肖 俊，許亮清，胡向萍，程周玉，胡寶慶，簡(jiǎn)少卿，陽(yáng) 鋼，文春根

(1.南昌大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南昌，330031；2.南昌市科學(xué)院畜牧水產(chǎn)研究所，南昌，330038)

翹嘴鱖銅鋅超氧化物歧化酶重組蛋白表達(dá)、純化及特性分析

肖 俊1，許亮清2，胡向萍1，程周玉1，胡寶慶1，簡(jiǎn)少卿1，陽(yáng) 鋼1，文春根1

(1.南昌大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南昌，330031；2.南昌市科學(xué)院畜牧水產(chǎn)研究所，南昌，330038)

超氧化物歧化酶(SOD)是清除生物體內(nèi)超氧陰離子自由基的一種重要抗氧化酶。根據(jù)翹嘴鱖 (Sinipercachuatsi) Cu/Zn-SOD基因序列 (GenBank登錄號(hào): KJ558392.1) 設(shè)計(jì)表達(dá)引物，擴(kuò)增獲得截去信號(hào)肽后的一段460 bp的序列，序列經(jīng)過(guò)鑒定后，構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pET-30a+ScCu/Zn-SOD，并將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到BL21(DE3) 中，用IPTG誘導(dǎo)進(jìn)行表達(dá)。經(jīng)過(guò)優(yōu)化表達(dá)條件得到可溶的ScCu/Zn-SOD重組蛋白(rScCu/Zn-SOD)，純化重組蛋白后測(cè)定rScCu/Zn-SOD的濃度和酶活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在20 ℃和37 ℃條件下均能夠誘導(dǎo)ScCu/Zn-SOD的表達(dá)。37 ℃時(shí)重組蛋白主要以包涵體形式存在。降低誘導(dǎo)溫度和補(bǔ)充Cu2+/Zn2+可提高rScCu/Zn-SOD的表達(dá)量。在20 ℃、0.5 mmol/L IPTG條件下，添加0.5 mmol/L CuSO4和0.1 mmol/L ZnCl2于培養(yǎng)基中，重組蛋白的表達(dá)量明顯升高。純化后的重組蛋白濃度為0.14 mg/mL，酶活力為108.5 U/mg。rScCu/Zn-SOD最適溫度為37 ℃，最適pH為7.0，可耐受5% 濃度的SDS蛋白質(zhì)變性劑。

翹嘴鱖(Sinipercachuatsi)；銅鋅超氧化物歧化酶；原核表達(dá)；蛋白特性

超氧化物歧化酶 (Superoxide dismutase，SOD)是生物體的重要抗氧化酶之一，能夠催化超氧陰離子發(fā)生歧化反應(yīng)生成過(guò)氧化氫和水，平衡機(jī)體氧自由基水平，避免活性氧簇 (Reactiveoxygenspecies, ROS)的毒害作用[1]。SOD分為Cu/Zn-SOD、Mn-SOD和Fe-SOD三類(lèi)，其中 Cu/Zn-SOD存在于真核生物的細(xì)胞漿內(nèi)；Mn-SOD存在于真核生物和原核生物的線粒體中；Fe-SOD存在于原核細(xì)胞及少數(shù)植物細(xì)胞的葉綠體中[2]。

SOD不僅是一種抗氧化物酶，同時(shí)也是魚(yú)體內(nèi)重要的非特異性免疫因子之一，具有抑制病菌侵害和增強(qiáng)機(jī)體免疫力等作用[3-4]。還可以作為魚(yú)類(lèi)對(duì)水環(huán)境污染的指標(biāo)[5]。魚(yú)體中SOD抗氧化酶基因的表達(dá)水平或活性的變化，反映了機(jī)體的氧化損傷或受環(huán)境脅迫的狀態(tài)[6,7]。鰱 (Hypophthalmichthysmolitrix) 在低氧脅迫條件下，肝和鰓組織的Cu/Zn-SOD mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)[8]。重金屬、過(guò)氧化氫及高溫脅迫均能引起盤(pán)鮑 (Haliotisdiscus)及萼花臂尾輪蟲(chóng) (Brachionuscalyciflorus) Cu/Zn-SOD mRNA的表達(dá)水平變化[9-10]。鰻弧菌 (Vibrioanguillarum) 刺激尖吻鱸 (Latescalcarifer) 后，其肌肉、鰓、肝臟和腎臟組織中的SOD mRNA表達(dá)量上調(diào)[11]。目前，已經(jīng)從大西洋鮭魚(yú) (Trematomusbernacchii)[12]、斑馬魚(yú) (Daniorerio)[13]、黑鯛 (Sparusmacrocephlus)[14]和鰱[15]等魚(yú)體內(nèi)成功克隆到Cu/Zn-SOD基因。另外，用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)和誘導(dǎo)出具有生物活性的斑馬魚(yú)和黑鯛Cu/Zn-SOD融合蛋白[13,14]。

