趙 亮，鄒益東，胡 鯤，楊先樂，黃保華

(1.上海海洋大學，國家水生動物病原庫，上海，201306；2. 江蘇天石生物科技有限公司，無錫，214258；3. 上海黛龍生物科技有限公司，上海，201400)

聚六亞甲基胍對異育銀鯽鰓出血病藥效的初步研究

趙 亮1，鄒益東2，胡 鯤1，楊先樂1，黃保華3

(1.上海海洋大學，國家水生動物病原庫，上海，201306；2. 江蘇天石生物科技有限公司，無錫，214258；3. 上海黛龍生物科技有限公司，上海，201400)

通過PCR檢測及序列對比分析，確診江蘇海豐農(nóng)場兩塘口內(nèi)異育銀鯽(Carassiusauratusgibelio)所患疾病為鯉皰疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirusⅡ，CyHV-2)引發(fā)的鯽造血器官壞死癥(Crucian Carp Hematopoietic Necrosis)，而后分別每10 d 使用0.5 mL/m3和0.75 mL/m3聚六亞甲基胍(Polyhexamethylene guanide, PHMG)潑灑治療，并定期采樣，利用Real Time PCR測定樣品中病毒表達量。結果顯示：該病毒(DF2015) CyHV-2的DNA解旋酶基因序列長為316 bp，與絕大多數(shù)病毒株有較近的親緣關系(99%)，但與病毒株ST-J1和H.Fukuda的親緣關系相對較遠(63%)。與其余病毒株等有較近的親緣關系(99%)；治療近2個月后，兩塘的病毒相對表達量均呈下降趨勢，且具有顯著差異性，但0.75 mL/m3治療塘病毒相對表達量極顯著降低，治療效果相對更顯著。

聚六亞甲基胍；異育銀鯽(Carassiusauratusgibelio)；鯽造血器官壞死癥；實時熒光定量PCR；鯉皰疹病毒Ⅱ型

異育銀鯽(Carassiusauratusgibelio)是中國重要的淡水養(yǎng)殖魚類, 養(yǎng)殖規(guī)模越來越大[1-4]。2011年，江蘇異育銀鯽出現(xiàn)一種怪病，引起大量死亡，嚴重時發(fā)病率高達80%，俗稱鰓出血病[5]，給江蘇地區(qū)的水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失。近年來, 鰓出血病給中國部分水產(chǎn)養(yǎng)殖場帶來重創(chuàng)，有研究者確認了該病為鯽造血器官壞死癥(Crucian Carp Hematopoietic Necrosis)，其病原為鯉皰疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirusⅡ，CyHV-2)[6-9]，該病具有突發(fā)性及流行廣和致死率高的特點。主要癥狀為體表有大小不同的出血斑, 下頜、鰭基部及側線鱗以下及胸部出血尤為明顯，鰓腫脹呈暗紅色, 當鰓蓋張合或魚泳動時會有血液從鰓蓋下方流出，鰓出血病嚴重阻礙中國水產(chǎn)業(yè)健康和可持續(xù)發(fā)展。

已有研究表明0.5 mL/m3聚六亞甲基胍(Polyhexamethylene guanide, PHMG)能夠有效預防鯽鰓出血病[10]，聚六亞甲基胍是一種新型的多用途高分子聚合物，具有無色無味、易溶于水、性質(zhì)穩(wěn)定等優(yōu)點[11]，對白色念珠菌、弧菌等具有良好殺滅效果[12-14]。PHMG是一種陽離子表面活性劑，易被呈負電性的各類細菌與病毒所吸附，從而抑制它們的分裂繁殖功能[15]，因其獨特的結構與性能，常被用于食品行業(yè)及環(huán)境消毒等行業(yè)中[16-17]。PHMG有刺激性小、安全低毒、易溶解、性質(zhì)穩(wěn)定等特點，目前有報道表明PHMG對多種水產(chǎn)養(yǎng)殖疾病具有顯著功效[18]。在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)具有良好的應用前景[10, 19]。本研究欲驗證聚六亞甲基胍用于外塘的效果，并為該藥在水產(chǎn)養(yǎng)殖的合理安全使用提供科學的參考依據(jù)。

