劉一楊，趙方琳，儲(chǔ)金言，趙雪江，王秋雨

(1.遼寧省實(shí)驗(yàn)中學(xué) 1715班,遼寧 沈陽(yáng) 110841; 2.遼寧大學(xué) 生命科學(xué)院,遼寧 沈陽(yáng) 110036)

一種物理調(diào)控的表達(dá)有機(jī)磷降解酶opdA智能基因工程菌的構(gòu)建

劉一楊1，趙方琳1，儲(chǔ)金言1，趙雪江1，王秋雨2*

(1.遼寧省實(shí)驗(yàn)中學(xué) 1715班,遼寧 沈陽(yáng) 110841; 2.遼寧大學(xué) 生命科學(xué)院,遼寧 沈陽(yáng) 110036)

針對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥在環(huán)境和果蔬表面殘留日趨嚴(yán)重危害人體健康的問(wèn)題，設(shè)計(jì)并構(gòu)建一種可以通過(guò)物理?xiàng)l件控制的智能基因工程菌，該工程菌可在溫度敏感性RNA的調(diào)控下，在高于設(shè)定溫度條件下，表達(dá)有機(jī)磷農(nóng)藥降解酶A并分泌到細(xì)胞外，降解環(huán)境中的有機(jī)磷農(nóng)藥.并通過(guò)RecA(SOS)啟動(dòng)子控制，經(jīng)接收紫外光照射后啟動(dòng)自殺程序，避免攜帶有抗生素抗性基因的工程菌擴(kuò)散對(duì)環(huán)境造成影響.該設(shè)計(jì)可用于在外界環(huán)境或果蔬表面安全地進(jìn)行有機(jī)磷農(nóng)藥的清除，達(dá)到對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥污染的環(huán)境修復(fù)和維護(hù)食品安全提供健康果蔬的目的.

表達(dá)載體；有機(jī)磷降解酶A；自殺基因ccdB；智能基因工程菌

0 引言

隨著我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的高速發(fā)展，農(nóng)藥的使用量呈快速遞增趨勢(shì).農(nóng)藥的廣泛使用促進(jìn)了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)發(fā)展，但過(guò)量施用農(nóng)藥的大量殘留對(duì)生態(tài)環(huán)境和農(nóng)產(chǎn)品也造成了嚴(yán)重污染，威脅著食品和生態(tài)安全，危害人民的身體健康.近年來(lái)，農(nóng)藥殘留超標(biāo)已經(jīng)嚴(yán)重影響我國(guó)水果、蔬菜等農(nóng)產(chǎn)品的產(chǎn)品質(zhì)量，降低了我國(guó)農(nóng)產(chǎn)品的國(guó)際市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力，影響了我國(guó)農(nóng)產(chǎn)品的出口貿(mào)易，不利于國(guó)民經(jīng)濟(jì)增長(zhǎng)和社會(huì)發(fā)展[1].在眾多農(nóng)藥品種中，有機(jī)磷農(nóng)藥(Organophosphorus Pesticides，OPs)是一種廣泛使用的殺蟲(chóng)劑，約占全世界殺蟲(chóng)劑使用量的34%[2]，有機(jī)磷農(nóng)藥大多為磷酸酯或硫代磷酸酯類化合物，在水中的溶解性差，易溶于有機(jī)溶劑[3].

有機(jī)磷農(nóng)藥種類很多,根據(jù)其毒性強(qiáng)弱分為高毒、中毒、低毒三類[4].高毒類有機(jī)磷農(nóng)藥少量接觸即可中毒,低毒類大量進(jìn)入體內(nèi)亦可發(fā)生危害，一般濃度的有機(jī)磷農(nóng)藥由消化道進(jìn)入、呼吸道吸入或皮膚吸收，中毒癥狀重，發(fā)病急.如吸入大量或濃度過(guò)高的有機(jī)磷農(nóng)藥，可在5分鐘內(nèi)發(fā)病,迅速致死[5].據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全世界每年至少發(fā)生50萬(wàn)例有機(jī)磷農(nóng)藥中毒事件，死亡11.5萬(wàn)人[6].另外，約85%以上的癌癥、80余種疾病與有機(jī)磷農(nóng)藥殘留有關(guān)[5-6].