翹嘴鱖 (Sinipercachuatsi) 廣泛分布于我國(guó)各大水系，是珍貴的淡水養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)。目前，已經(jīng)在鱖體內(nèi)成功分離免疫球蛋白 (IgM、IgD和 IgZ)、β-防御素、溶菌酶、白介素、干擾素調(diào)節(jié)因子及抗病毒基因viperin等非特異性免疫因子[16-19]。然而，還未見(jiàn)鱖SOD的報(bào)道。本研究在克隆出翹嘴鱖Cu/Zn-SOD (命名為ScCu/Zn-SOD) 基因的基礎(chǔ)上[20]，構(gòu)建了鱖Cu/Zn-SOD的重組表達(dá)質(zhì)粒pET-30a+ScCu/Zn-SOD，在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)出可溶性目的蛋白，純化了重組ScCu/Zn-SOD蛋白 (命名為rScCu/Zn-SOD)，并對(duì)重組蛋白的穩(wěn)定性進(jìn)行了分析。以期為進(jìn)一步研究SOD在魚(yú)類(lèi)中的免疫機(jī)制及蛋白功能提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

翹嘴鱖由南昌市科學(xué)院畜牧水產(chǎn)所惠贈(zèng)，平均體重(300±5.12)g，為人工網(wǎng)箱養(yǎng)殖。實(shí)驗(yàn)之前，置于水族箱中暫養(yǎng)一周，期間采用連續(xù)不間斷充氣供養(yǎng)。

1.2 Cu/Zn-SOD 基因cDNA的 PCR 擴(kuò)增

挑選健康的個(gè)體, 用Trizol法提取鱖肌肉總RNA。參照SMART cDNA Synthesis Kit (Clontech)操作手冊(cè) (Clontech公司)合成SMART-cDNA。根據(jù)ScCu/Zn-SOD基因的編碼cDNA序列(GenBank accession no. KJ558392.1)，利用Primer 5.0軟件分析可用的酶切位點(diǎn)并設(shè)計(jì)表達(dá)引物ExCZSOD-F和ExCZSOD-R。上游表達(dá)引物ExCZSOD-F：GGAGAATTCATGGTACTAAAAGCTGTTTGTGTGT，含EcoRⅠ酶切位點(diǎn)(下劃線所示)和起始密碼子ATG；下游表達(dá)引物ExCZSOD-R：CCCAAGCTTTTACTGCGTGATGCCAATGACTC，含HindⅢ 酶切位點(diǎn)(下劃線所示)和終止密碼子TAA。引物5’ 端的3個(gè)堿基(GGA和CCC)為保護(hù)堿基，以保障堿基序列的粘性末端正常切開(kāi)。以SMART-cDNA為模板，用高保真酶ExTaq 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)參數(shù)為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。反應(yīng)結(jié)束后，用1% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增效果，最后回收目的PCR產(chǎn)物。

1.3 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

回收目的PCR產(chǎn)物和pET30-a(+) 載體分別用限制性?xún)?nèi)切酶EcoRⅠ和HindⅢ 進(jìn)行雙酶切，酶切體系為 20 μL (10 μL H2O，6 μL DNA或質(zhì)粒，1 μLEcoRⅠ，1 μLHindⅢ， 2 mL 10×H buffer)，37 ℃ 水浴酶切 4 h，酶切后用 1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)是否酶切完全。用純化試劑盒分別對(duì)酶切后的產(chǎn)物和質(zhì)粒進(jìn)行純化。純化后的DNA和質(zhì)粒各 4 μL ，T4 DNA連接酶 1 μL ，T4 連接buffer 1 μL，總共 10 μL，4 ℃ 連接過(guò)夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，隨后涂布于固體LB平板(Kana+)，37 ℃ 培養(yǎng)過(guò)夜，次日篩選陽(yáng)性克隆測(cè)序和雙酶切驗(yàn)證。