2 材料與方法

2.1 實驗塘口

江蘇大豐海豐農(nóng)場，一區(qū)11#、12#塘為鰓出血發(fā)病遺留塘，兩塘口面積均約為90 m2，水深約1.5 m。2014年秋季發(fā)病后，重新放入了異育銀鯽小魚種。2015年3月底采樣時發(fā)現(xiàn)魚體有鰓出血癥狀，且11#塘相對更嚴重。隨即制定聚六亞甲基胍用藥方案，同時帶病樣回實驗室檢測。

2.2 實驗試劑

聚六亞甲基胍有效濃度約為25%，上海黛龍生物科技工程有限公司。基因組DNA抽提試劑盒、DNA片段純化試劑盒、rTaq、Reverse Transcriptase M-MLV (RNase H-)等購自Takara，iQTMSYBR?Green Supermix購自Bio-rad公司。

2.3 實驗方法

2.3.1 聚六亞甲基胍用藥方案

由于一區(qū)11#、12#塘，已發(fā)現(xiàn)鰓出血病癥狀，故首次用藥采用治療方案，具體方案如下：

11#塘：以0.5 mL/m3，每天潑灑一次，連用3 d。

12#塘：以0.75 mL/m3，每天潑灑一次，連用2 d。

而后每10 d按照相應濃度潑灑一次，并分別進行取樣檢測。

2.3.2 病毒檢測

2.3.2.1 樣品制備

采集使用聚六亞甲基胍前塘口內(nèi)的病魚，每塘取5條，并將兩塘病魚的腎臟組織分別置于無菌離心管中，用無菌剪刀剪碎，液氮研磨后，用于巢式PCR檢測，驗證是否為CyHV-2病毒感染。

使用聚六亞甲基胍后分批采集病魚，每次每塘取5條，分別取每批次病魚腎臟組織于無菌離心管中，用無菌剪刀剪碎，放入凍存管中-80 ℃保存，用于Real Time PCR檢測。

2.3.2.2 PCR檢測及序列分析

[10, 20]，調(diào)整相關條件后，采用巢式PCR檢測，引物設計參照GenBank中已有的CyHV-2的DNA解旋酶基因序列(登錄號：EU349287)設計。外引物為W1-F：TGAAATGTCAAAAGTGGATGG，W1-R：TATTCCCAGACAGCCTTCAAA；內(nèi)引物為W2-F：GAACACCGCTGCTCATCATC，W2-R：ACTCTTCGCAAGTCCTCACC[10]，由上海生工生物工程股份有限公司合成。

巢式PCR兩輪擴增后，產(chǎn)物在1%(W/V)的瓊脂糖凝膠上電泳，用凝膠成像系統(tǒng)作成像分析。

將上述內(nèi)引物擴增后的產(chǎn)物用DNA回收試劑盒(TaKaRa)切膠回收純化后送上海生工生物工程股份有限公司進行雙向測序。測序結果用DNAStar和NCBI BLAST與已發(fā)布的CyHV-2基因組序列進行核苷酸同源性序列分析比對。從GenBank中選擇與陽性序列相似的參考毒株，用MEGA5.0軟件構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

2.3.3 Real Time PCR

2.3.3.1 總RNA的提取與反轉錄

分離異育銀鯽腎，按Trizol法提取總RNA。采用紫外分光光度計與1.0 %瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的濃度及完整性，-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｊ褂肕-MLV反轉錄成cDNA。反轉錄體系及反應條件按照試劑盒推薦體系進行。

2.3.3.2 Real Time PCR

根據(jù)參考文獻[21-22]中的引物，參照GenBank中CyHV-2的DNA解旋酶基因序列設計，由上海生工生物有限公司合成，引物如表1。熒光定量PCR反應必須確定擴增的特異性、最適溫度及擴增效率。具體要求為：確定最適溫度從而使模板與內(nèi)參基因的擴增可同時進行；目的基因與內(nèi)參基因的擴增效率必須都介于95%～102%，且差異小于2%[23]。Real Time PCR反應參數(shù)為: 95 ℃預變性3 min，95 ℃10 s，64 ℃ 10 s，共40 個循環(huán)，最后 72 ℃延伸 1 min。用內(nèi)參β-actin對各個樣品的Ct值進行均一化處理，采用2-△△Ct確定不同樣品mRNA的相對含量[24, 25]。

