黃松++陳敬有++高皓

[摘要]目的 探討骨碎補(bǔ)總黃酮對骨質(zhì)疏松癥大鼠BMP-2蛋白表達(dá)及血清骨鈣素水平的影響。方法 通過摘除大鼠卵巢的方法復(fù)制骨質(zhì)疏松癥模型，并將大鼠分成正常組、假手術(shù)組、模型組、骨碎補(bǔ)總黃酮組和鈣爾奇D片組。手術(shù)后第7天開始給藥，1次/d，連續(xù)12周，HE染色觀察大鼠骨組織形態(tài)學(xué)變化，ELISA檢測各組大鼠股骨中BMP-2蛋白表達(dá)情況以及血清中的骨鈣素水平。結(jié)果HE染色結(jié)果顯示，骨碎補(bǔ)總黃酮組大鼠股骨組織的骨小梁數(shù)量、密度、布局及完整性均優(yōu)于模型組，且大鼠股骨組織中BMP-2蛋白表達(dá)量[（13.469±0.215）pg/ml]和血清中骨鈣素水平[（1.61±0.09）μg/L]均分別高于模型組的（5.516±0.119）pg/ml和（0.76±0.22）μg/L（P<0.05），接近于假手術(shù)組的（15.279±0.211）pg/ml和（1.34±0.17）μg/L（P>0.05）。結(jié)論 骨碎補(bǔ)總黃酮治療骨質(zhì)疏松癥大鼠的效果顯著，其作用機(jī)制可能是通過上調(diào)股骨組織中BMP-2蛋白和血清中的骨鈣素水平，進(jìn)而促進(jìn)骨組織的形成。

[關(guān)鍵詞]骨質(zhì)疏松癥；骨碎補(bǔ)總黃酮；骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2；骨鈣素

[中圖分類號] R332 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-4721（2017）02（a）-0012-04

[Abstract]Objective To explore the effect of Total Flavonoids of RhizomaDrynariae on BMP-2 protein expression and serum bone gla protein level in rats with osteoporosis.Methods Osteoporosis model was established by removing rat ovary，and the rats were divided into normal group，sham operation group，model group，total Flavonoids of Rhizoma Drynariae group and Caltrate D Tablet group.In the seventh days after surgery，drugs were used once per day for 12 consecutive weeks.Morphological change of bone tissue in rats was observed by HE staining，and the expression of BMP-2 protein and the level of serum bone gla protein level in the femur of rats in each group was detected by ELISA.Results HE staining indicated that the number，density，distribution，and integrity of bone trabecula in the rats femoral bone tissue in the Total Flavonoids of Rhizoma Drynariae group were superior to those in the model group.The protein expression of BMP-2 in rats femoral bone tissue and the level of serum bone gla protein [（13.469±0.215 ） pg/ml and （1.61±0.09） μg/L respectively] was much higher than that in the model group [（5.516±0.119） pg/ml and （0.76±0.22） μg/L respectively] （P<0.05）.The protein expression and serum bone gla protein level was close to that in the sham operation group respectively[（15.279±0.211） pg/ml and （1.34±0.17） μg/L] （P>0.05）.Conclusion In the treatment of rats with osteoporosis，Total Flavonoids of Rhizoma Drynaria can obtain a great effect.The possible mechanism is through up-regulation of BMP-2 protein in the femoral bone tissue and the level of serum bone gla protein，thus promoting the formation of bone tissue.

[Key words]Osteoporosis；Total Flavonoids of Rhizoma Drynaria；Bone morphogenetic protein-2；Bone gla protein

骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis，OP）是一種比較常見的疾病，主要是以骨量減少、骨組織微結(jié)構(gòu)退化為特征，導(dǎo)致骨脆性增加，骨折率高發(fā)[1]。骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）是一種與骨組織生長相關(guān)的多功能糖蛋白，是最主要的骨形成調(diào)控因子，能夠誘導(dǎo)未分化的間充質(zhì)細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞，進(jìn)而誘導(dǎo)新骨的形成[2-3]，BMP-2是誘導(dǎo)成骨活性最強(qiáng)的骨形態(tài)發(fā)生蛋白之一，能夠直接反映新骨形成情況。骨鈣素（bone gla protein，BGP）是由成骨細(xì)胞分泌的一種激素樣多肽，比較穩(wěn)定，不受骨吸收因素的影響，能夠反映新形成的成骨細(xì)胞的活動狀態(tài)，是臨床上反映骨代謝狀況的特異性生化指標(biāo)[4]。成骨細(xì)胞分化末期特異性表達(dá)的BGP能調(diào)控骨礦物的沉積和轉(zhuǎn)移，促進(jìn)成骨細(xì)胞成熟及骨細(xì)胞的形成[5-6]。目前治療OP的臨床藥物極多[7]，其中以中藥材藥物最為突出[8]，中藥具有療效好、副作用小、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠等特點(diǎn)，因此受到了人們的關(guān)注。骨碎補(bǔ)總黃酮是中藥材骨碎補(bǔ)根莖的提取物，研究發(fā)現(xiàn)骨碎補(bǔ)總黃酮對OP導(dǎo)致的骨密度下降有明顯的抑制作用[9]，而且還可以在抑制破骨細(xì)胞活性的同時促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖[10-11]，因此，骨碎補(bǔ)總黃酮是一種常見的治療老年性O(shè)P的中藥材，但有關(guān)骨碎補(bǔ)總黃酮治療老年性O(shè)P的機(jī)制研究還不全面。本研究應(yīng)用OP動物模型，探討骨碎補(bǔ)總黃酮對OP模型大鼠血清BGP和BMP-2蛋白的影響，進(jìn)一步為骨碎補(bǔ)總黃酮有效治療OP提供新的機(jī)制論點(diǎn)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物

雌性健康的Wistar大鼠50只，鼠齡5～6個月，體重（243±21）g，未曾交配，購自于湖北省實(shí)驗(yàn)動物中心。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

骨碎補(bǔ)總黃酮（商品名：強(qiáng)骨膠囊，生產(chǎn)批號：150412，北京岐黃制藥有限公司），鈣爾奇D片（生產(chǎn)批號：150710，惠氏制藥有限公司），大鼠BGP（OT）ELISA檢測試劑盒（上海研謹(jǐn)生物科技有限公司），BMP-2試劑盒（AMEKO），多功能酶標(biāo)儀（型號：Infinite M200，Tecan），低溫高速離心機(jī)（型號：ST40R，Thermo），解剖手術(shù)器械（上海醫(yī)療器械手術(shù)器械有限公司）。

1.3動物分組及造模

實(shí)驗(yàn)前將動物隨機(jī)分為兩組，正常組（10只）和手術(shù)組（40只）。將手術(shù)組動物分別沿左右軟肋下剪開皮膚，分離皮膚筋膜及腹膜臟層，暴露腹腔，預(yù)留假手術(shù)組10只，其他大鼠進(jìn)行結(jié)扎及剪除整個卵巢組織，分層縫合后，外層皮膚消毒，正常飼養(yǎng)，手術(shù)過程中無大鼠死亡。術(shù)后7 d再將手術(shù)組存活的大鼠隨機(jī)分成4組（每組小鼠數(shù)量一致，各8只），即假手術(shù)組、模型組、骨碎補(bǔ)總黃酮組和鈣爾奇D片組。

1.4給藥及取材

手術(shù)后第7天開始給藥，每天上午灌胃1次，連續(xù)12周。根據(jù)人與大鼠體表面積計(jì)算大鼠的骨碎補(bǔ)黃酮和鈣爾奇D片用藥使用量，正常組、假手術(shù)組和模型組以等量的生理鹽水灌胃。灌胃期間，每周一對大鼠體表面積進(jìn)行重新估算，以調(diào)整給藥劑量。灌胃第12周后，禁食24 h后，眼球取血，-20℃保存。取血后，用10%水合氯醛按0.3 ml/100 g體重肌內(nèi)注射麻醉后，在無菌條件下，取右后肢股骨干骺端，剝離附著的肌肉及解體組織，充分暴露股骨頭，用消毒后的老虎鉗將股骨頭鉗碎，放入無菌的EP管中，做好標(biāo)記，一部分用于石蠟包埋，一部分用于提取骨組織中的蛋白。

