劉曉慶,陳華濤,張紅梅,張智民,陳 新

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蔬菜研究所/江蘇省高效園藝作物遺傳改良實驗室,江蘇 南京 210014)

不同品種大豆幼苗對鎘脅迫的響應(yīng)

劉曉慶,陳華濤,張紅梅,張智民,陳 新*

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蔬菜研究所/江蘇省高效園藝作物遺傳改良實驗室,江蘇 南京 210014)

通過水培實驗,研究了6個大豆品種幼苗對50 μmol/L鎘(Cd)脅迫的響應(yīng)。結(jié)果表明:不同大豆品種對Cd的耐受性、吸收及積累能力存在顯著差異。鎘對大豆地上部干重的抑制率為4.07%～20.65%,對根系的抑制率為-7.24%～33.72%。經(jīng)鎘處理6 d后,大豆地上部鎘含量為88.03～136.88 mg/kg,根系鎘含量為486.07～602.41 mg/kg。鎘脅迫明顯增加了6個大豆品種葉片中丙二醛(MDA)的含量和超氧化物歧化酶(SOD)的活性。

鎘;大豆;幼苗；耐性;積累

鎘是植物非必需營養(yǎng)元素,但當(dāng)環(huán)境中的鎘超過一定濃度時,作物生長即受到影響,表現(xiàn)為生長遲緩、植株矮小及葉片黃化等受毒害癥狀[1-2]。鎘在植物體內(nèi)大量積累,會通過食物鏈危及人類的健康[3-5]。近年來,耕地土壤的鎘污染已經(jīng)嚴(yán)重抑制了作物的產(chǎn)量并對食品安全構(gòu)成了威脅[6-8]。

大豆不僅含有豐富的蛋白質(zhì)和油脂,而且所含的異黃酮具有極高的醫(yī)用和保健價值[9-10],因此是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上具有較高經(jīng)濟價值的作物。近年來,菜用大豆的種植面積持續(xù)增加,已成為我國不同季節(jié)的主要蔬菜品種。不同作物對重金屬的耐受能力不同[11],大豆是較易在籽粒中積累鎘的作物[12]。

我們通過水培的方法,以6個大豆品種為材料,對其耐鎘性及鎘積累差異進行了研究,并探討了鎘脅迫后6個品種大豆葉片中的MDA含量及SOD活性的變化；此外，筆者還初步篩選出選育抗鎘大豆品種的參考指標(biāo)和大豆鎘污染脅迫的診斷指標(biāo),旨在為大豆鎘污染的早期預(yù)警提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試大豆(Glycinemax)由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所提供,共有6個品種:寧豆4號、蘇菜201、蘇夏N5006、蘇鑒13、蘇14-1和蘇奎1號。

1.2 材料處理

選取大小一致、飽滿的大豆種子,播于濕潤的蛭石中,在光照培養(yǎng)箱內(nèi)(溫度25 ℃,空氣相對濕度60%～70%)催芽。當(dāng)幼苗長至兩葉一心時,選取生長一致的幼苗移至Hoagland營養(yǎng)液中培養(yǎng)；培養(yǎng)7 d后,再換成用Hoagland營養(yǎng)液配制的鎘處理液進行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件:由日光燈提供光照,光照強度為350 μmol/(m2·s),每日光照時間12 h；晝、夜氣溫分別為25 ℃和20 ℃；空氣相對濕度為60%～70%。本試驗Cd處理濃度為50 μmol/L,Cd源為CdSO4·8/3H2O。每個處理重復(fù)3次,每2 d更換1次營養(yǎng)液,共處理6 d。

1.3 植株生物量及鎘含量的測定

將植株從培養(yǎng)箱中取出,用自來水沖洗干凈,用剪刀將根系和地上部分分開,用去離子水進一步清洗。用吸水紙吸干其表面水分,經(jīng)105 ℃殺青30 min,80 ℃烘干至恒重后稱重。生長抑制率的計算公式為：生長抑制率(%)=(對照干物重-Cd處理干物重)/對照干物重×100%。

用硝酸和高氯酸的混合液(體積比87∶13)分解烘干樣品,用原子吸收分光光度計測定植株鎘含量。

1.4 丙二醛(MDA)含量的測定

參照Heath R L等[13]的方法測定MDA含量。取1 g植物樣,加入預(yù)冷的5 mL 5%三氯乙酸(TCA)，進行冰浴研磨,然后在4 ℃下冷凍離心(4000×g,10 min),上清液為樣品提取液。取上清液2 mL,加入2 mL 0.65%硫代巴比妥酸(TBA),混勻后于沸水浴上反應(yīng)15 min,然后迅速冷卻后再離心1次；取上清液用紫外分光光度計直接測定450、532、600 nm處的吸光值。按公式：C(μmol/g)=6.45(A532-A600)-0.56A450計算MDA含量。