1.4 rScCu/Zn-SOD可溶性誘導(dǎo)條件優(yōu)化

將驗(yàn)證的重組質(zhì)粒 (pET-30a+ScCu/Zn-SOD) 熱激轉(zhuǎn)化E.coliBL21 (DE3) 感受態(tài)細(xì)胞中，隨后涂布于固體LB平板 (Kana+)，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，次日挑取陽(yáng)性克隆菌做PCR驗(yàn)證。

將經(jīng)驗(yàn)證的陽(yáng)性克隆按1∶50的比例分別加入到50 mL液體LB培養(yǎng)基培養(yǎng)(Kana+)中，37 ℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)3 h至OD600 nm為0.6。取2 mL菌液作為未誘導(dǎo)的對(duì)照組，再加入異丙基硫代β-半乳糖苷 (IPTG) 至終濃度為0.5 mmol/L，37 ℃，200 rpm條件下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并在2、4、6、8 h時(shí)間點(diǎn)分別收集2 mL菌液，以0.5 mmol/L IPTG濃度下誘導(dǎo)6 h的DE3空白質(zhì)粒菌液作為陰性對(duì)照。將上述收集的各管菌液7 000 r/min離心10 min后棄上清，分別用500 μL 1×PBS (162 mmol/L Na2HPO4, 38 mmol/L NaH2PO4, pH 7.4) 洗滌沉淀兩次后。再加 150 μL 1× PBS使沉淀中的菌體重懸，然后加入50 μL上樣緩沖液(100 mmol/L Tris-HCl,pH 8.0，5% DTT，2% SDS，0.1% 溴酚藍(lán)，10% 甘油)，混勻后95 ℃ 加熱10 min，采用10% 變性不連續(xù)的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(10% SDS-PAGE)電泳對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)分析。

收集全部剩余菌液置于50 mL離心管中，7 000 r/min離心10 min，棄上清，用1× PBS洗滌兩次，再用150 mL預(yù)冷的Binding buffer (300 mmol/L NaCl，50 mmol/L NaH2PO4，10 mmol/L 咪唑，pH 8.0) 重懸菌體，充分混勻。然后超聲破碎(39 W，超聲15 s，間隔15 s，冰浴)細(xì)胞10 min，菌液澄清后，4 ℃ 7 000 r/min離心30 min，收集超聲破碎后上清與沉淀。挑取適量沉淀后加入1.5 mL離心管中，用500 μL 1×PBS重復(fù)洗滌2次后再用150 μL 1× PBS重懸，直接吸取150 μL上清置于1.5 mL離心管中，并且分別向2管中加入50 μL緩沖液，混勻后95 ℃ 加熱10 min，用10% SDS-PAGE蛋白凝膠電泳檢測(cè)rScCu/Zn-SOD在上清及沉淀中的表達(dá)情況。

為進(jìn)一步研究rScCu/Zn-SOD可溶性表達(dá)的最佳誘導(dǎo)條件，將20 μL pET-30a+ScCu/Zn-SOD重組表達(dá)菌接種至1 mL LB液體培養(yǎng)基 (Kana+) 中，37 ℃ 過(guò)夜培養(yǎng)后，按1∶50的比例分裝到4瓶10 mL LB液體培養(yǎng)基 (Kana+)，設(shè)置A、B、C和D 4個(gè)誘導(dǎo)組。誘導(dǎo)組在37 ℃ 溫度條件下，200 r/min振蕩培養(yǎng) 3 h 至OD600 nm為0.6，再分別加入0.5 mmol/L IPTG 誘導(dǎo)劑，同時(shí)在C組和D組中加入0.5 mmol/L CuSO4和0.1 mmol/L 的ZnCl2添加劑誘導(dǎo)。誘導(dǎo)條件為A：37 ℃，未添加Cu2+/Zn2+； B：20 ℃，未添加Cu2+/Zn2+； C：37 ℃，添加0.5 mmol/L CuSO4和0.1 mmol/L 的ZnCl2； D：20 ℃，添加0.5 mmol/L CuSO4和0.1 mmol/L 的ZnCl2。誘導(dǎo)6 h后收集各組所得菌液，冰上超聲破碎 (39 W，超聲15 s，間隔15 s，冰浴)，10% SDS-PAGE電泳檢測(cè)各組rScCu/Zn-SOD可溶性表達(dá)。