1.5 HE染色

取小鼠股骨組織剪碎成3～5 mm后，經(jīng)10%甲醛固定，10%硝酸溶液脫鈣后，自來水水洗過夜，石蠟包埋，切片厚度為4 μm，至于65℃恒溫烘箱烤片6 h左右。將組織切片常規(guī)脫蠟至水，水洗1～2 min，蘇木精染液染色3～6 min，流水洗去蘇木精染液1～2 min，然后放入1%鹽酸乙醇1～3 s，稍水洗1～2 s，促藍(lán)液返藍(lán)5～10 s，水洗15～30 s，0.5%伊紅染液染色2～3 min，蒸餾水洗1～2 s，80%乙醇15～30 s，95%乙醇15～30 s，無水乙醇1～2 s，分別在二甲苯Ⅰ、Ⅱ中透明2次，每次2～3 s，中性樹膠封片。在光學(xué)顯微鏡下（×100），觀察各組小鼠股骨組織片HE染色情況。

1.6大鼠股骨中BMP-2蛋白和血清中BGP的測量

按照ELISA檢測試劑盒的說明書要求進(jìn)行，用酶標(biāo)儀在450 nm波長依序測量各孔的吸光度值（D），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算大鼠股骨組織中BMP-2蛋白的實(shí)際濃度以及各組血清中BGP水平。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以x±s表示，多組間比較采用方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1大鼠股骨組織HE染色

如圖1A、B所示，正常組和假手術(shù)組大鼠股骨組織形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，骨細(xì)胞位于骨髓腔中央，骨髓腔較小，骨小梁粗細(xì)一致，相互連接成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，無斷裂現(xiàn)象，骨小梁之間間隙較小。模型組大鼠隨著卵巢組織被摘除，雌激素分泌減少，骨組織形態(tài)結(jié)構(gòu)不完整，骨小梁丟失、斷裂嚴(yán)重，骨小梁之間連接點(diǎn)較少，分布稀疏凌亂，游離末端增多，間距增大，骨髓腔融合嚴(yán)重，出現(xiàn)典型的骨質(zhì)疏松病理形態(tài)改變，如圖1C所示。骨碎補(bǔ)總黃酮組大鼠股骨組織與模型組相比較，骨小梁增厚，斷裂減少，連接點(diǎn)增多，尚可連接成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，骨小梁數(shù)量較多，密度增大，排列規(guī)則，完整性明顯優(yōu)于模型組，但比正常組和假手術(shù)組稍差，如圖1D所示。鈣爾奇D片組與骨碎補(bǔ)總黃酮組比較，骨小梁斷裂較多，結(jié)構(gòu)不完整，連接點(diǎn)較少，具有較多的游離末端；但是與模型組比較，鈣爾奇D片組骨小梁數(shù)量、密度、連接狀態(tài)以及完整性均優(yōu)于模型組，如圖1E所示。

2.2 ELISA檢測大鼠骨中BMP-2蛋白表達(dá)情況

各組大鼠股骨中BMP-2蛋白表達(dá)情況如表1所示，鈣爾奇D片組和模型組與正常組比較，BMP-2蛋白濃度明顯下降（P<0.05）。與模型組比較，骨碎補(bǔ)總黃酮組和鈣爾奇D片組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示這兩組藥物均能顯著提高大鼠股骨中的BMP-2蛋白表達(dá)，與正常組比較，鈣爾奇D片組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而骨碎補(bǔ)總黃酮組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），提示骨碎補(bǔ)總黃酮對OP的治療效果比鈣爾奇D片顯著。

2.3大鼠血清的BGP水平變化

模型組與正常組、假手術(shù)組比較，BGP濃度下降明顯（P<0.05），提示OP中骨代謝異常，BGP水平較低；骨碎補(bǔ)總黃酮組和鈣爾奇D片組的BGP濃度高于正常組（P>0.05），骨碎補(bǔ)總黃酮組和鈣爾奇D片組與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表2），提示骨碎補(bǔ)總黃酮組和鈣爾奇D片組能提高OP大鼠血清中的BGP含量，從而促進(jìn)骨質(zhì)合成，從結(jié)果上看，骨碎補(bǔ)總黃酮組的療效好于鈣爾奇D片組。