1.5 超氧化物歧化酶(SOD)活性的測定

參照Giarmopolitis C N等[14]的方法測定SOD活性，以氮藍四唑(NBT)光化還原反應(yīng)50%抑制率所需的酶量作為1個酶活力單位(U)。3 mL反應(yīng)體系中含50 mmol/L PBS(K3PO4, pH 7.8)、13 mmol/L甲硫氨酸(MET)、75 mmol/L NBT、2 μmol/L核黃素、0.1 mmol/L EDTA、酶液。此反應(yīng)混合液在光照15 min(光照強度為5000 lx)后測定560 nm處的吸光值。

1.6 統(tǒng)計分析

對所得數(shù)據(jù)應(yīng)用EXCEL和SPSS 12.0軟件進行相關(guān)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鎘處理對不同品種大豆幼苗生長的影響

從表1中可知:Cd處理明顯降低了大豆地上部的生物量,且在不同品種間地上部生物量存在明顯差異,地上部干重的抑制率變幅為4.07%～20.65%,其中以蘇菜201的地上部生物量受抑制程度最重(抑制率20.65%),寧豆4號的地上部生物量受抑制程度最輕(4.07%)。經(jīng)50 μmol/L Cd處理6 d后,寧豆4號、蘇菜201、蘇夏N5006及蘇鑒13的根系生長量稍有增加,表現(xiàn)出對Cd有較強的耐受性；而蘇14-1和蘇奎1號的根系生長受到了不同程度的抑制,抑制率分別為4.15%和33.72%。

表1 Cd處理對不同品種大豆幼苗生長的影響

注:同列數(shù)據(jù)后附不同小寫字母表示不同品種或不同鎘處理間在0.05水平上差異顯著。下同。

2.2 不同品種大豆對鎘吸收和積累的差異

從表2可以看出,不同大豆品種對Cd的吸收和積累存在明顯差異。6個大豆品種經(jīng)50 μmol/L Cd處理后，地上部Cd含量以蘇鑒13最低(88.03 mg/kg)，以蘇夏N5006最高(136.88 mg/kg)；根系Cd含量以蘇鑒13最低(486.07 mg/kg)，以蘇夏N5006最高(602.41 mg/kg)。在所有供試品種中,根系Cd含量均高于地上部Cd含量,說明大豆吸收的Cd主要積累在根系。

2.3 鎘脅迫對不同品種大豆葉片中MDA含量的影響

丙二醛(MDA)是膜脂過氧化的主要產(chǎn)物之一,其積累量可以反映膜脂過氧化作用的程度。從圖1中可以看出,鎘脅迫增加了大豆葉片中MDA的含量,且不同品種間存在明顯差異。具體而言，經(jīng)Cd處理后，蘇菜201、蘇夏N5006、蘇鑒13及蘇14-1葉片中MDA含量的增加幅度較高,分別為27.07%、33.03%、28.30%和28.55%；寧豆4號和蘇奎1號葉片中MDA含量的增加幅度較小，分別為11.10%和5.23%。

表2 Cd處理對不同大豆品種Cd含量的影響

不同小寫字母表示不同品種或不同鎘處理間在0.05水平上差異顯著。下同。

2.4 鎘脅迫對大豆葉片SOD活性的影響

鎘脅迫可以誘發(fā)活性氧的積累,而活性氧的有效清除是植物適應(yīng)逆境脅迫的重要機制之一。SOD可以將毒性較強的O2.-轉(zhuǎn)化為毒性較弱的H2O2和基態(tài)氧,避免生成毒性更強的羥自由基,從而緩解活性氧對植物的傷害。 由圖2可見,鎘脅迫增強了大豆葉片中SOD的活性,且不同品種間差異顯著。蘇菜201、蘇夏N5006、蘇鑒13和蘇14-1葉片中SOD活性在鎘脅迫后增幅較大,分別為57.91%、51.57%、38.95%和55.37%；而寧豆4號和蘇奎1號葉片中SOD活性在鎘脅迫后增幅較小,分別為29.95%和34.43%。