優(yōu)化最佳誘導(dǎo)條件確定后，進(jìn)行大量誘導(dǎo)表達(dá)。按1∶100的比例接種于100 mL LB培養(yǎng)基，37 ℃ 恒溫培養(yǎng)至OD600 nm值為 0.6，加入IPTG (120 mg/mL) 終濃度 1 mmol/L，誘導(dǎo)最佳時(shí)間 6 h。

分裝誘導(dǎo)后的菌液，4 ℃ 4 100 g離心，收集菌體。每管菌體中加入6 mL預(yù)冷的1×Binding Buffer 重懸菌體，冰浴中超聲破碎(功率39 W，超聲15 s，間隔15 s)細(xì)胞10 min，至菌液澄清后4 ℃，7 000 r/min離心30 min，收集上清與沉淀，再通過(guò)10% SDS-PAGE電泳檢測(cè)rScCu/Zn-SOD在上清及沉淀中的表達(dá)情況。

1.5 rScCu/Zn-SOD的純化

取1 mL pET-30a+ScCu/Zn-SOD重組表達(dá)菌加入100 mL液體LB培養(yǎng)基(Kana+)中，37 ℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)3 h至OD600 nm為0.6，再加入0.5 mmol/L CuSO4、0.1 mmol/L ZnCl2和0.5 mmol/L 終濃度的IPTG，在20 ℃ 條件下進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)6 h后取少量菌液用于1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)是否表達(dá)。將剩余的菌液進(jìn)行超聲破碎，收集破碎后上清液用于純化。

參照AmerSham Biosciences 公司Ni2+離子親和層析方法純化重組蛋白，取超聲破碎后上清液加入到已平衡的Ni-NTA His.Bind 層析柱中，先用20 mmol/L 咪唑濃度的洗脫緩沖液(300 mmol/L NaCl，50 mmol/L NaH2PO4，20 mmol/L 咪唑，pH 8.0)洗脫柱子，再用300 mmol/L 咪唑濃度的洗脫緩沖液(300 mmol/L NaCl，50 mmol/L NaH2PO4，300 mmol/L 咪唑，pH 8.0)洗脫目的蛋白，收集目的蛋白并取少量進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)。純化完成后，將收集的目的蛋白液加入到透析袋中，完全浸泡在1 L TGE透析液(50 mmol/L Tris，0.5 mmol/L EDTA，50 mmol/L NaCl，10% 甘油，1% 甘氨酸，pH 8.0)中，4 ℃ 透析16 h以上。透析完成后，用干燥的聚乙二醇8 000進(jìn)行蛋白濃縮，待袋內(nèi)液體較少時(shí)將蛋白液分裝于2 mL的離心管中，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 rScCu/Zn-SOD濃度的測(cè)定

采用Bradfard蛋白定量試劑盒(南京建成生物科技有限公司)測(cè)定重組 rScCu/Zn-SOD蛋白的濃度，重復(fù)取樣測(cè)定4次，最后根據(jù)所得標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算目的蛋白濃度。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

注：樣品蛋白濃度=蛋白含量/所加樣品體積

1.7 rScCu/Zn-SOD酶活性的測(cè)定

參照超氧化物歧化酶試劑盒(測(cè)分型)(南京建成生物科技有限公司)說(shuō)明書(shū)，采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定rScCu/Zn-SOD的酶活性。待測(cè)樣品中的Cu/Zn-SOD對(duì)超氧陰離子具有專(zhuān)一性的抑制作用，使形成的亞硝酸鹽減少，比色時(shí)測(cè)定管在550 nm處的吸光值會(huì)低于對(duì)照管的吸光值，通過(guò)計(jì)算可求出待測(cè)樣品中的Cu/Zn-SOD活力。計(jì)算公式為Cu/Zn-SOD活力=(A0-A1)×D/(A0×50%×C)，A0和A1分別表示對(duì)照管吸光值和測(cè)定管吸光值，D為待測(cè)樣品的稀釋倍數(shù)，C是待測(cè)蛋白的濃度。