有機(jī)磷農(nóng)藥降解酶目前已被公認(rèn)為是消除農(nóng)藥殘留的最具潛力的新方法.目前，許多酶已經(jīng)被鑒定出可用于降解有機(jī)磷酸酯農(nóng)藥，其中來(lái)源于放射形土壤桿菌屬Agrobacterium radiobacter P230的有機(jī)磷降解酶(opdA)具有更加廣泛的底物與更高的酶催化效率[7,8].近年來(lái)，對(duì)有opdA酶結(jié)構(gòu)和功能的研究取得了較大的進(jìn)展，已經(jīng)進(jìn)入分子水平[9].這使得通過(guò)基因工程和蛋白工程改良o(jì)pdA酶的性質(zhì)，研制出符合不同應(yīng)用領(lǐng)域要求的有機(jī)磷降解酶產(chǎn)品成為可能.

目前已經(jīng)報(bào)道的opdA酶基因工程菌[10-11]，但多為胞內(nèi)形式表達(dá)，需要破碎細(xì)胞壁進(jìn)行提取，且表達(dá)過(guò)程中易形成包涵體，需要復(fù)雜的變性復(fù)性過(guò)程，只能用于制備粗酶制劑.并且，目前報(bào)道的基因工程菌在表達(dá)opdA酶的過(guò)程中需要添加化學(xué)誘導(dǎo)物，另外基因工程菌所含有的抗生素抗性基因也可能對(duì)環(huán)境造成影響[10,12]，不能直接用于環(huán)境的修復(fù)和果蔬的解毒實(shí)際應(yīng)用.

本研究構(gòu)建的有機(jī)磷降解酶opdA基因工程菌，可利用ompA分泌肽結(jié)構(gòu)將表達(dá)的opdA酶蛋白分泌至宿主細(xì)胞外，以實(shí)現(xiàn)對(duì)環(huán)境中和果蔬表面有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的生物降解.為了控制opdA酶蛋白的表達(dá)，本研究引入了強(qiáng)啟動(dòng)子控制下的RNA溫度計(jì)元件，當(dāng)環(huán)境溫度低于32 ℃時(shí)opdA的表達(dá)被關(guān)閉，而當(dāng)環(huán)境溫度上升至32 ℃以上時(shí)表達(dá)被啟動(dòng)，避免了化學(xué)誘導(dǎo)物的使用.另外，為了控制具有抗生素抗性的基因工程菌在環(huán)境中的轉(zhuǎn)播，本文引入了RceA啟動(dòng)子控制下的ccdB自殺基因，當(dāng)菌體收到紫外光線照射時(shí)RecA被激活，ccdB自殺基因表達(dá)，可導(dǎo)致宿主菌死亡.

1 材料方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌菌株DH5α，大腸桿菌菌株BL21(DE3)購(gòu)自于天根生化科技(北京)有限公司；含opdA編碼基因的核酸片段1117369，含RceA(SOS)啟動(dòng)子基因的核酸片段11200363購(gòu)自于美國(guó)Integrated DNA Technology(IDT)公司，表達(dá)載體質(zhì)粒pSB1K3由美國(guó)IGEM(International Genetically Engineered Machine Competition)組織惠贈(zèng).

1.1.2 試劑和工具酶

T4 DNA連接酶、Tag DNA聚合酶、Pyrobest DNA聚合酶、核酸限制性內(nèi)切酶(EcoR I，Hind III，Spe I，Xba I和Pst I)、不同分子量DNA電泳Marker等均購(gòu)自Takara大連公司；卡那霉素為Sigma公司產(chǎn)品；酵母提取物和胰蛋白胨購(gòu)自O(shè)XOID公司、瓊脂糖膠回收試劑盒、質(zhì)粒DNA提取試劑盒購(gòu)于北京博大泰克生物技術(shù)有限公司；引物合成、DNA片段合成和DNA測(cè)序均由北京華大技術(shù)服務(wù)公司(BGI)完成；其他化學(xué)試劑均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)的分析純?cè)噭?

