紅辣椒做實(shí)驗(yàn)相同的結(jié)果。該實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行不僅可以使學(xué)生了解到生物的3個(gè)主要種間關(guān)系（寄生、競爭、互利共生），并且還可以給學(xué)生一個(gè)批判性思考低等生物（微生物）和高等生物（植物）之間關(guān)系的機(jī)會(huì)。

［1］孟祥東,傅俊范,嚴(yán)雪瑞等.灰霉病菌（Botrytis cinerea）生物防治研究進(jìn)展[J].沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2003,34(6):472-475.

［2］Arun Chanchaichaovivat a,Bhinyo Panijpan a&Pintip Ruenwongsa a.Yeast biocontrol of a fungal plant disease:a model for studying organism interrelationships[J].The Journal of Biological Education.2008,43(1):36-40.

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