余 波，王 芳，康 超，李永霞，周思旋

(1.貴州省畜牧獸醫(yī)研究所，貴陽 550005；2.貴州省生物研究所，貴陽 550009)

大鯢虹彩病毒貴州分離株MCP基因的克隆與原核表達

余 波，王 芳2，康 超2，李永霞2，周思旋1

(1.貴州省畜牧獸醫(yī)研究所，貴陽 550005；2.貴州省生物研究所，貴陽 550009)

根據(jù)GenBank中大鯢虹彩病毒主衣殼蛋白MCP(major capsid protein,MCP)基因序列(序列號：KF512820)，設(shè)計一對特異性引物，以大鯢虹彩病毒貴州分離株基因組DNA為模板，PCR擴增大鯢虹彩病毒MCP基因并測序，與GenBank中大鯢虹彩病毒MCP基因進行比對，然后將其亞克隆到原核表達載體pET-32a(+)中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞，經(jīng)IPTG誘導后進行Western blot分析。結(jié)果顯示：PCR擴增出長度為1 392 bp的片段，與GenBank中大鯢虹彩病毒MCP基因核苷酸序列相似性為99.7%～99.9%，SDS-PAGE電泳顯示該重組蛋白的相對分子質(zhì)量約為67×103。免疫原性檢測結(jié)果表明，該重組蛋白可與兔抗大鯢虹彩病毒陽性血清特異性反應(yīng)，具有免疫原性。

大鯢虹彩病毒；MCP基因；原核表達；免疫原性

大鯢虹彩病毒(Giantsalamanderiridovirus,GSIV)，屬虹彩病毒科(Iridoviridae)蛙病毒屬(Ranavirus)，為雙鏈DNA病毒，主要感染魚類、兩棲類和爬行類，是水產(chǎn)養(yǎng)殖中一種危害較大的病毒，可引起大鯢大面積死亡[1-3]。大鯢虹彩病毒主要衣殼蛋白(MCP)基因編碼463個氨基酸，該蛋白相對分子質(zhì)量約49×103，占病毒總蛋白的45%，具有良好的免疫原性，在病毒的裝配和感染過程中發(fā)揮重要作用[4]。周勇等[5]根據(jù)大鯢虹彩病毒MCP基因設(shè)計引物，建立了大鯢虹彩病毒TaqMan實時熒光定量PCR檢測方法。劉星星等[6]據(jù)大鯢蛙病毒MCP基因設(shè)計合成4條特異性引物建立了大鯢蛙病毒環(huán)介導等溫擴增檢測方法。目前，有關(guān)大鯢虹彩病毒MCP基因的原核表達研究尚未見報道。本研究克隆了大鯢虹彩病毒貴州分離株MCP基因，構(gòu)建重組載體并在大腸桿菌中進行表達與免疫原性分析，旨在為今后進一步開展大鯢虹彩病毒基因工程疫苗和分子快速診斷方法奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 毒株、菌株和細胞

大鯢虹彩病毒貴州分離株由貴州重大疫病監(jiān)測防治重點實驗室保存。鯉上皮瘤細胞購自上海拜力生物科技有限公司。pET32a(+)表達載體、大腸桿菌BL21(DE3)、DH5α均為生工生物工程(上海)有限公司生產(chǎn)。

1.2 主要試劑

TaqPCR Mastermix酶、核酸染料、1×TAE電泳緩沖液、DL2000、λDNA、IPTG、X-gal、考馬斯亮藍R250、限制性內(nèi)切酶EocRI和HindⅢ、蛋白Marker、HRP標記的羊抗兔IgG、PCR產(chǎn)物回收純化試劑盒、質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒、病毒基因組DNA提取試劑盒購自北京天根生物科技有限公司。兔抗GSIV陽性血清由本研究室制備。蛋白質(zhì)純化試劑盒His-Tagged Purification Miniprep Kit購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 引物設(shè)計

根據(jù)GenBank中的大鯢虹彩病毒MCP基因序列，設(shè)計1對引物，上游引物：5′-GAATTCATGTCTTCTGTAACTGGT-3′，下游引物：5′-GTGCGGTTACAAGATTGGGAATCC-3′，下劃線部分分別為添加的EcoRI和HindⅢ酶切位點。

