王娟娟++劉玲玲++金婷++楊靜++盛海君

摘要：結(jié)合理化分析、礦物分析與微生物方法，研究水肥一體化設(shè)施管道淤積物樣品鐵還原潛勢(shì)及對(duì)鐵氧化物存在的影響。結(jié)果表明，樣點(diǎn)FS1與樣點(diǎn)FS2的水樣均為弱酸性，接近6，而樣點(diǎn)FS1的含鐵量與鐵還原潛勢(shì)均高于樣點(diǎn)FS2；添加外源有機(jī)碳源對(duì)樣品的三價(jià)鐵還原速率有促進(jìn)作用，其中以乳酸促進(jìn)作用最為明顯，甲酸對(duì)體系的鐵還原速率的促進(jìn)作用則較小。不同樣品對(duì)有機(jī)碳源的反應(yīng)有差異，可能與微生物組成及鐵氧化物成分不同有關(guān)。外加碳源培養(yǎng)后，與鐵還原有關(guān)的微生物明顯富集，以地桿菌屬（Geobacter sp.）、脫硫芽孢彎曲菌屬（Dsulfosporosinus sp.）及脫亞硫酸菌屬（Desulfitobacterium）為代表。由結(jié)果可知，可以通過(guò)調(diào)節(jié)管道的氧化還原狀態(tài)及選擇有機(jī)碳源種類，加速氧化鐵的還原溶解，從而緩解管道淤堵。

關(guān)鍵詞：微生物；鐵還原；設(shè)施管道；淤堵物

中圖分類號(hào)： S182文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2016）12-0509-05

收稿日期：2016-09-13

基金項(xiàng)目：江蘇省自然科學(xué)基金（編號(hào)：BK20160468）。

作者簡(jiǎn)介：王娟娟（1979—），女，江蘇泗洪人，博士，講師，主要從事農(nóng)業(yè)微生物資源利用研究。E-mail：wangjuanjuan@yzu.edu.cn。

通信作者：盛海君，碩士，高級(jí)農(nóng)藝師，主要從事環(huán)境科學(xué)研究。E-mail：hjsheng@yzu.edu.cn。

鐵（Fe）是地球上較豐富的金屬元素，鐵的循環(huán)影響各種地球化學(xué)及生物化學(xué)過(guò)程。微生物通過(guò)參與調(diào)控鐵元素的氧化或還原，為其生長(zhǎng)提供能源，微生物參與的鐵循環(huán)過(guò)程受到越來(lái)越多的關(guān)注[1]。鐵在自然界中主要存在形態(tài)為二價(jià)[Fe（Ⅱ）]與三價(jià)[Fe（Ⅲ）]，前者可以通過(guò)化學(xué)過(guò)程與微生物作用使鐵氧化生成Fe（Ⅲ）氧化物。這類氧化鐵常見于富鐵的土壤、礦山、濕地以及工業(yè)系統(tǒng)如管道等[2-4]。微生物鐵氧化物的形成與去向具有重要的生態(tài)意義[5]。一方面，鐵的氧化與還原過(guò)程存在電子的轉(zhuǎn)移，影響著其他地球化學(xué)循環(huán)；另一方面，鐵氧化物因其比表面積大并帶有電荷，對(duì)環(huán)境中各種重金屬及有機(jī)污染物有較強(qiáng)的吸附固定能力。鐵氧化作用消耗氧氣，從而形成微厭氧環(huán)境，為異化還原微生物生長(zhǎng)提供環(huán)境條件。氧化鐵的存在為鐵還原微生物提供電子受體，用于厭氧呼吸。鐵氧化物的形態(tài)與種類影響異化還原過(guò)程[6]，而異化鐵還原過(guò)程則會(huì)促使鐵形態(tài)發(fā)生改變[7]。

自然界中三價(jià)鐵的還原主要通過(guò)異化還原過(guò)程進(jìn)行，常見于淹水土壤、底泥及其他地下環(huán)境等[8]。異化鐵還原是指微生物利用細(xì)胞外三價(jià)鐵為末端電子的受體，通過(guò)氧化作為電子供體的有機(jī)物將Fe（Ⅲ）還原為Fe（Ⅱ），獲得能量以維持生長(zhǎng)。微生物異化還原鐵利用多種有機(jī)酸作為電子供體與碳源，因而對(duì)主要元素的地質(zhì)環(huán)境循環(huán)，尤其是碳循環(huán)有著深刻的影響。甚至有研究認(rèn)為，微生物鐵還原是地球上最早將有機(jī)碳轉(zhuǎn)化為二氧化碳的過(guò)程[9-10]。鐵還原過(guò)程還可耦聯(lián)有機(jī)物的氧化降解，包括氯代有機(jī)物、偶氮染料等，并影響到一些重金屬和有毒元素的形態(tài)[11-14]，因而在環(huán)境污染與修復(fù)領(lǐng)域受到越來(lái)越多的關(guān)注。