1.8 溫度、pH和SDS對(duì)rScCu/Zn-SOD活性的影響

取純化好的rScCu/Zn-SOD，分別檢測(cè)溫度、pH和SDS變性劑對(duì)該蛋白Cu/Zn-SOD活性的影響，為減少測(cè)定數(shù)據(jù)的誤差，每個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行組，并重復(fù)測(cè)定3次。溫度處理組中，將目的蛋白樣品分別置于4、25、37、50、60、70、80和90 ℃水浴中保溫10 min，再用酶標(biāo)儀分別測(cè)定各組的吸光值，計(jì)算酶活性。pH處理組中，將蛋白樣品分別加入pH 2～11的緩沖體系中，室溫孵育1 h后測(cè)定酶活性。緩沖體系的配置分別為0.2 mol/L Citrate Buffer (pH 2.0、3.0、4.0、5.0和6.0)，0.2 mol/L Tris-HCl Buffer (pH 7.0、8.0和9.0)以及0.2 mol/L Glycine/NaOH Buffer (pH 10.0和11.0)。變性劑處理組中，目的蛋白樣品加入SDS至終濃度為1%～10%，室溫處理1 h后測(cè)定酶活性。相對(duì)酶活力以各組測(cè)得的最高酶活性為100%，與其它條件下處理后測(cè)得的活性比較后獲得相對(duì)酶活性作最終參考值，并用Excel繪制圖。

1.9 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(M±SD)表示。

2 結(jié)果

2.1 重組表達(dá)質(zhì)粒雙酶切驗(yàn)證

利用ExCZSOD-F和ExCZSOD-R引物擴(kuò)增得到的ScCu/Zn-SOD基因表達(dá)片段大小為460 bp，pET-30a+ScCu/Zn-SOD重組表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切后出現(xiàn)質(zhì)粒和目的基因2個(gè)條帶，與預(yù)期大小相符(圖1)。測(cè)序結(jié)果顯示，回收得到的PCR產(chǎn)物序列與ScCu/Zn-SOD基因的編碼區(qū)DNA序列一致，表明ScCu/Zn-SOD+pET-30a重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖1 ScCu/Zn-SOD重組質(zhì)粒的雙酶切驗(yàn)證Fig.1 Identification of recombinant plasmid of ScCu/Zn-SOD by restriction enzyme digestion M.DNA Marker (DL2000);1.目的基因PCR產(chǎn)物;2.原始pET-30a質(zhì)粒;3.重組后質(zhì)粒;4.重組質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物

2.2 原核誘導(dǎo)表達(dá)

預(yù)測(cè)ScCu/Zn-SOD的蛋白分子量為17.0 ku，His標(biāo)簽分子量約為6.5 ku，所以ScCu/Zn-SOD融合蛋白大小約為23 ku。SDS-PAGE檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，0.5 mmol/L IPTG終濃度誘導(dǎo)后菌體在23 ku處有蛋白表達(dá)(泳道1～5)，與預(yù)測(cè)蛋白大小一致。與陰性菌株(空白DE3，泳道8)和未誘導(dǎo)的陽(yáng)性菌株(0 h，泳道1)相比，IPTG誘導(dǎo)后重組蛋白明顯表達(dá)，且隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加，其表達(dá)量也明顯增加(泳道1～5)；同時(shí)發(fā)現(xiàn)超聲破碎后的上清(泳道7)中也有可溶性的目的蛋白表達(dá)(圖2)。

圖2 重組ScCu/Zn-SOD的表達(dá)Fig.2 The expression of the recombinant ScCu/Zn-SODM.蛋白質(zhì)Marker;1.未誘導(dǎo)的ScCu/Zn-SOD融合蛋白;2.IPTG誘導(dǎo)后2 h的ScCu/Zn-SOD融合蛋白;3.IPTG誘導(dǎo)后4 h的ScCu/Zn-SOD融合蛋白;4.IPTG誘導(dǎo)后6 h的ScCu/Zn-SOD融合蛋白;5.IPTG誘導(dǎo)后8 h的ScCu/Zn-SOD融合蛋白;6.IPTG誘導(dǎo)8 h后的沉淀;7.IPTG誘導(dǎo)8 h后的上清;8.空白DE3菌。