1.4 病毒核酸的抽提

將大鯢虹彩病毒液接種于鯉上皮瘤細胞，待細胞出現(xiàn)病變后收集細胞毒液，將其放入-70 ℃冰箱反復凍融3次，5 000 r/min離心10 min，取上清液200 μL用病毒基因組DNA試劑盒提取基因組。

1.5 大鯢虹彩病毒MCP基因的擴增

在100 μL體系中進行PCR反應(yīng)：上下游引物各4 μL(濃度10 μmol/L)、TaqPCR Mastermix酶50 μL、模板4 μL、ddH2O 加至100 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s， 55 ℃ 1 min、72 ℃ 1 min 30個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。取5 μL PCR擴增產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中電泳。

1.6 大鯢虹彩病毒MCP基因的克隆和鑒定

將擴增的PCR產(chǎn)物用PCR產(chǎn)物回收純化試劑盒進行DNA回收，與pMD18-T克隆載體連接，轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細胞DH5α，重組T載體命名為pMD18T-MCP。用質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒提取pMD18T-MCP菌體質(zhì)粒，然后進行酶切和PCR鑒定，并將質(zhì)粒送生工生物工程(上海)有限公司進行序列測定。

1.7 大鯢虹彩病毒MCP基因序列分析

將測序正確的序列提交至GenBank中，并利用CLUSTAL X和MEGA軟件，將該序列與GenBank中其他大鯢虹彩病毒MCP基因序列進行比對分析。

1.8 大鯢虹彩病毒MCP基因原核表達載體的構(gòu)建

用EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切重組T載體pMD18T-MCP和表達載體pET32a(+)，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，用PCR產(chǎn)物回收純化試劑盒切膠回收目的基因MCP和線性化pET32a(+)，16 ℃連接過夜，將連接的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞DH5α，涂布含Amp(100 μg/mL) 的LB瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)16 h后，挑取單個菌落抽提質(zhì)粒，進行PCR和EcoRⅠ、HindⅢ雙酶切鑒定，重組載體質(zhì)粒命名為pET32a-MCP，并將質(zhì)粒送生工生物工程(上海)有限公司進行序列測定。

1.9 大鯢虹彩病毒MCP基因的表達

將重組表達載體質(zhì)粒pET32a-MCP轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞BL21(DE3)，挑取單個菌落接種10 mL LB液體培養(yǎng)基(含Amp100 μg/mL)，37 ℃培養(yǎng)12～16 h后，取出50 μL培養(yǎng)的菌液接種于5 mL LB液體培養(yǎng)基(含Amp100 μg/mL)中培養(yǎng)至OD600 nm達0.5左右時，加入IPTG至終濃度0.1 mmol/L，繼續(xù)劇烈振蕩培養(yǎng)4 h。菌體濃度OD600 nm達1.5取出5 mL離心加入320 μL PBS懸濁后進行超聲波破碎，對菌體破碎液進行離心分離。分別取5 μL上清和沉淀，加入2×SDS上樣緩沖液混勻，100 ℃加熱10 min，進行 SDS-PAGE電泳。

1.10 兔抗GSIV血清的制備

將收集的細胞毒液參照文獻[7]通過差速和蔗糖密度梯度離心進行純化。將純化的病毒蛋白與等體積弗氏完全佐劑充分乳化，每只家兔免疫病毒蛋白5 mg，首次免疫后14 d進行二免。二免后28 d，兔耳靜脈采血并分離血清。應(yīng)用瓊擴法進行兔抗GSIV血清抗體效價測定，抗體效價達1∶64的血清于-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.11 Western-blot分析

將PVDF膜、濾紙分別剪切成與凝膠相同大小，使用轉(zhuǎn)膜緩沖液處理后，按濾紙、PVDF膜、凝膠、濾紙的順序依次放在轉(zhuǎn)膜儀電極板之間，進行轉(zhuǎn)膜。將PVDF膜置于含1.5% BSA 緩沖液中，4 ℃平放過夜封閉。

以兔抗GSIV血清作為一抗，37 ℃反應(yīng)1 h，TBST緩沖液洗滌3次，以辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG作為二抗，37 ℃反應(yīng)2 h，充分洗膜后，顯色觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 大鯢虹彩病毒MCP基因的克隆和鑒定