參與鐵氧化過(guò)程的微生物在形態(tài)與分類學(xué)上各異。已知分離菌種包括嗜熱、嗜酸與嗜堿的細(xì)菌與古菌[10]。其中，研究較為廣泛的代表性菌屬有地桿菌屬（Geobacter）、希瓦氏菌屬（Shewanella）、金屬還原地桿菌（Geobacter metal lireducens） GS-15是首次分離的異化鐵還原細(xì)菌，在Fe（Ⅲ）還原的過(guò)程中同時(shí)分解苯和甲苯等芳香族化合物[15]。此類細(xì)菌常使用小分子脂肪酸如甲酸、乙酸、乳酸及H2等。其主要反應(yīng)式如下：

[JZ（]CHCOO-+2Fe3++H2O→HCO3-+2Fe2++2H+；[JZ）][JY]（1）

[JZ（]CH3COO-+4Fe3++2H2O→2HCO3-+8Fe2++9H+；[JZ）][JY]（2）

CH3—CHOH—COO-+4Fe3++2H2O→CH3COO-+HCO3-+4Fe2++5H+。[JY]（3）

在水肥一體化設(shè)施栽培中，管道淤堵是較為常見的問(wèn)題，而在鐵含量較高的情況下，氧化鐵的形成往往是形成管道淤堵的直接因素[4]。因其產(chǎn)生速度較快[16]，清理和修復(fù)工作較為困難。異化還原細(xì)菌可利用氧化態(tài)鐵作為電子受體，同時(shí)導(dǎo)致鐵氧化物的還原與溶解。因此，研究不同條件下鐵氧化還原，對(duì)于調(diào)控鐵氧化物的去向、清除管道淤堵具有重要意義。本研究比較2個(gè)樣點(diǎn)的排水管道中的不同鐵氧化的微生物還原潛勢(shì)以及參與鐵還原的主要微生物群落，以探明不同樣品中鐵還原的影響因子，為了解水肥一體化設(shè)施管道環(huán)境中鐵氧化物的存在與轉(zhuǎn)移規(guī)律提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1樣品采集

本試驗(yàn)共設(shè)定2個(gè)區(qū)域（FS1、FS2），各2個(gè)樣點(diǎn)（FS1A、FS1B、FS2C、FS2D），采集管道內(nèi)水樣與淤堵物（主要為鐵氧化物）。樣品采集用嚴(yán)格的滅菌設(shè)備與方法。鐵氧化物用不銹鋼藥匙收集，存入無(wú)菌離心管內(nèi)。分2份保存：用于室內(nèi)培養(yǎng)以及鐵氧化物礦物分析的樣品存放于冷卻箱內(nèi)，而用于常規(guī)DNA分離的樣品則立刻用干冰冷凍保存。同時(shí)，采集水樣，1份冷藏保存，用于室內(nèi)培養(yǎng)；1份用0.2 μm聚偏二氟乙烯（PVDF）膜過(guò)濾，分別用50%硝酸或50%鹽酸酸化，用于測(cè)定水樣鐵及其他元素含量。

1.2培養(yǎng)試驗(yàn)

對(duì)于鐵還原潛勢(shì)測(cè)定，樣品處理過(guò)程均為嚴(yán)格無(wú)菌厭氧操作，在厭氧箱內(nèi)進(jìn)行。每個(gè)樣品稱取5 g鐵氧化物，加同地點(diǎn)采樣的水樣（經(jīng)吹氮?dú)馊パ跆幚恚┲馏w積75 mL，于密封血清瓶?jī)?nèi)混勻。分別添加甲酸、乙酸及乳酸，使得最終濃度為10 mmol/L。另設(shè)不加任何碳源的對(duì)照（預(yù)試驗(yàn)結(jié)果表明，加入殺菌劑與否與常規(guī)對(duì)照相比沒(méi)有明顯區(qū)別，因而為操作安全方便，對(duì)照只使用不加碳源不加殺菌劑處理）。對(duì)照與處理各重復(fù)3次，在室溫（25 ℃）下避光培養(yǎng)。隔0～3 d從各處理中取1 mL混合培養(yǎng)液，過(guò)濾后測(cè)定樣品pH值及二價(jià)鐵含量變化，持續(xù)采樣至4周以后。

1.3理化分析與測(cè)定

常規(guī)理化性質(zhì)包括pH值、溫度、含氧量、電導(dǎo)率等，在現(xiàn)場(chǎng)用便攜式電極測(cè)定。

鐵氧化物礦物采用拉曼光譜分析，波長(zhǎng)為532 nm，物鏡為100倍，獲取時(shí)間為300～1 800 s，光譜分辨率為6 cm-1。

金屬離子含量用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀（ICP-OES）及電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）測(cè)定。