2.3 rScCu/Zn-SOD的誘導(dǎo)條件優(yōu)化和純化

37 ℃誘導(dǎo)條件下，重組ScCu/Zn-SOD蛋白主要是以包涵體的形式存在于大腸桿菌菌液中(泳道1和5)。在誘導(dǎo)時(shí)補(bǔ)充Cu2+/Zn2+后可在上清中少量表達(dá)(泳道6)；20 ℃誘導(dǎo)條件下，雖然目的蛋白主要還是以包涵體的形式存在(泳道3,7)，但上清中也同樣有少量表達(dá)(泳道4,8)。補(bǔ)充Cu2+/Zn2+后，上清中的目的蛋白的表達(dá)量明顯升高(泳道8)。將20 ℃補(bǔ)充Cu2+/Zn2+誘導(dǎo)6 h后超聲上清中的目的重組蛋白進(jìn)行純化，SDS-PAGE蛋白膠電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，在23 ku處得到單一的目的蛋白條帶(圖3)。

圖3 重組ScCu/Zn-SOD的誘導(dǎo)條件優(yōu)化(A)及蛋白純化(B)Fig.3 The optimum induction condition (A) and protein purification (B) of the recombinant ScCu/Zn-SODA.不同條件下誘導(dǎo)重組ScCu/Zn-SOD蛋白在DE3中的蛋白表達(dá)。M.蛋白質(zhì)Marker,1.37 ℃未添加Cu2+/Zn2+誘導(dǎo)后的沉淀;2.37 ℃未添加Cu2+/Zn2+誘導(dǎo)后的上清;3.20 ℃未添加Cu2+/Zn2+誘導(dǎo)后的沉淀;4.20 ℃未添加Cu2+/Zn2+誘導(dǎo)后的上清;5.37 ℃添加Cu2+/Zn2+誘導(dǎo)后的沉淀;6.37 ℃添加Cu2+/Zn2+誘導(dǎo)后的上清;7.20 ℃添加了Cu2+/Zn2+誘導(dǎo)后的沉淀;8.20 ℃添加了Cu2+/Zn2+誘導(dǎo)后的上清。B.rScCu/Zn-SOD的純化。

2.4 純化后rScCu/Zn-SOD的濃度和活性

標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=0.012 4x+0.037 9(圖4)。待測(cè)蛋白樣品OD595 nm的平均值為0.07，計(jì)算得到純化后rScCu/Zn-SOD的濃度為0.14 mg/mL，酶活性為108.5 U/mg。

圖4 BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Standard curve of BSA

2.5 溫度、pH和SDS對(duì)rScCu/Zn-SOD酶活性的影響

rScCu/Zn-SOD的酶活性在37 ℃最高，與其它溫度下測(cè)得的酶活性比較，在25～60 ℃保溫10 min后的rScCu/Zn-SOD的酶活性穩(wěn)定，相對(duì)酶活性保持在75%以上；低溫和高溫處理均會(huì)導(dǎo)致該酶活性的減弱，尤其在80 ℃以上高溫處理后，相對(duì)酶活性迅速降到20%以下(圖5A)。

在pH<4條件下，處理rScCu/Zn-SOD 1 h后，酶完全失活。隨著pH的升高酶活逐漸升高。在pH 7 時(shí)，酶活性最高；當(dāng)pH>10時(shí)，酶活性迅速降低到30%以下(圖5B)。

以1%濃度的變性劑SDS處理后測(cè)得的酶活性為100%，隨著SDS濃度的升高，該酶活性呈下降趨勢(shì)，在5%濃度中的酶活性在70%以上，當(dāng)SDS濃度升高到6%后，酶活性迅速降低到30%以下，表明該酶可耐受5%濃度的SDS(圖5C)。

圖5 溫度(A)、pH(B)和SDS(C)對(duì)重組ScCu/Zn-SOD蛋白酶活性的影響Fig.5 Effects of temperature (A), pH (B) and SDS (C) on the enzyme activities of rScCu/Zn-SOD