1.2 方法

1.2.1 表達(dá)及調(diào)控元件的基因結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)

為了實(shí)現(xiàn)本研究的預(yù)期目標(biāo)，本文所設(shè)計(jì)表達(dá)及調(diào)控元件的基因結(jié)構(gòu)如圖1所示.

圖1 設(shè)計(jì)的表達(dá)及調(diào)控元件基因結(jié)構(gòu)示意圖

本研究使用強(qiáng)啟動(dòng)子啟動(dòng)下游RNA的轉(zhuǎn)錄，當(dāng)環(huán)境溫度低于32 ℃時(shí)，轉(zhuǎn)錄出來(lái)的溫度敏感RNA片段退火成環(huán)狀發(fā)夾結(jié)構(gòu)，使核糖體RNA不能結(jié)合，翻譯過(guò)程被終止；而當(dāng)環(huán)境溫度上升至32 ℃ 以上時(shí)，溫度敏感RNA片段舒展為線性結(jié)構(gòu)，核糖體RNA可以結(jié)合，使得下游序列可以翻譯成為完整的目的蛋白質(zhì)分子(ompA分泌肽連接opdA有機(jī)磷降解酶)；翻譯出的opdA有機(jī)磷降解酶蛋白在ompA分泌肽引導(dǎo)下可被轉(zhuǎn)運(yùn)至宿主菌細(xì)胞外，降解宿主菌細(xì)胞外界環(huán)境中的有機(jī)磷農(nóng)藥.降解完成后，在紫外線照射下，RecA啟動(dòng)子被激活，啟動(dòng)下游ccdB自殺基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，可導(dǎo)致宿主菌死亡，以阻止該工程菌在環(huán)境中的擴(kuò)散.各表達(dá)及調(diào)控元件的基因序列如表1所示.

表1 各表達(dá)及調(diào)控元件的基因序列

1.2.2 DNA片段和PCR引物合成

按照設(shè)計(jì)，委托北京華大技術(shù)服務(wù)公司(BGI)合成兩個(gè)DNA片段，分別為:frag1片段(強(qiáng)啟動(dòng)子+溫度敏感RNA+ompA基因)；frag4片段(ccdB編碼基因).本文中所用的全部PCR引物如表2所示.

表2 本文中所用的全部PCR引物序列

注下劃線部分為限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)

1.2.3 各基因片段PCR擴(kuò)增

利用各自的PCR特異性引物，使用相應(yīng)的DNA模板，擴(kuò)增出4個(gè)DNA片段.擴(kuò)增各片段所用的引物及模板分配如表3所示.

表3 擴(kuò)增各基因片段所用的PCR引物和模板

PCR反應(yīng)體系為：10×Pyrobest DNA聚合酶 buffer 5 μL，Pyrobest DNA聚合酶 2 U，dNTP 250 μmol，上下游PCR引物各25 pmol，模板DNA 0.1 μg，無(wú)菌超純水補(bǔ)齊體積至50 μL.PCR反應(yīng)條件為：95 ℃變性5 min；95 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃不同時(shí)間(F1，F(xiàn)3和F4片段30 s；F2片段90 s)，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，10 ℃保存.各PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，切膠回收純化各目的條帶.

1.2.4 第一輪片段連接

將以上切膠回收純化的4個(gè)PCR產(chǎn)物，經(jīng)Hind III核酸限制性內(nèi)切酶充分消化，再次經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收純化.將純化后的F1和F2片段等摩爾比混合，在T4 DNA連接酶作用下充分連接過(guò)夜；以此連接產(chǎn)物為PCR模板，分別以F1-f和F2-r為上下游引物，以Pyrobest DNA聚合酶進(jìn)行PCR反應(yīng)；反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，切膠回收純化約1 260 bp的目的條帶，即為F1+2片段.同樣方法，將純化后的F3和F4片段等摩爾比混合，在T4 DNA連接酶作用下充分連接過(guò)夜；以此連接產(chǎn)物為PCR模板，分別以F3-f和F4-r為上下游引物，以Pyrobest DNA聚合酶進(jìn)行PCR反應(yīng)；反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，切膠回收純化約560 bp的目的條帶，即為F3+4片段.