大鯢虹彩病毒貴州分離株經(jīng)PCR擴增得到約1 392 bp特異性的DNA條帶，克隆到pMD18T載體上，經(jīng)EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定表明pMD18T-MCP成功插入目的片段，與預期的相符(圖1)。

圖1 大鯢虹彩病毒MCP基因的克隆和鑒定Fig.1 Cloning and identification of MCP gene of GSIV

M：DL2000；1：重組質(zhì)粒EcoRI和HindⅢ雙酶切；2：重組質(zhì)粒EcoRI單酶切；3：重組質(zhì)粒 PCR產(chǎn)物

2.2 大鯢虹彩病毒MCP基因序列分析

對陽性重組質(zhì)粒pMD18T-MCP測序結(jié)果表明，大鯢虹彩病毒貴州株MCP基因由1 392 bp組成的完整開放性閱讀框。序列提交至GenBank中獲得登錄號為KC816423。通過CLUSTAL X和MEGA軟件將該序列與GenBank中其他大鯢虹彩病毒分離株進行比對(圖2,見下頁)，僅存在2個位點的堿基突變，核苷酸相似性為99.7%～99.9%。

2.3 大鯢虹彩病毒MCP基因原核表達載體的構(gòu)建

將陽性質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定，EcoRⅠ單酶切，HindⅢ單酶切，電泳后表明該陽性質(zhì)粒含有1 392 bp目的基因，與預期大小相符(圖3)。

圖3 大鯢虹彩病毒MCP基因原核表達質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定Fig.3 Construction and identification of prokaryotic expressionplasmid pMD18T-MCP

M1:λDNA；1：pET32a空載體；2：重組質(zhì)粒EcoRI單酶切；3：重組質(zhì)粒HindⅢ單酶切；4：EcoRI和HindⅢ雙酶切； M2：DL2000

2.4 大鯢虹彩病毒MCP基因在大腸桿菌中的表達

SDS-PAGE電泳表明重組載體轉(zhuǎn)化入BL21(DE3)誘導菌株經(jīng)IPTG誘導后，表達了相對分子質(zhì)量約67×103的特異性蛋白，與目的基因MCP基因編碼的重組表達蛋白大小相一致(MCP蛋白編碼蛋白49×103左右+載體的硫氧還蛋白相對分子質(zhì)量18×103)；未誘導表達菌株的全菌、上清、沉淀均未出現(xiàn)目的蛋白條帶；對誘導后的表達菌體和空載體進行超聲波破碎，離心后，分別對沉淀及上清進行SDS-PAGE電泳，結(jié)果表明，表達蛋白以包涵體形式存在，誘導后的表達空載體未見目的蛋白，只見相對分子質(zhì)量18×103硫氧還蛋白(圖4)。

圖4 大鯢虹彩病毒MCP基因在大腸桿菌中的 表達產(chǎn)物SDS-PAGEFig.4 The expression of recombinant MCP protein of GSIV in BL21(DE3)

M：蛋白分子Markers；1:未誘導表達菌全菌；2:未誘導表達菌上清；3:未誘導表達菌沉淀；4:誘導表達菌全菌；5:誘導表達菌上清；6:誘導表達菌沉淀；7:空載體誘導菌全菌

圖2 大鯢虹彩病毒MCP基因序列比對分析圖Fig.2 Comparison and analysis of MCP gene of GSIV

2.5 Western-blot分析

Western-blotting結(jié)果顯示，相對分子質(zhì)量約67×103處出現(xiàn)目的反應(yīng)帶(圖5)，表明重組蛋白可與兔抗GSIV血清發(fā)生免疫反應(yīng)。

圖5 表達蛋白的Western-blotting鑒定Fig.5 The western blotting of the recombinant protein

M：蛋白分子Markers；1：誘導表達菌全菌；2：誘導表達空載體；3：誘導表達菌全菌Western-blotting；4：誘導表達空載體Western-blotting