表1 Real Time PCR所用引物

2.4 數(shù)據(jù)處理

用SPSS19.0軟件統(tǒng)計所有數(shù)據(jù)并進行方差分析(one-way-ANOVA)，差異顯著時采用最小顯著性差異法(Least Significant Difference，LSD)比較各組平均樣，數(shù)據(jù)表示為均值±標準誤差(Mean±SD)。

3 結果

3.1 病毒檢測結果

巢式PCR檢測到CyHV-2感染，檢測結果病魚均為陽性，這4個樣本都能擴增出一條316 bp的單一亮帶(圖1)。

圖1 巢式PCR檢測結果Fig.1 CyHV-2 Nested-PCR assay of fish samples.M：DL1000 DNA marker；1、2：11#塘口病魚；3、4：12#塘口病魚

3.2 DNA序列比對分析

對上述巢式PCR二次擴增的產(chǎn)物進行了測序，測序結果顯示目的基因片段為316 bp，并命名為DF2015。將其在GenBank中進行BLAST比對分析，系統(tǒng)進化樹結果分析表明，DF2015與CyHV-2病毒株同為一支，但與CyHV-2病毒株中的ST-J1和H.Fukuda的親緣關系相對較遠，與CyHV-3病毒株等有較近的親緣關系(圖2)。

圖2 同源性的系統(tǒng)進化分析Fig.2 Phylogenetic analysis

3.3 Real Time PCR結果

雖然許多出版單位在數(shù)字出版領域進行了探索和發(fā)展，并取得了一定的成績。但如果要想在未來的數(shù)字出版領域站穩(wěn)腳跟、發(fā)展壯大，就必須不斷開拓創(chuàng)新。數(shù)字出版只有在開拓創(chuàng)新中不斷摸索、總結經(jīng)驗與教訓，大力推進品牌建設，形成自己的運營體系，才能吸引更多的讀者群體，出版單位才能在這個領域中站穩(wěn)腳跟。

用藥及取樣時間如表2所示，并分別對樣品的腎臟進行編號并保存?zhèn)溆谩?/p>

Real Time PCR結果(圖3) 顯示，兩個塘口用藥后病毒mRNA表達量整體趨勢為逐漸減少。其中，圖3為11#塘樣品病毒相對表達量，其它批次樣品與第一批樣品病毒相對表達量具有顯著差異(P<0.05)，同時，11-3批次樣品病毒量出現(xiàn)增加的情況(P<0.05)；而圖4為12#塘樣品病毒相對表達量，與第一批樣品病毒相對表達量相比，其它批次樣品極顯著降低(P<0.01)。

表2 用藥、取樣時間及樣品編號

圖3 11#塘樣品病毒相對表達量Fig.3 Relative expression of CyHV-2 in fishes of 11#

圖4 12#塘樣品病毒相對表達量Fig.4 Relative expression of CyHV-2 in fishes of 12#

4 討論

俞軍等[10 ]通過人工感染實驗證明，當濃度≥0.5 mL/m3時，PHMG對預防異育銀鯽患鰓出血病保護率可達60%以上；而當藥物濃度≥0.75 mL/m3時，PHMG對治療感染3 d后的鯽保護率達63.33%以上。本研究以該研究數(shù)據(jù)為基礎，同時綜合分析、考慮成本與效果問題，制定用藥方案，進行養(yǎng)殖塘內(nèi)驗證研究，發(fā)現(xiàn)每10 d使用0.75 mL/m3PHMG潑灑發(fā)病癥狀較輕的12#塘，相對較每10 d使用0.5 mL/m3PHMG潑灑發(fā)病癥狀較重的11#塘，效果更顯著，后期病毒相對表達量降低更顯著。與此同時，6月份開始，11#塘出現(xiàn)死魚情況，約每天死亡100～200尾，而12#只是出現(xiàn)零星死魚。這可能表明，PHMG濃度高于0.75 mL/m3且在發(fā)病初期時，才能更好地抑制病情發(fā)展。