3 討論

在多種生物中克隆得到的Cu/Zn-SOD基因cDNA通過(guò)重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)均成功誘導(dǎo)表達(dá)出具有生物活性的融合蛋白[12,21-23]。褶紋冠蚌(Cristariaplicata)Cu/Zn-SOD通過(guò)構(gòu)建pET-30a重組表達(dá)質(zhì)粒，在大腸桿菌中成功誘導(dǎo)出0.6 mg/mL的高純度融合蛋白，酶活性高達(dá)5 300 U/mg[21]；人Cu/Zn-SOD與pGEX-2T構(gòu)建的重組質(zhì)粒，在大腸桿菌中獲得40%以上的高效表達(dá)，并分離和純化得到酶活1 210 U/mg的融合蛋白[23]；此外，從斑馬魚(yú)體內(nèi)克隆得到的Cu/Zn-SOD基因cDNA與pET-20b質(zhì)粒重組后在大腸桿菌中也誘導(dǎo)獲得酶活性為2 000 U/mL的融合蛋白[13]，黑鯛體內(nèi)克隆得到的Cu/Zn-SOD基因cDNA與pET-20b質(zhì)粒重組后在大腸桿菌中也誘導(dǎo)獲得酶活性為1 600 U/mL的融合蛋白[14]。當(dāng)外源基因在體外快速轉(zhuǎn)錄表達(dá)過(guò)程中，翻譯后的肽鏈常常未能正常折疊，容易導(dǎo)致包涵體的形成[24]。ScCu/Zn-SOD在37 ℃誘導(dǎo)條件下，目的蛋白主要以包涵體的形式存在于沉淀中，而在20 ℃誘導(dǎo)時(shí)，上清中出現(xiàn)了可溶性的目的蛋白，表明降低誘導(dǎo)溫度可實(shí)現(xiàn)蛋白體外的可溶性表達(dá)。另外，在誘導(dǎo)時(shí)通過(guò)添加Cu2+/Zn2+后可增加目的蛋白在上清中的表達(dá)量，說(shuō)明在誘導(dǎo)時(shí)適量加入Cu2+/Zn2+離子也可促進(jìn)Cu/Zn-SOD蛋白的可溶性表達(dá)。

重組誘導(dǎo)獲得的融合蛋白常帶有His、GST、HSV、Trx和Nus等特異性標(biāo)簽蛋白，在金屬離子親和層析中可與相應(yīng)的金屬離子特異性結(jié)合，從而可分離純化出所需目的蛋白[25]。在構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒過(guò)程中，通過(guò)表達(dá)載體引入His親和標(biāo)簽可以進(jìn)行重組蛋白純化。利用表達(dá)載體引入His親和標(biāo)簽已經(jīng)成功地獲得褶紋冠蚌[21]、海灣扇貝(Argopectenirradias)[22]、斑馬魚(yú)[13]和人[23]的重組Cu/Zn-SOD蛋白。本研究采用的pET-30a表達(dá)載體，帶有6個(gè)His組成的親和標(biāo)簽，通過(guò)Ni離子親和層析純化后得到目的重組ScCu/Zn-SOD蛋白，并測(cè)得該蛋白濃度為0.14 mg/mL，Cu/Zn-SOD酶活力為108.5 U/mg。

Cu/Zn-SOD是一種金屬蛋白酶，酶活性受到溫度、pH、變性劑和金屬離子等因素的影響[26]。從羅非魚(yú)(Oreochromisniloticus)[27]、鯊魚(yú)(Scoliadonsorrakowah)[28]中提取的Cu/Zn-SOD蛋白均可耐受70～80 ℃高溫，表明天然形式的Cu/Zn-SOD蛋白具有較高的熱穩(wěn)定性。重組得到的人Cu/Zn-SOD蛋白在25～70 ℃溫度范圍內(nèi)具有穩(wěn)定的酶活性[23]。重組褶紋冠蚌Cu/Zn-SOD蛋白在10～60 ℃范圍內(nèi)酶的活性維持在80%以上[21]。本研究中重組ScCu/Zn-SOD蛋白在25～60 ℃范圍內(nèi)保持75%以上的酶活性，在80 ℃高溫下才出現(xiàn)酶活性大幅下降。因此，通過(guò)重組獲得的Cu/Zn-SOD蛋白具有與天然形式Cu/Zn-SOD蛋白相同的熱穩(wěn)定性。