圖2 鎘處理對大豆幼苗葉片中SOD活性的影響

3 討論

不同植物對重金屬的耐性機制存在明顯差異[15-16]。楊居榮等[17]將地上部干重的減少量作為判斷植物耐性的重要指標(biāo)。本研究結(jié)果表明,不同大豆品種對鎘的耐受性存在明顯的差異。寧豆4號對鎘表現(xiàn)出較強的耐受性,經(jīng)50 μmol/L Cd處理后其地上部的生物量受抑制程度最低，抑制率僅為4.07%,且Cd處理對其根系的生長有少許的促進作用。相同品種的根系和地上部對Cd的耐受程度也不一致,如50 μmol/L Cd處理雖然能促進蘇菜201根系的生長,但對其地上部有明顯的抑制作用,抑制率高達20.65%。蘇奎1號的根系對Cd較為敏感,根系生長受抑制程度最大，抑制率為33.72%,但其地上部生物量的受抑制率僅為5.76%,可能是因為地上部和根系對Cd的耐受機制不同。

在對鎘的吸收和積累方面,6個供試大豆品種存在顯著差異。一般地說,植物對重金屬離子的抗性機理包括排斥機制和積累機制[15,18]。排斥機制是指植物具有限制根系吸收有毒離子并向地上部運輸?shù)臋C制；在積累機制中,植物可通過細胞質(zhì)中的有機化合物與重金屬離子螯合以降低細胞質(zhì)中重金屬的自由離子活度,也可將有毒離子分布在特定的器官、組織或細胞內(nèi)[16,18-19]。本研究發(fā)現(xiàn),6個大豆品種經(jīng)鎘處理后,鎘主要積累在根系,地上部鎘含量較低,根系平均Cd含量是地上部Cd含量的4.72倍,說明供試大豆植株通過限制鎘向地上部的運輸來緩解鎘毒。6個供試大豆品種對鎘毒的敏感性與其根系鎘向地上部的運輸能力并不完全一致,其中耐性品種(寧豆4號)的根系鎘含量與地上部鎘含量比值與敏感品種(蘇菜201)的比值相近,稍低于蘇鑒13的。這些結(jié)果表明植物對鎘的耐受性不僅與鎘向地上部的轉(zhuǎn)運能力有關(guān),還與鎘在植物地上部的積累機制有關(guān)[15]。

鎘脅迫會破壞植物體內(nèi)活性氧產(chǎn)生與清除間的平衡,損傷細胞膜系統(tǒng)。MDA是衡量細胞膜損傷程度的重要指標(biāo)[20-21]。本研究發(fā)現(xiàn),鎘脅迫導(dǎo)致大豆葉片中MDA含量顯著增加,不同品種間存在明顯差異。地上部生長受鎘抑制較明顯的品種(如蘇菜201、蘇夏N5006、蘇鑒13、蘇14-1),其葉片中MDA含量的增加幅度較高；而地上部生長受鎘抑制程度較低的品種(如寧豆4號、蘇奎1號),其葉片中MDA含量的增幅也較低。

在活性氧產(chǎn)生后,植物體內(nèi)會啟動一系列的清除系統(tǒng)以減輕或消除活性氧累積對植物的傷害[22]。SOD是保護植物細胞免受自由基傷害的第一道防線。本研究結(jié)果顯示,鎘脅迫提高了6個參試大豆品種葉片中的SOD活性,且不同品種間差異顯著。經(jīng)鎘脅迫后葉片中MDA含量上升幅度較大的品種,其葉片中的SOD活性上升也較高。SOD活性的上升說明了活性氧的形成[23],活性氧形成造成MDA含量的上升,從而需要提高SOD活性來減輕活性氧對植物的傷害。

[1] Jackson A P, Antonoviics I, Bradshow A D, et al. Heavy metal tolerance in plants [J]. Adv Ecol Res, 1971(7): 1-10.

[2] 陳懷滿,鄭春榮,周東美.土壤中化學(xué)物質(zhì)的行為與環(huán)境質(zhì)量[M].北京:科學(xué)出版社,2002:95-102.

[3] Hart J J, Welch R M, Norvell W A, et al. Characterization of cadmium binding, uptake, and translocation in intact seedlings of bread and durum wheat cultivars [J]. Plant Physiology, 1998, 116(4): 1413-1420.

[4] Chen Y X, Lin Q, Luo Y M, et al. The role of citric acid on the phytoremediation of heavy metal contaminated soil [J]. Chemosphere, 2003, 50(6): 807-811.

[5] Villiers F, Ducrutx C, Hugouvieux V, et al. Investigating the plant response to cadmium exposure by proteomic and metabolomic approaches [J]. Proteomics, 2011, 11(9): 1650-1663.

[6] Ditoppi L S, Gabbrielli R. Response to cadmium in higher plants [J]. Environmental and Experimental Botany, 1999, 41(2): 105-130.

[7] Herbette S, Taconnat L, Hugouvieux V, et al. Genome-wide transcriptome profiling of the early cadmium response ofArabidopsisroots and shoots [J]. Biochimie, 2006, 88(11): 1751-1765.

