張 明 葉翠標(biāo)

（1.廉江市石嶺畜牧獸醫(yī)站，廣東廉江 524456；2.廉江市石城畜牧獸醫(yī)站，廣東廉江 524400）

雞弓形蟲診斷抗原的篩選探討

張 明1葉翠標(biāo)2

（1.廉江市石嶺畜牧獸醫(yī)站，廣東廉江 524456；2.廉江市石城畜牧獸醫(yī)站，廣東廉江 524400）

雞弓形蟲診斷抗原的篩選對(duì)于雞肉產(chǎn)品的質(zhì)量控制、人弓形蟲的防治有重要意義。ELSA是一種對(duì)雞弓形蟲感染篩查診斷技術(shù)，通過分離培養(yǎng)弓形蟲，然后制作模型，能夠獲得足夠量的弓形蟲速殖子，提取速殖子全蟲蛋白，而后蟲蛋白后電泳，獲得弓形蟲的全蟲蛋白，以此作為抗原進(jìn)行Western blot，能夠發(fā)現(xiàn)抗原，即敏感的蛋白條帶，能基于該抗原的ELSEA方法，明確ELSEA最佳工作條件，評(píng)價(jià)診斷的敏感度。

雞弓形蟲；抗原；診斷

剛地弓形蟲簡(jiǎn)稱弓形蟲或弓形體，是一種廣泛寄生于人和動(dòng)物原蟲。弓形蟲是一種血源性寄生蟲，傳播性強(qiáng)，感染率高，人感染力高達(dá)20～50%，可爆發(fā)性流行。雞是弓形蟲的重要中間宿主，在中間宿主體內(nèi)以速殖子的形態(tài)進(jìn)行無性生殖，可入侵大多數(shù)的有核細(xì)胞，以二分裂、內(nèi)二芽、裂體增殖的方式進(jìn)行不斷的繁殖。在慢性病例中，可在腦、肌肉等處快速增殖形成包囊。感染弓形蟲的雞是人類感染弓形蟲的主要來源，食用未經(jīng)充分烹調(diào)，含有弓形蟲包囊的雞肉制品是人類感染弓形蟲的重要原因。有報(bào)道顯示，中國地區(qū)散養(yǎng)雞的弓形蟲感染率約為10～50%，感染防控不容樂觀。對(duì)雞進(jìn)行弓形蟲的診斷，有助于降低人感染弓形蟲風(fēng)險(xiǎn)。本次研究嘗試探討探討雞弓形蟲診斷抗原的篩選策略，為今后的研究提供依據(jù)。

1 雞弓形蟲感染診斷

弓形蟲的感染診斷主要包括病原學(xué)診斷、核酸檢測(cè)、免疫診斷等。病原學(xué)檢查包括涂片或組織染色鏡檢，涂片檢查主要針對(duì)病死動(dòng)物的病料，處理時(shí)間長(zhǎng)，有一定的特異性。動(dòng)物或細(xì)胞接種實(shí)驗(yàn)是一種經(jīng)典的監(jiān)測(cè)方法，但敏感性較低，應(yīng)用范圍較狹窄，不適合大規(guī)模樣本的抽查。分子生物學(xué)檢查以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）為代表，具有敏感、特異、快捷的特點(diǎn)，可提取病料的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，監(jiān)測(cè)弓形蟲把基因片段，巢式PCR的敏感度較高，最低檢出限18fg弓形蟲DNA。血清學(xué)診斷包括染色實(shí)驗(yàn)、凝集實(shí)驗(yàn)、間接熒光抗體實(shí)驗(yàn)，面聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)等，其中ELSA方便、快速、成本低、高通量，應(yīng)用廣泛，其診斷弓形蟲感染受包被抗原的不同，診斷的效率不同。最早出現(xiàn)的弓形蟲ELISA診斷所使用的抗原為弓形蟲速增殖子提取的天然蛋白，特異性并不理想，與其他許多疾病都存在交叉反應(yīng)。目前同于弓形蟲ELISA抗體診斷的抗原包被較多，包括速殖子粗提蛋白、速殖子表面抗原（SAG）、棒狀體單板（ROP）系列、致密顆粒蛋白（GRA）系列等，在不同動(dòng)物弓形蟲檢測(cè)的效果不盡相同，如SAG1在人類以及犬類感染的診斷中靈敏度較好。近年來對(duì)弓形蟲抗原的研究不斷深入，為診斷抗原的篩查創(chuàng)造了條件。