3 討論

目前報道的GSIV MCP基因表達多采用真核表達系統(tǒng)。曾憲輝等[8]將GSIV MCP基因克隆到真核表達載體pcDNA3.1(+)中，實現(xiàn)GSIV MCP的真核表達，DNA疫苗免疫大鯢后，可誘導免疫大鯢產(chǎn)生細胞免疫和刺激機體產(chǎn)生特異性抗體，免疫保護率可達73.3%。原核表達系統(tǒng)較真核表達具有耗時短，表達量高的特點。本研究克隆了大鯢虹彩病毒貴州分離株MCP基因，構(gòu)建重組載體，實現(xiàn)了大鯢虹彩病毒MCP基因的原核表達。Western blot分析結(jié)果表明，該重組蛋白具備免疫原性。

大鯢虹彩病毒MCP蛋白是虹彩病毒二十面體衣殼蛋白，蛋白質(zhì)疏水性高，具有一定的穩(wěn)定性，含有較多的抗原決定簇，具有良好的免疫原性，而MCP基因序列及其編碼氨基酸序列的同源性可以反映不同虹彩病毒毒株之間的遺傳親緣關(guān)系[9]。本研究克隆的全長1 392 bp的大鯢虹彩病毒MCP基因，與GenBank中大鯢虹彩病毒MCP基因進行比對，核苷酸序列相似性為99.7%～99.9%，這和周小愿等[10]和徐進等[11]研究結(jié)果一致，表明中國GSIV多個流行毒株是同一種GSIV病毒，且不同GSIV毒株的MCP基因的分子特征和結(jié)構(gòu)基本一致。

[1]Mao J,Hedrick R P,Chinchar V G,et al.Molecular characterization sequence analysis,and taxonomic position of newly isolated fishiridoviruses[J].Virology,1997,229(1):212-220.

[2]王 芳,余 波,史開志,等.虹彩病毒和柱狀黃桿菌混合感染大鯢的診治[J].湖北農(nóng)業(yè)科學,2013,52(13):3102-3104.

[3]周小愿,張星朗,吉 紅,等.大鯢虹彩病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)及其包涵體特征[J].淡水漁業(yè),2015,45(1):62-66.

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[5]周 勇,曾令兵,孟 彥,等.大鯢虹彩病毒TaqMan實時熒光定量PCR檢測方法的建立[J].水產(chǎn)學報,2012,36(5):772-778.

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(責任編輯：鄧 薇)

Cloning and prokaryotic expression of MCP gene ofGiantsalamanderiridovirusfrom Guizhou strain

YU Bo1,WANG Fang2,KANG Chao2,LI Yong-xia2,ZHOU Si-xuan1

(1.GuizhouInstituteofAnimalHusbandryandVeterinaryMedicine,Guiyang550005,China;2.GuizhouInstituteofBiology,Guiyang550009,China)

According to the MCP (major capsid protein,MCP) gene sequence ofGiantsalamanderiridovirus(GenBank Accession No.KF512820)in GenBank,a pair of specific primer was designed for amplifying the specific fragments of MCP gene.The MCP gene was amplified from the Guizhou isolate ofgiantsalamanderiridovirusby PCR,and then was subcloned into the prokaryotic expression vector pET-32a(+).The recombinant plasmid pET-32a-MCP was transformed intoE.coliBL21(DE3) and expressed under the induction of IPTG and SDS-PAGE.The results show that the MCP gene was 1392bp in length,the homology comparison between the MCP gene sequence and GenBank of MCP gene sequence showed 99.7%～99.9% identities at nucleotide level.The result of SDS-PAGE showed the expressed protein was about 67 KD.Western-blot analysis indicated that the expressed protein could react with rabbit anti- GSIV serum,which had immunological activity.

Giantsalamanderiridovirus;MCP gene;prokaryotic expression;immunological activity

2016-06-14；

2016-10-08資助項目：貴州省科學技術(shù)基金計劃項目(黔科合J字[2014]2115號)；貴州省科技廳農(nóng)業(yè)攻關(guān)項目(黔科合NZ字[2012]3023號)；2014年省級財政漁業(yè)發(fā)展(大鯢產(chǎn)業(yè))專項資金

余 波(1981- )，男，副研究員，主要從事預防獸醫(yī)研究。E-mail:yubonky@163.com

S917.4

A

1000-6907-(2017)02-0018-05