鐵元素測(cè)定用鄰菲羅啉顯色、紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)定。硫酸根離子用氯化鋇顯色、紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)定。

1.4分子生物學(xué)測(cè)定

稱取0.3 g樣品用于DNA提取，采用十六烷基三甲基溴化銨-十二烷基硫酸鈉（CTAB-SDS）處理、酚-三氯甲烷-異戊醇提取、異丙醇沉淀方法，具體操作步驟與條件見文獻(xiàn)[17]。提取后的DNA用通用細(xì)菌16S基因片段引物27F/1 492R擴(kuò)增，巢式擴(kuò)增采用通用引物341F（GC）與907R。擴(kuò)增后的產(chǎn)物用于變性梯度聚丙烯酰胺凝膠電泳（DGGE）。電泳條件為100 V，60 ℃，16 h?；厥罩饕獥l帶，繼續(xù)擴(kuò)增，并送至Macrogen Inc測(cè)定基因片段序列。

1.5數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)圖表生成用Excel或SigmaPlot。方差分析用SPSS，其中P<0.1為差異顯著。用統(tǒng)計(jì)分析軟件R（Jaccard相似度）來(lái)分析樣品變性梯度凝膠電泳（DGGE）凝膠圖譜的微生物群落結(jié)構(gòu)差異。

2結(jié)果與分析

2.1幾個(gè)水樣的理化性質(zhì)

表1結(jié)果顯示，幾個(gè)樣品總鐵含量均較高，最高達(dá)32505 mg/L，但2個(gè)樣點(diǎn)之間差異明顯；還原態(tài)鐵與總鐵之間不存在相關(guān)性，以樣品FS1B還原態(tài)鐵比例最低，約占總鐵含量38%，其他幾個(gè)樣品還原態(tài)鐵比例則高達(dá)90%～95%；所有樣品的pH值介于5.15～6.06之間，均為弱酸；溶解氧含量較高，F(xiàn)S1、FS2樣品平均分別為12.00、3.15 mg/L。雖然樣品的含氧量不低，其還原態(tài)鐵含量仍較高，這可能與地下水不斷供給有關(guān)。溶解氧含量測(cè)定結(jié)果與總鐵量成正比，樣點(diǎn)FS1平均值明顯高于樣品FS2。

2.2外源電子供體對(duì)鐵還原的影響

圖1表明，所有樣品在培養(yǎng)前2 d均未有鐵還原過(guò)程發(fā)生。其中，添加乳酸的樣品FS1A自4 d開始有鐵還原發(fā)生，其還原性鐵濃度為116.6 mg/kg，到培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，二價(jià)鐵濃度則達(dá)到507.5 mg/kg。樣品FS1B中的二價(jià)鐵濃度自培養(yǎng)6 d開始以平均每天1.4 mg/kg的速率積累，并在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)濃度達(dá)到與樣品FS1A接近；另1個(gè)采樣點(diǎn)的2個(gè)樣FS2C與FS2D的總鐵還原速率則與樣點(diǎn)1相近，不同的是在培養(yǎng)9～13 d其二價(jià)鐵濃度增加較為緩慢，有1個(gè)短暫的滯后期。

圖1-b為添加外源乙酸后樣品鐵還原動(dòng)態(tài)，可以看出，對(duì)于樣品FS1A、FS1B、FS2C，在培養(yǎng)前2周內(nèi)添加乙酸并不影響鐵還原；樣品FS2D的Fe（Ⅱ）濃度在6～11 d所增加，之后變化較??；在13 d時(shí)，樣品FS1A與FS2C中二價(jià)鐵開始有所增加，其中樣品FS1A還原速率較高，在這段時(shí)間內(nèi)，其增加速率為17.6 mg/（kg·d），最終達(dá)到397.2 mg/kg。從增加趨勢(shì)看，樣品FS2C最高，F(xiàn)S1A與FS1B接近，而樣品FS2D最低。

甲酸的增加（圖1-c）對(duì)樣品體系鐵還原過(guò)程影響較小，其中樣品FS1A、FS1B與對(duì)照（圖1-d）幾乎沒(méi)有差異。樣品FS2C、FS2D只是在培養(yǎng)約10 d后有一些變化，鐵的還原速率稍有增加，但最終二價(jià)鐵濃度分別只達(dá)到179.1、224.9 mg/kg，平均還原速度分別為1.68、4.99 mg/（kg·d）。

2.3培養(yǎng)后體系pH值變化

與原始樣品pH值（表1）相比，添加外源有機(jī)酸后體系初始pH值略有提高，平均增加了0.20（圖2）。在培養(yǎng)1個(gè)月后，各處理體系的pH值有不同程度的提高。以乙酸與乳酸處理較為明顯。其中，添加乳酸后培養(yǎng)1個(gè)月的樣品FS1B pH值提高了1。而乳酸與乙酸的添加均使得樣品FS1A體系pH值有所提高。這與鐵還原過(guò)程釋放H+似乎有些矛盾，然而整體pH值變化并不明顯。