據(jù)報道，5月份是鰓出血病的爆發(fā)期，此時的季節(jié)溫度適宜CyHV-2 病毒繁殖[5]。因此，11#塘的第三批次樣品出現(xiàn)病毒相對表達量增加的情況，可能與當時環(huán)境、季節(jié)(4月29日)適宜病毒繁殖有關。

另外，由于PHMG的作用機制是通過其自身所帶正電荷吸附帶負電的物質(zhì)，而養(yǎng)殖塘內(nèi)水體復雜，除有害病原外，其它物質(zhì)是否也會消耗PHMG尚不明確。所以，盡管本研究中所用的兩個塘相鄰，且日常管理相同，但它們之間水體狀況仍可能差異極大，最終防治效果差異是否僅與PHMG使用量有關，需更進一步研究證明。同時，本研究因條件限制，未設置對照塘，因此研究結果或存在一定局限性。

參考文獻：

[1] 桂建芳. 銀鯽天然雌核發(fā)育機理研究的回顧與展望[J]. 中國科學基金, 1997, 11(1): 11-16.

[2] 桂建芳, 周 莉. 多倍體銀鯽克隆多樣性和雙重生殖方式的遺傳基礎和育種應用[J]. 中國科學: 生命科學, 2010,40(2): 97-103.

[3] Wang Z W, Zhu H P, Wang D, et al. A novel nucleo-cytoplasmic hybrid clone formed via and rogenesis in polyploidy gibel carp[J].BMC Res Notes, 2011, 4(1): 82.

[4] Gui J F, Zhu Z Y. Molecular basis and genetic improvement of economically important traits in aquaculture animals[J]. Chin Sci Bull, 2012, 57(15): 1751-1760.

[5] 王會聰, 孫 琪, 楊先樂, 等．溫度對鯽魚鰓出血病的影響[J].科學養(yǎng)魚，2013(10) : 61.

[6] Xu L J, Podok P, Xie J, et al. Comparative analysis of differential gene expression in kidney tissues of moribund and surviving crucian carp (Carassiusauratusgibelio) in response to cyprinid herpesvirus 2 infection[J]. Arch Virol, 2014, 159(8): 1961-1974.

[7] Yi Y, Zhang H T, Lee X Z, et al. Extracellular virion proteins of two Chinese CyHV-3/KHV isolates, and identification of two novel envelope proteins[J]. Virus Res, 2014, 191(10): 108-116.

[8] Zhang H, Zeng L B, Fan Y D, et al. A loop-mediated isothermal amplification assay for rapid detection of Cyprinid herpes virus 2 in gibel carp (Carassiusauratusgibelio)[J]. Sci World J, 2014.

[9] 孫 琪, 阮記明, 胡 鯤, 等．江蘇射陽縣大紅鰓病與鰓出血病的案例分析[J]. 科學養(yǎng)魚，2012，(11) : 64-65．

[10] 俞 軍, 孫 琪, 王會聰, 等．聚六亞甲基胍對異育銀鯽造血器官壞死癥的防治效果研究[J].淡水漁業(yè), 2015, 45(4): 49-55.

[11] 余 磊, 金學平, 張 婷, 等. 聚六亞甲基胍基鹽酸鹽的合成[J]. 應用化工, 2014, 43(1) : 192-194．

[12]張 瑋, 史曉濱, 孫燕曉, 等. 克大克消毒液殺菌效果與毒理學研究[J]. 中國消毒學雜志, 2006, 23(1):4-6.

[13]張 瑋, 于 鋒, 朱漢泉. 聚六亞甲基胍殺滅致病弧菌效果及其對海產(chǎn)養(yǎng)殖動物毒性[J]. 中國消毒學雜志, 2007, 24(6):499-502.

[14] 秦志華, 李 健, 劉 淇. 聚六亞甲基雙胍對中國對蝦受精卵和無節(jié)幼體的影響及其殺菌效果研究[J]. 海洋水產(chǎn)研究, 2006, 27(5):39-43.

[15]王冰姝, 陳惠珍, 鐘昱文, 等. 聚六亞甲基胍類消毒劑的殺菌效果觀察[J]. 中國熱帶醫(yī)學, 2008, 8(3):491-493.