3討論

骨骼是人體重要的一個組成成分，它不僅具有生命力還具有一定的彈性和韌性，賦予人類運(yùn)動的功能，然而各種骨類疾病的發(fā)生給人類的生活質(zhì)量造成很大影響。BMP是一種存在于骨基質(zhì)中的酸性糖蛋白，也是一種能夠誘導(dǎo)骨組織形成的生長因子，例如能夠誘導(dǎo)人體間充質(zhì)細(xì)胞分化為骨、韌帶、軟骨、肌腱和神經(jīng)組織[12-13]。骨修復(fù)過程受到多種因子的調(diào)節(jié)，而BMP-2就是其中最重要的調(diào)節(jié)因子之一。機(jī)體受到相應(yīng)外界信號刺激時，BMP-2與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合，將信息轉(zhuǎn)遞至細(xì)胞核內(nèi)，通過轉(zhuǎn)錄激活相關(guān)物質(zhì)促進(jìn)骨組織的再生[14]。BGP是成骨細(xì)胞分泌的一種激素樣多肽，是骨代謝狀況的特異性生化指標(biāo)，能特異性反映成骨細(xì)胞的活性[15]。BGP由成骨細(xì)胞分泌后沉積在骨組織的間質(zhì)細(xì)胞外，最后釋放至血液中，因此血液中的BGP與骨組織中BGP含量成正相關(guān)[16]。雌激素能夠通過促進(jìn)骨樣細(xì)胞增殖分化和誘導(dǎo)骨細(xì)胞成熟，達(dá)到促使骨形成的作用[17-18]，而破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞中也存在雌激素受體，因此常使用摘除動物卵巢的方法制備OP動物模型[19-20]。本研究采用摘除大鼠卵巢的方法復(fù)制OP模型，以及通過檢測BMP-2蛋白表達(dá)以及BGP水平來探討骨碎補(bǔ)總黃酮組治療OP可能存在的機(jī)制。

根據(jù)大鼠股骨組織HE染色結(jié)果，可以看出模型組大鼠股骨骨組織形態(tài)結(jié)構(gòu)不完整，骨小梁丟失、斷裂嚴(yán)重，骨小梁之間連接點(diǎn)較少，分布稀疏凌亂，游離末端增多，間距增大，骨髓腔融合嚴(yán)重，是典型的骨質(zhì)疏松病理形態(tài)改變，說明造模成功。持續(xù)給藥12周后，骨碎補(bǔ)總黃酮組大鼠骨小梁增厚，斷裂減少，連接點(diǎn)增多，同時骨小梁數(shù)量較多，密度增大，排列規(guī)則，說明骨碎補(bǔ)總黃酮能明顯改善OP病情。且模型組中BMP-2蛋白表達(dá)量和血清BGP水平與正常組比較顯著性降低，說明OP大鼠機(jī)體內(nèi)BMP-2蛋白處于低表達(dá)水平，血清BGP處于低水平狀態(tài)；然而骨碎補(bǔ)總黃酮組與模型組比較，大鼠體內(nèi)BMP-2蛋白表達(dá)和血清BGP處于較高水平狀態(tài)，說明骨碎補(bǔ)總黃酮組能夠提高OP大鼠機(jī)體內(nèi)BMP-2蛋白表達(dá)和血清BGP水平。另外，鈣爾奇D片組大鼠股骨骨組織骨小梁密度、數(shù)量及完整性稍差于骨碎補(bǔ)總黃酮組，優(yōu)于模型組，大鼠機(jī)體內(nèi)BMP-2蛋白表達(dá)和血清BGP水平也稍低于骨碎補(bǔ)總黃酮組，說明骨碎補(bǔ)總黃酮的療效更佳，因而，骨碎補(bǔ)總黃酮有效治療老年OP的機(jī)制可能是通過提高骨內(nèi)BMP-2蛋白表達(dá)和血清中的BGP水平來實(shí)現(xiàn)的。

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（收稿日期：2016-12-25 本文編輯：許俊琴）