1.2.5 第二輪片段連接

將以上切膠回收純化的F1+2片段的PCR產(chǎn)物，經(jīng)Spe I核酸限制性內(nèi)切酶充分消化，再次經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳切膠回收純化；將以上切膠回收純化的F3+4片段的PCR產(chǎn)物，經(jīng)Xba I核酸限制性內(nèi)切酶充分消化，再次經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳切膠回收純化.將純化后的F1+2片段和F3+4片段等摩爾比混合，在T4 DNA連接酶作用下充分連接過(guò)夜；以此連接產(chǎn)物為PCR模板，分別以F1-f和F4-r為上下游引物，以Pyrobest DNA聚合酶進(jìn)行PCR反應(yīng)；反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，切膠回收純化約1 820 bp的目的條帶，即為F1+2+3+4片段.

1.2.6 連接表達(dá)載體

將以上切膠回收的F1+2+3+4片段，經(jīng)EcoR I和Pst I雙核酸內(nèi)切酶充分消化，并再次純化，純化產(chǎn)物與經(jīng)同樣EcoR I和Pst I雙核酸內(nèi)切酶處理的表達(dá)載體質(zhì)粒pSB1K3片段，以摩爾比3∶1充分混合，并以T4 DNA連接酶16 ℃過(guò)夜連接.連接產(chǎn)物通過(guò)CaCl2轉(zhuǎn)化法[6]轉(zhuǎn)入大腸桿菌菌株E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)含有那卡霉素(60μg/mL)的LB平板過(guò)夜培養(yǎng)，然后挑取單克隆，并以引物F1-f和F4-r進(jìn)行菌落PCR，PCR擴(kuò)增參數(shù)：95 ℃變性5min；95 ℃30s，65 ℃ 30s，72 ℃90s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，10 ℃保存.鑒定得到正確的重組子，經(jīng)Sanger終止法測(cè)序進(jìn)一步驗(yàn)證后得到重組表達(dá)載體pSB1K3-F1+2+3+4.

2 結(jié)果

2.1 各片段的PCR擴(kuò)增結(jié)果

根據(jù)各個(gè)片段序列設(shè)計(jì)的PCR引物，成功的對(duì)四個(gè)不同片段進(jìn)行了PCR擴(kuò)增(圖2)，其中F1片段(強(qiáng)啟動(dòng)子+溫度敏感RNA+ompA基因)，F(xiàn)3片段(含RceA啟動(dòng)子基因)，F(xiàn)4片段(含ccdB編碼基因)均表現(xiàn)出較高的擴(kuò)增效率，并且只擴(kuò)增出唯一的目的條帶，表明引物的特異性良好.而F2(含opdA編碼基因)片段的擴(kuò)增產(chǎn)物中，出現(xiàn)了三條不同大小的條帶，說(shuō)明引物與非目的序列之間存在一定程度的非特異性結(jié)合，經(jīng)多次優(yōu)化PCR反應(yīng)條件，非目的條帶仍然存在，但長(zhǎng)度為1 058 bp的目的條帶亮度非常明顯，為主要擴(kuò)增產(chǎn)物，且與非目的條帶之間在1%濃度下的瓊脂糖凝膠電泳圖上相距較大距離，易于通過(guò)切膠回收的方式剝離純化出來(lái).切膠回收純化后的產(chǎn)物再經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，表明各目的條帶獲得純化，且具有較高收率(圖3).

泳道1、11：DL2 000 DNA分子量Markr(由上至下分別為2 000、1 000、750、500、250、100 bp)；泳道2、3：片段F1的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；泳道4、5：片段F3的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；泳道6、7：片段F4的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；泳道8：不添加模板DNA的F2陰性對(duì)照PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；泳道9、10：片段F2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物.