[16] Kusnetsov J M, Tulkki A I, Ahonen H E, et al. Efficacy of three prevention strategies against legionella in cooling water systems[J]. J Appl Microbiol, 1997, 82(6):763-768.

[17]Messick C R, Pendland S L, Moshirfar M, et al. In-vitro activity of polyhexamethylene biguanide(phmb) against fungal isolates associated with infective keratitis[J]. J Antimicrob Chemother, 1999, 44(2):297-298.

[18] 孫 琪, 黃保華, 楊先樂. 聚六亞甲基胍防治水產(chǎn)養(yǎng)殖“疑難雜癥”試驗研究[J]. 科學養(yǎng)魚, 2014，(11): 54-55.

[19]俞 軍, 孫 琪, 胡 鯤, 等.聚六亞甲基胍對異育銀鯽的急性毒性試驗[J]. 漁業(yè)致富指南, 2015，(9): 47-49.

[20]徐 進, 曾令兵, 楊德國, 等. 鯉皰疹病毒2型武漢株的分離與鑒定[J]. 中國水產(chǎn)科學, 2013, 20(6):1303-1309.

[21] 周 勇, 曾令兵, 張 輝, 等.鯉皰疹病毒Ⅱ型TaqMan real-time PCR檢測方法的建立及應用[J]. 水產(chǎn)學報, 2013, 37(4): 607-613.

[22] 趙依妮, 孫 琪, 胡 鯤, 等.基于 GABA A 受體評估雙氟沙星對異育銀鯽的安全性[J]. 水生生物學報, 2015, 39(3): 598-603.

[23] 趙煥英, 包金風. 實時熒光定量PCR技術的原理及其應用研究進展[J]. 中國組織化學與細胞化學雜志, 2007, 16(4): 492-497.

[24] 俞菊華, 戈賢平, 唐永凱, 等. 碳水化合物、脂肪對翹嘴紅鲌PEPCK基因表達的影響[J]. 水產(chǎn)學報, 2007, 31(3): 369-373.

[25] Livak K J, Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method [J]. Methods, 2002, 25(4):402 - 408.

(責任編輯：鄧 薇)

A pilot study of the effect of polyhexamethylene guanide onCarassiusauratusgibeliohematopoietic necrosis

ZHAO Liang1, ZOU Yi-dong2, HU Kun1, YANG Xian-le1, HUANG Bao-hua3

(1.ShanghaiOceanUniversityNationalPathogenCollectionCentreforAquaticAnimals，Shanghai201306，China;2.JiangsuSkystoneBiotechnologyCo.,LTD，Wuxi214258，China；3.ShanghaiDelonBiologicalEngineeringTechnologyCo.,LTD，Shanghai201400，China)

Using nested-PCR assay and the amplification product assay, we decided the disease ofCarassiusauratusgibelioin two areas of Jiangsu Haifeng Farm is caused by Cyprinid herpesvirusⅡ(CyHV-2), and then respectively treated with 0.5 mL/m3and 0.75 mL/m3Polyhexamethylene guanide (PHMG) each 10 days, sampled regularly, and eventually evaluated the relative expression of CyHV-2 by Real Time PCR. The results showed that the sequence of virus’ CyHV-2 DNA helicase gene is 316bp，and forms an independent branch on the phylogenetic tree with other CyHV-2 strains. After two months treatment, relative expression of CyHV-2 of both treatments decreased significantly, and relative expression of CyHV-2 of the one treating with 0.75 mL/m3PHMG decreased more significantly, and the efficiency is much better.

polyhexamethylene guanide;Carassiusauratusgibelio; crucian carp hematopoietic necrosis; real time PCR; cyprinid herpesvirusⅡ

2016-04-05；

2016-07-21

國家重大科技成果轉化項目(ZD-2012-345)；上海高校知識服務平臺項目(ZF1206)；公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項經(jīng)費(201203085)；國家863計劃項目(2011AA10A216)；國家自然科學基金資助項目(31172430)

趙 亮(1986-)，男，碩士研究生，專業(yè)方向為水產(chǎn)動物醫(yī)學。E-mail:574219289@qq.com 通訊作者：楊先樂。E-mail:xlyang@shou.edu.cn

S948

A

1000-6907-(2017)02-0096-05