[8] Rodriguez L, Ruiz E, Akibsi-azcarate J, et al. Heavy metal distribution and chemical speciation in tailings and soils around a Pb-Zn mine in Spain [J]. Journal of Environmental Management, 2009, 90(2): 1106-1116.

[9] Davis S R, Dalais F S, Simpson E R, et al. Phytoestrogens in health and disease [J]. Recent Progress in Hormone Research, 1999, 54: 185-210.

[10] Watanabe S, Yagamuchi M, Sobne T, et al. Pharmacokinetics of soybean isoflavones in plasma, urine and feces of men after ingestion of 60 g baked soybean powder (kinako) [J]. Journal of Nutrition, 1998, 128(10): 1710-1715.

[11] Belimov A A, Safronova V I, Tsyganov V E, et al. Genetic variability in tolerance to cadmium and accumulation of heavy metals in pea (PisumsativumL.) [J]. Euphytica, 2003, 131: 25-35.

[12] Shute T, Macfie S M. Cadmium and zinc accumulation in soybean: a threat to food safety? [J]. Science of the Total Environment, 2006, 371: 63-73.

[13] Heath R L, Packer L. Photoperoxidation in isolated chloroplasts I. Kinetics and stoichiometry of fatty acid peroxidation [J]. Archives Biochemistry and Biophysics, 1968, 125: 189-198.

[14] Giarmopolitis C N, Ries S K. Superoxide dismutase: occurrence in higher plants [J]. Plant Physiology, 1977, 59: 309-314.

[15] Baker A J M. Accumulators and excluder-strategies in the response of plants to heavy metals [J]. Journal of Plant Nutrition, 1981(3): 643-654.

[16] Hall J L. Cellular mechanisms for heavy metal detoxification and tolerance [J]. Journal of Experimental Botany, 2002, 53: 1-11.

[17] 楊居榮,賀建群,黃翌.農(nóng)作物鎘耐性的種內(nèi)和種間差異Ⅱ[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報,1995(S1):132-136.

[18] Tong Y P, Kneer R, Zhu Y G. Vacuolar compartmentalization: a second-generation approach to engineering plants for phytoremediation [J]. Trends in Plant Science, 2004(9): 7-9.

[19] Clemens S. Molecular mechanisms of plant metal tolerance and homeostasis [J]. Planta, 2001, 212: 475-486.

[20] Sandalio L M, Dalurzo H C, Gomez M, et al. Cadmium-induced changes in the growth and oxidative metabolism of pea plants [J]. Journal of Experimental Botany, 2001, 52: 2115-2126.

[21] Zhu R, Macfie S M, Ding Z. Cadmium induced plant stress investigated by scanning electrochemical microscopy [J]. Journal of Experimental Botany, 2005, 56(421): 2831-2838.

[22] Ali M B, Chun H S, Kim B K, et al. Cadmium-induced changes in antioxidant enzyme activities in rice [J]. Journal of Plant Biology, 2002, 45(3): 134-140.

[23] Pflugmacher S. Promotion of oxidative stress in the aquatic macrophyteCeratophyllumdemersumduring biotransformation of the cyanobacterial toxin microcystin-LR [J]. Aquatic Toxicology, 2004, 70: 169-178.

(責(zé)任編輯:黃榮華)

Response of Seedlings of Different Soybean Varieties to Cadmium Stress

LIU Xiao-qing, CHEN Hua-tao, ZHANG Hong-mei, ZHANG Zhi-min, CHEN Xin*

(Institute of Vegetable Crops, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences /Jiangsu Provincial Key Laboratory for Horticultural Crop Genetic Improvement, Nanjing 210014, China)

A water culture experiment was conducted to investigate the response of seedlings of six soybean varieties to 50 μmol/L cadmium (Cd) stress. The results showed that there were significant differences in Cd tolerance, absorption and accumulation among different soybean varieties. For 6 soybean varieties under Cd stress, the inhibition percentage of their shoot dry weight varied from 4.07% to 20.65%, and the inhibition percentage of root dry weight varied from -7.24% to 33.72%. After 6 day’s Cd treatment, the Cd content in soybean shoots and roots was 88.03～136.88 mg/kg and 486.07～602.41 mg/kg, respectively. Cd stress obviously enhanced the MDA content and SOD activity in leaves of 6 soybean varieties.

Cadmium; Soybean; Seedling; Tolerance; Accumulation

2016-10-10

江蘇省自然科學(xué)基金項目(BK20130727);江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金項目[CX(15)1040]。

劉曉慶(1982─),女,江蘇如皋人,副研究員,博士,主要從事植物抗逆機制研究。

S565.1

A

1001-8581(2017)03-0014-04

*通訊作者:陳新。