圖2 4個(gè)片段的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2 第一輪片段連接結(jié)果

以F1片段和F2片段的連接產(chǎn)物為PCR模板，分別用F1片段的上游引物F1-f和F2片段的下游引物F2-r，成功擴(kuò)增出長(zhǎng)度約為1 260 bp的F1+2片段；同樣，以F3片段和F4片段的連接產(chǎn)物為PCR模板，分別用F3片段的上游引物F3-f和F4片段的下游引物F4-r，成功擴(kuò)增出長(zhǎng)度約為560 bp的F3+4片段.擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(圖4)，只呈現(xiàn)出一條目的條帶，無(wú)其他雜帶產(chǎn)生，說(shuō)明特異性較好，擴(kuò)增效率較高.

泳道1：片段F1的PCR擴(kuò)增切膠回收產(chǎn)物；泳道2：片段F2的PCR擴(kuò)增切膠回收產(chǎn)物；泳道3：片段F3的PCR擴(kuò)增切膠回收產(chǎn)物；泳道4：片段F4的PCR擴(kuò)增切膠回收產(chǎn)物；泳道5：DL 2 000 DNA分子量Markr(由上至下分別為2 000、1 000、750、500、250、100 bp).

圖3 4個(gè)片段的PCR擴(kuò)增后的切膠回收

產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳圖 泳道1：DL2 000 DNA分子量Markr(由上至下分別為2 000、1 000、750、500、250、100 bp)；泳道2：片段F1+2的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；泳道3：片段F3+4的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物.

2.3 第二輪片段連接結(jié)果

以F1+2片段和F3+4片段的連接產(chǎn)物為PCR模板，分別用F1片段的上游引物F1-f和F4片段的下游引物F4-r，成功擴(kuò)增出長(zhǎng)度約為1 820 bp的F1+2+3+4片段.擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(圖5a)，發(fā)現(xiàn)除目的條帶外，還出現(xiàn)極少量片段長(zhǎng)度較小的非目的條帶，但經(jīng)切膠回收純化后，非目的條帶得到很好的去除，純化后的目的條帶純度較好(圖5b).

2.4 表達(dá)載體陽(yáng)性克隆子的篩選結(jié)果

經(jīng)EcoR I和Pst I雙酶切的F1+2+3+4片段，與經(jīng)同樣雙酶切的表達(dá)載體質(zhì)粒pSB1K3片段連接后，得到表達(dá)載體質(zhì)粒pSB1K3-F1+2+3+4，轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞.18 h后，在含有那卡霉素(60 μg/ml)的LB平板中出現(xiàn)數(shù)十個(gè)菌落大小不等的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子(圖6).為避免假陽(yáng)性克隆，挑取菌落較大，邊緣整齊均一的菌落，以引物F1-f和F4-r進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證.經(jīng)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)顯示，盡管有少量非特異性的雜帶，但挑取的菌落中均擴(kuò)增到了亮度較高的 1 820 bp左右的目的條帶，與陽(yáng)性對(duì)照一致(圖7)，說(shuō)明獲得了正確的重組子.經(jīng)Sanger終止法測(cè)序進(jìn)一步驗(yàn)證后得到重組表達(dá)載體pSB1K3-F1+2+3+4.

a.片段F1+2+3+4的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物：泳道1：DL2 000 DNA分子量Markr(由上至下分別為2 000、1 000、750、500、250、100 bp)；泳道2，3：片段F1+2+3+4的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；泳道4：不含模板的陰性對(duì)照.b.片段F1+2+3+4的切膠回收產(chǎn)物：泳道1：DL2 000 DNA分子量Markr(由上至下分別為2 000、1 000、750、500、250、100 bp)；泳道2：片段F1+2+3+4的切膠回收產(chǎn)物.