2 抗原篩選的思路

（1）需要獲得分離保存的弓形蟲，送實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行鑒定。進(jìn)行培養(yǎng)，采用小鼠腹腔注射培養(yǎng)方法，向小鼠注射5×106數(shù)量級(jí)的弓形蟲。飼養(yǎng)3日后斷頸處死，采用生理鹽水沖洗，收集含有弓形蟲速殖子的腹水。收集得到的小鼠腹水，除弓形蟲速殖外，還有大量的淋巴細(xì)胞，數(shù)量級(jí)會(huì)成本數(shù)量級(jí)上升。（2）需要去除收集腹水中的淋巴細(xì)胞，將腹腔沖洗液覆蓋在等體積的淋巴細(xì)胞分離液上進(jìn)行離心，速度2000r/min，持續(xù)20min，此時(shí)速殖子迅速沉淀，放棄所有的液體，采用生理鹽水洗滌管底。顯微鏡下計(jì)數(shù)，速殖子需要占95%以上，純化良好，-20℃冰箱下冬春。（3）需要建立雞弓形蟲感染的模型，具體方法是采用高錳酸鉀熏蒸殺毒雞舍，購買1日齡雛雞，分籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)蟲第2周齡開始，每只雞107的劑量的純化弓形蟲純化液與5%生理鹽水配置成的輸液10ml。（4）在第0～139日分別采集內(nèi)臟血以及翅靜脈血收集感染組以及對(duì)對(duì)照組的雞血，36術(shù)°留置，離心，分裝取血樣。（5）提取速殖子全蟲蛋白，將純化后的速殖子生理鹽水懸液進(jìn)行血小板計(jì)數(shù)計(jì)算，離心，加入等量的水2×SDS-PAGE上樣緩沖液，95%℃加熱5min裂解速殖子，釋放全蟲單板。通過該注射器抽吸剪切力破碎剩余的速殖子以及蛋白提取液中的基因組DNA。95℃加熱10min，溶解全蟲蛋白并使單板與SDS結(jié)合變性。4℃下離心12000r/min，持續(xù)10min，按照說明書監(jiān)測(cè)單板含量，封裝凍存。獲得全蟲蛋白后，進(jìn)行蛋白電泳，凝膠瓊脂蛋白電泳，電泳完成后，凝膠染色，直至背景清晰，拍照留存，分析全蟲蛋白的分布。（6）最后進(jìn)行全蟲蛋白的Western blot轉(zhuǎn)錄，采用離子水終止顯色，拍照記錄圖片。

整個(gè)實(shí)驗(yàn)通過擴(kuò)增、增殖采集血清樣本，獲得弓形蟲的全蟲蛋白，以此作為抗原進(jìn)行Western blot，能夠發(fā)現(xiàn)抗原，即敏感的蛋白條帶，能夠與感染弓形蟲雞的血清結(jié)合，從而診斷雞的感染。在獲得目標(biāo)蛋白后，可進(jìn)行蛋白切膠的回收、電泳分離鑒定，然后進(jìn)行擴(kuò)增合成，作為ELISA檢驗(yàn)的包被抗原。然后采用正交試驗(yàn)，確認(rèn)基于該抗原的ELSEA方法，明確ELSEA最佳工作條件，評(píng)價(jià)診斷的敏感度。

篩選ELISA檢驗(yàn)雞弓形蟲監(jiān)測(cè)的包被抗原并不困難，但實(shí)驗(yàn)的步驟較多，同時(shí)弓形蟲的種類、感染情況、血樣中的滴度也可能會(huì)影響抗原的篩查，需要確保足夠的實(shí)驗(yàn)樣本，選擇有代表性的病株。

3 小結(jié)

雞弓形蟲診斷抗原篩查的工作量較大，理論上獲得目標(biāo)敏感單板作為包被進(jìn)行ELISA的診斷，能夠明顯提高雞弓形蟲感染的診斷效率，減少費(fèi)用。建立一套ELISA的診斷體系是一個(gè)系統(tǒng)性的工程，各個(gè)階段都需要加強(qiáng)質(zhì)控。

[1]劉守業(yè)，朱瑾瑩.遼寧省大石橋地區(qū)蛋雞弓形蟲流行病學(xué)調(diào)查[J].現(xiàn)代畜牧獸醫(yī)，2017，（8）：40-42.