師偉++李娣

【摘 要】 目前國內(nèi)水生生物監(jiān)測手段已無法滿足快速發(fā)展的管理需求，PCR技術(shù)是一種新型的水生生物監(jiān)測技術(shù)，其具有簡便、靈敏、快速、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，將其應(yīng)用于水生生物監(jiān)測領(lǐng)域，可快速反應(yīng)水體中污染現(xiàn)狀，大大提高國內(nèi)水生生物監(jiān)測能力和水平。PCR技術(shù)對環(huán)境管理具有深遠(yuǎn)的意義。

【關(guān)鍵詞】 環(huán)境污染 監(jiān)測 基因

隨著經(jīng)濟(jì)與人口的快速發(fā)展，環(huán)境污染導(dǎo)致生態(tài)系統(tǒng)功能退化，以致引起生物多樣性降低，物種的分布與群落組成發(fā)生了巨大的變化。與此同時(shí)，分子水平上研究污染過程中污染物在生物體內(nèi)的吸收與遷移不斷受到人們的關(guān)注。PCR技術(shù)具有快速、靈敏、簡便等優(yōu)點(diǎn)，在環(huán)境監(jiān)測領(lǐng)域方面的應(yīng)用日趨顯現(xiàn)。

1 PCR技術(shù)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction；PCR）是一種用于放大擴(kuò)增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)，它可看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制，PCR的最大特點(diǎn)，是能將微量的DNA大幅增加。目前PCR技術(shù)在微生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等方面已得到較好的應(yīng)用[1]。這種技術(shù)具有簡便、快速、靈敏的特點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于基因獲取、基因定點(diǎn)突變、DNA序列分析、醫(yī)學(xué)診斷、基因檢測等方面。PCR技術(shù)也成為微生物領(lǐng)域重要的監(jiān)測手段，在此基礎(chǔ)上發(fā)展起來的Real-time PCR（實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)），以Power SYBR Green（熒光標(biāo)記染料）和熔解曲線為基礎(chǔ)，可用于檢測不同的核苷酸序列；相對于普通PCR，熒光定量PCR（RT-PCR）能對樣品中的目標(biāo)生物進(jìn)行相對或絕對定量，且靈敏度高，可重復(fù)性強(qiáng)，便于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的比較等諸多優(yōu)勢。

近年來，實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)開始在環(huán)境領(lǐng)域中顯示巨大生機(jī)。迅猛發(fā)展的PCR技術(shù)使生物監(jiān)測深入到分子水平，形成了一系列可依據(jù)多種分子技術(shù)來進(jìn)行生物監(jiān)測的分子學(xué)方法。如熒光定量PCR可以用來檢測環(huán)境中的微生物在河流中隨季節(jié)的變化情況。熒光定量PCR還可以用來檢測地表水和飲用水中致病菌的含量。對于微生物，特別能快速監(jiān)測具有高效去除營養(yǎng)物質(zhì)能力的微生物，熒光定量PCR能快速監(jiān)測[2]。如利用PCR技術(shù)能定量污水處理廠一級硝化處理后混合液懸浮固體中總細(xì)菌、硝化螺菌屬數(shù)量、氨氧化細(xì)菌數(shù)量，從而可以實(shí)時(shí)掌握污水處理情況。法國國家研究中心從活動熱泉附近的一個(gè)沉積物核中提取DNA來研究原生動物物種進(jìn)化關(guān)系，利用測得的DNA序列數(shù)據(jù)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹時(shí)，發(fā)現(xiàn)沉積物中至少含有兩種遺傳組成上與已知原生生物差異極大的細(xì)菌，發(fā)現(xiàn)了許多新原生生物世系。這些發(fā)現(xiàn)為水生生物基因?qū)W分類開創(chuàng)了先河，也將推動基因?qū)W在更廣泛的領(lǐng)域得到應(yīng)用。2003年初，Hebert等[3]首次提出了DNA條形碼的概念。DNA條形碼技術(shù)（DNA barcoding）是通過對一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)目的基因的DNA序列進(jìn)行分析從而進(jìn)行物種鑒定的技術(shù)，用DNA序列作為標(biāo)記來與物種信息建立一一對應(yīng)關(guān)系。DNA條形碼是指利用短的標(biāo)準(zhǔn)DNA序列的核苷酸多樣性進(jìn)行物種的鑒定和快速識別。

2 在水生生物監(jiān)測領(lǐng)域的應(yīng)用

目前水生生物監(jiān)測主要包括水體中微生物、浮游動物、底棲動物等類群的監(jiān)測，通過野外觀測水體中指示物種、群落結(jié)構(gòu)組成和多樣性，了解和掌握實(shí)際水體中環(huán)境污染的狀況。全世界每年有2億5千萬人感染水源性疾病，因此而死亡的人數(shù)為1千萬-2千萬。這要求對水體中致病菌進(jìn)行準(zhǔn)確檢測，以保證后續(xù)工作的正常開展。研究者[4]發(fā)現(xiàn)PCR技術(shù)對星狀病毒的檢測比電鏡技術(shù)更為靈敏，并可鑒定這一病毒的不同血清型。

隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，以及人們對PCR技術(shù)的研究的深入，PCR技術(shù)能夠從單個(gè)環(huán)境樣品中獲取DNA。在水生生物監(jiān)測方面，當(dāng)前國際上美國EPA，加拿大環(huán)保署以及歐洲的一些科研單位正在開展PCR技術(shù)在水生生態(tài)監(jiān)測中的應(yīng)用研究；在我國，水生生物監(jiān)測仍使用傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鏡檢，目前僅有少數(shù)研究利用分子生物學(xué)技術(shù)[5-6]，更沒有形成一定的體系，以前行業(yè)規(guī)范。

3 PCR技術(shù)用于水生生物監(jiān)測的優(yōu)缺點(diǎn)

相對于之前的監(jiān)測方法，PCR技術(shù)具有四大優(yōu)勢：（1）操作過程快速簡便，非專業(yè)分類學(xué)者也可利用PCR數(shù)據(jù)庫完成鑒定工作，（2）易于構(gòu)建統(tǒng)一鑒定標(biāo)準(zhǔn)，（3）成本低，（4）易于質(zhì)量控制。

相對于傳統(tǒng)的監(jiān)測方法，PCR技術(shù)的不足：（1）假陽性問題，當(dāng)不相關(guān)的核酸分子中存在與模板非常相似的堿基序列時(shí)，PCR很可能做出假陽性的結(jié)果，這要求在引物的設(shè)計(jì)上要更為嚴(yán)格、更為細(xì)心。（2）質(zhì)控問題，由于PCR靈敏度高，要求實(shí)驗(yàn)過程中不能帶入干擾物質(zhì)，無菌操作環(huán)境。（3）前期投入成本高，PCR鑒定水生生物多樣性，需先構(gòu)建本土物種PCR基因數(shù)據(jù)庫，這要求投入大量的人力、物力、財(cái)力。

盡管如此，相信未來隨著人們研究的不斷深入，技術(shù)方法的不斷優(yōu)化，PCR技術(shù)將會給水生生物監(jiān)測注入新的生命力。

參考文獻(xiàn)：

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