金屬蛋白酶所含金屬離子在強(qiáng)酸環(huán)境中易脫落，而在強(qiáng)堿環(huán)境中其自身分子構(gòu)象會(huì)發(fā)生不可逆變化，最終均會(huì)導(dǎo)致酶活性的減弱或喪失[29]。然而，可見(jiàn)紫外光譜和電子自旋共振顯示天然形式Cu/Zn-SOD酶結(jié)構(gòu)在pH 5.3～9.5范圍內(nèi)結(jié)構(gòu)保持不變，顯示出極強(qiáng)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性[30]。重組褶紋冠蚌Cu/Zn-SOD蛋白在pH 2.0～9.0范圍內(nèi)酶活性保持在75%以上[21]；重組人Cu/Zn-SOD蛋白在pH 5.0～10.5范圍內(nèi)酶活性維持穩(wěn)定[23]；斑馬魚(yú)的重組Cu/Zn-SOD蛋白在pH 7.5～11范圍內(nèi)均具有很高的酶活性[13]；海灣扇貝的重組Cu/Zn-SOD蛋白在pH 5.8～9.0范圍內(nèi)均具有很高的酶活性[22]。另外，SDS作為一種蛋白質(zhì)變性劑，可引起Cu/Zn-SOD蛋白分子構(gòu)象和電荷分布的改變，從而影響其酶活性[31]。斑馬魚(yú)重組Cu/Zn-SOD蛋白可耐受濃度為6%的SDS[13]、褶紋冠蚌重組Cu/Zn-SOD蛋白可耐受濃度為8%的SDS[21]、人重組Cu/Zn-SOD蛋白可耐受濃度為7%的SDS[25]。本研究中rScCu/Zn-SOD可耐受SDS的濃度為5%，表明rScCu/Zn-SOD的酶活性相對(duì)穩(wěn)定。

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(責(zé)任編輯：張瀟峮)

Analysis and characterization on recombinant protein ofCu/Zn superoxide dismutase fromSinipercachuatsi

XIAO Jun1, XU Liang-qing2, HU Xiang-ping1, CHENG Zhou-yu1,HU Bao-qing1, JIAN Shao-qing1, YANG Gang1, WEN Chun-gen1

(1.SchoolofLifeSciences,NanchangUniversity,Nanchang, 330031,China;2.InstituteofAnimalHusbandryandAquaculture,Nanchang, 330038,China)

Superoxide dismutases (SODs) are one family of important antioxidant enzymes involved in scavenging superoxide anion free radical in organisms. In the present paper, the expression primer was designed by Cu/Zn-SOD gene sequence ofSinipercachuatsi(named as ScCu/Zn-SOD, accession numbers: KJ558392.1). A truncated signal peptide sequence with 460 bp was amplified. After identification of the sequence, the constructed recombinant expression plasmid (pET-30a+ScCu/Zn-SOD) was transformed into BL21(DE3), and was expressed by induction with IPTG. The soluble recombinant protein of ScCu/Zn-SOD (designated as rScCu/Zn-SOD) was obtained by optimized expression condition, and the concentration and activity of rScCu/Zn-SOD was measured after the purification of recombinant protein. The results showed that the expression of ScCu/Zn-SOD could be induced under 20 ℃ and 37 ℃ conditions. The rScCu/Zn-SOD was mainly aggregated to form inclusion bodies at 37 ℃. The expression quantity of rScCu/Zn-SOD could be improved by reduction induction temperature and supplement Cu2+/Zn2+. The addition of 0.5 mmol/L CuSO4and 0.1 mmol/L ZnCl2in culture medium was optimal under 20 ℃ and 0.5 mmol/L IPTG condition, and the expression quantity of rScCu/Zn-SOD was obviously increased. The results can provide basic data for the research on functional characterization of SOD protein.

Sinipercachuatsi; Cu/Zn superoxide dismutase; Prokaryotic expression; Recombinant protein; Protein characterization

2016-08-04；

2016-11-02

南昌市科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2012-KJ2C-NY-SC-002)；國(guó)家自然基金(31472305, 31460697, 21467015)；江西省教育廳項(xiàng)目(GJJ12024, GJJ10378)；江西省自然科學(xué)基金 (20132BAB204019)

肖 俊(1991-)，男，碩士研究生，專(zhuān)業(yè)方向?yàn)樗a(chǎn)動(dòng)物疾病學(xué)。E-mail:874370756@qq.com 通訊作者：文春根。E-mail:cgwen@ncu.edu.cn

S917.4

A

1000-6907-(2017)02-0011-07