圖5 片段F1+2+3+4的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和切膠回收產(chǎn)物在0.8%瓊脂糖凝膠電泳圖

圖6 轉(zhuǎn)化有表達(dá)載體質(zhì)粒pSB1K3-F1+2+3+4的大腸桿菌E.coli BL21(DE3)在含有那卡霉素的LB平板上的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子

泳道1和8：DL2 000 DNA分子量Markr(由上至下分別為2 000、1 000、750、500、250、100 bp)；泳道2-7：6個(gè)不同的克隆子分別的菌落PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；泳道9：陽(yáng)性PCR對(duì)照；泳道10：陰性PCR對(duì)照.

圖7 菌落PCR篩選結(jié)果在0.8%瓊脂糖凝膠電泳圖

3 討論

隨著有機(jī)磷農(nóng)藥使用量的逐年上升，其造成的污染問(wèn)題日趨嚴(yán)重，尤其是殘留在果蔬表面和自然界土壤、水體中的各類有機(jī)磷農(nóng)藥，嚴(yán)重威脅人們的健康和生活質(zhì)量.由于有機(jī)磷農(nóng)藥多為脂溶性化合物，普通清水洗滌的去除效果有限，而以酯酶等對(duì)有機(jī)磷污染環(huán)境和果蔬進(jìn)行降解和解毒，則是較為行之有效且最為環(huán)境友好的方式[24].

有機(jī)磷降解酶opdA通過(guò)水解有機(jī)磷農(nóng)藥的磷脂鍵，最終實(shí)現(xiàn)有機(jī)磷農(nóng)藥的無(wú)毒化.因其具有底物范圍廣和催化效率高的特點(diǎn)，被公認(rèn)為最具有應(yīng)用前景.目前已經(jīng)有較多opdA酶用于基因工程化表達(dá)的報(bào)道，而以大腸桿菌為表達(dá)宿主菌的研究中，opdA酶均以包涵體的形式在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，不能直接產(chǎn)生具有活性的opdA酶蛋白，這對(duì)實(shí)際應(yīng)用造成限制[8].為了讓基因工程化的opdA酶表達(dá)到細(xì)胞外行使降解功效，本文采用了在opdA編碼基因上游添加ompA分泌信號(hào)肽[18]的方式，作為opdA酶基因工程胞外表達(dá)的引導(dǎo)肽.ompA是一種大腸桿菌分泌型信號(hào)肽，由21個(gè)氨基酸殘基組成，其中段由丙氨酸和異亮氨酸組成的核心疏水區(qū)，形成了一段α-螺旋結(jié)構(gòu)，ompA分泌信號(hào)肽可引導(dǎo)融合在其下游表達(dá)的目的蛋白穿越細(xì)胞質(zhì)膜，到達(dá)細(xì)胞外區(qū)域，實(shí)現(xiàn)胞外表達(dá)[25].

圖8 RNA Thermometer在低溫時(shí)形成的環(huán)狀發(fā)夾結(jié)構(gòu)

在基因工程菌設(shè)計(jì)和構(gòu)建中，為了避免目的基因過(guò)早的大量表達(dá)而對(duì)工程菌本身的生長(zhǎng)造成影響，常以誘導(dǎo)型啟動(dòng)子調(diào)控目的基因的表達(dá).常用的化學(xué)誘導(dǎo)物如異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、四環(huán)素等，即增加了誘導(dǎo)表達(dá)的成本，也不利于在環(huán)境和果蔬表面原位施用.本文中采用更為可行的物理調(diào)控方式，在編碼基因上游添加以強(qiáng)啟動(dòng)子控制下的RNA溫度計(jì)(RNA Thermometer)元件[16]，該元件是一段溫度敏感型的非編碼RNA，在生物體熱休克或冷休克反應(yīng)中調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá).其作用原理[16-17]是，在溫度低于閾值(32 ℃)時(shí)，該段RNA序列改變二級(jí)結(jié)構(gòu)，形成環(huán)狀發(fā)夾(圖8)，隱藏起核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)，使宿主細(xì)胞核糖體不能結(jié)合，阻止了下游基因的翻譯；而當(dāng)環(huán)境溫度高于閾值溫度，該段RNA序列舒展為線性，核糖體可以結(jié)合，翻譯被啟動(dòng).

作為基因工程菌最常用宿主菌的大腸桿菌，本身就是一種條件致病菌.另外，基因工程化的質(zhì)粒中經(jīng)常含有抗生素抗性篩選標(biāo)記，使得構(gòu)建好的基因工程菌具有抗生素抗性能力，在環(huán)境中擴(kuò)散極易帶來(lái)生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)，這是普通基因工程菌不能直接用于環(huán)境原位修復(fù)的主要限制因素之一.在大腸桿菌菌體收到紫外線照射時(shí)，就會(huì)啟動(dòng)細(xì)菌基因組中RecA基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，其表達(dá)產(chǎn)物為分子量38Kd的RecA蛋白，該蛋白可激活RecA(SOS)啟動(dòng)子，啟動(dòng)下游關(guān)于DNA修復(fù)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，該過(guò)程對(duì)于菌體基因組的損傷修復(fù)極為重要[19,21].ccdB基因[23]編碼一種大腸桿菌毒素蛋白CcdB，該蛋白可使細(xì)胞內(nèi)的DNA促旋酶失活，從而殺傷宿主細(xì)胞.本文利用以上特性，在載體設(shè)計(jì)中采用RecA(SOS)啟動(dòng)子調(diào)控下的ccdB自殺基因來(lái)人工控制該基因工程菌的存活.當(dāng)降解完成，需要清除基因工程菌時(shí)，對(duì)菌體進(jìn)行一定強(qiáng)度紫外線照射，啟動(dòng)菌體基因組內(nèi)RecA基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，其表達(dá)產(chǎn)物RecA蛋白激活載體中的RecA(SOS)啟動(dòng)子，啟動(dòng)其下游的ccdB基因表達(dá)，其表達(dá)產(chǎn)物CcdB毒素蛋白使基因工程菌細(xì)胞內(nèi)的DNA促旋酶失活，殺死該基因工程菌，實(shí)現(xiàn)人為控制下的自殺效應(yīng)，避免該基因工程菌在環(huán)境中擴(kuò)散所帶來(lái)的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn).

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(責(zé)任編輯 李 超)

Construction of An Intelligent Genetically Rngineered Bacteria Expressing Organophosphate Degradation Enzyme Gene OpdA with Physical Regulation

LIU Yi-yang1,ZHAO Fang-lin1,CHU Jin-yan1,ZHAO Xue-jiang1,WANG Qiu-yu2*

(1.Class1715ofLiaoningProvinceExperimentalMiddelSchool,Shenyang110841,China; 2.LifeScienceSchoolofLiaoningUniversity,Shenyang110036,China)

For the increasingly serious problem that organophosphorus(OPs) pesticide residues in the environment and the surface of fruits and vegetables damage human health,we design and construct an intelligent genetically engineered bacteria that could be regulated by physical condition.With regulation of temperature-sensitive RNA,the intelligent genetically engineered bacteria would produce and secret organophosphate degradation enzyme opdA into the extracellular to degrade OPs pesticides in the environment,when it was higher than settled temperature.Meanwhile,under the control of RecA(SOS) promoter,this bacteria could start suicide program if exposed to UV,to avoid bringing adventure by spreading genetically engineered bacteria with antibiotic resistance genes for environment.This kind of bacteria could eliminate safely OPs pesticides residues in the environment and the surface of fruits and vegetables.As a result,it could repair environment polluted by OPs pesticides and maintain food safety with providing healthy fruits and vegetables.

expression vector;organophosphate degradation enzyme A;suicide gene ccdB;intelligent genetic engineering bacteria

2016-07-01

遼寧省科技廳基金項(xiàng)目(2015020654)

劉一楊(1999-) ，女，沈陽(yáng)人，遼寧省實(shí)驗(yàn)中學(xué)高二學(xué)生，《生命密碼》社團(tuán)創(chuàng)始人之一.

*通訊作者：王秋雨(1961-) ，男，沈陽(yáng)人,博士，教授，從事細(xì)胞分子生物學(xué)研究，E-mail:qiuyuwang@lnu.edu.cn.

Q 291

A

1000-5846(2017)01-0051-08