2.4參與鐵還原過(guò)程的微生物豐度與多樣性

對(duì)自然樣品的微生物群落結(jié)果進(jìn)行了DGGE測(cè)定，并對(duì)圖像進(jìn)行聚類分析。由圖3可以看出，樣品的微生物多群落結(jié)果有明顯的地域性，2個(gè)樣點(diǎn)的樣品各自聚為不同類群；相對(duì)于樣點(diǎn)FS2的2個(gè)樣品（C與D），樣點(diǎn)FS1的2個(gè)樣品（A與B）之間相似度稍低，Jaccard相似系數(shù)僅為 0.3，也就是兩者的微生物群落結(jié)構(gòu)有30%的相似度，而樣品FS2C、FS2D則達(dá)到45%。

為進(jìn)一步了解可能參與鐵還原過(guò)程的微生物，對(duì)于添加外源有機(jī)酸培養(yǎng)后體系的主要細(xì)菌進(jìn)行測(cè)序分析。結(jié)果表明，幾種豐度較大的細(xì)菌均為鐵還原細(xì)菌種屬。代表性的細(xì)菌有地桿菌屬（Geobacter sp.）、脫硫芽孢彎曲菌屬（Desulfosporosinus sp.）以及脫亞硫酸菌屬（Desulfitobacterium），這幾類占培養(yǎng)體系中細(xì)菌的大多數(shù)（圖4）。而與原始自然樣品相比，微生物群落有一定變化，鐵還原類細(xì)菌豐度（圖4所示比例）明顯增加。

[TPWJJ3.tif]

3討論與結(jié)論

鐵氧化物不僅影響到其他元素循環(huán)，還可以吸附鈍化環(huán)境中重金屬、有機(jī)污染物等，因而受到越來(lái)越多的關(guān)注。鐵氧化物的還原作用在一定程度上決定著環(huán)境中鐵氧化物的存在。在中性及偏堿性條件下，自然環(huán)境中二價(jià)鐵很容易被化學(xué)氧化[18]。而本試驗(yàn)樣品pH值為5～6，這為微生物鐵氧化提供了有利條件，而其產(chǎn)物及代謝物質(zhì)可能更利于異化還原過(guò)程。雖然樣點(diǎn)2溶解氧含量平均達(dá)3.15 mg/L，但樣品中二[CM（25]價(jià)鐵的含量并不低。這一方面原因可能在于弱酸性pH值[CM）]

[FK（W31][TPWJJ4.tif]

減緩了化學(xué)氧化過(guò)程；另一方面可以歸結(jié)于二價(jià)鐵含量高的水源補(bǔ)給作用。樣品中相對(duì)較高的溶解氧含量也為微生物活動(dòng)尤其是氧化鐵還原過(guò)程提供了充足的碳源。

添加外源有機(jī)碳對(duì)鐵還原影響有所不同?？傮w而言，乙酸與乳酸的加入提高了鐵還原速率，而甲酸對(duì)體系鐵還原速率的影響可以忽略。其原因可能與原樣品的微生物群落結(jié)構(gòu)有關(guān)，偏好甲酸的鐵還原菌在樣品中含量較低[8]，因而對(duì)整個(gè)過(guò)程并無(wú)太大的促進(jìn)作用。所有的處理均存在1個(gè)滯后期，此期間微生物需要適應(yīng)生長(zhǎng)環(huán)境的變化，恢復(fù)到應(yīng)有的活動(dòng)能力。滯后期長(zhǎng)短可能與樣品內(nèi)鐵還原微生物的組成與活性有關(guān)。另外， 原樣品的鐵氧化物礦物結(jié)構(gòu)與組成也可能影響它作為三價(jià)鐵源的釋放速率[19]。相比之下，乙酸添加產(chǎn)生的滯后期較長(zhǎng)，可能與其單分子產(chǎn)生的H+含量較高，短期內(nèi)對(duì)微生物生長(zhǎng)產(chǎn)生一定的抑制作用有關(guān)。

厭氧培養(yǎng)明顯富集鐵還原微生物，加速三價(jià)鐵的溶解。聚丙烯酰胺凝膠圖譜表明，微生物群落結(jié)構(gòu)在添加乙酸與乳酸培養(yǎng)后明顯不同于甲酸處理與原始樣品，鐵還原菌Geobacter sp.、Desulfosporosinus sp.以及Desulfitobacterium占主導(dǎo)地位。同樣，從鐵還原潛勢(shì)看，后面2個(gè)處理沒(méi)有表現(xiàn)出較高的鐵還原速率。而乙酸與乳酸處理之間也各不同，表現(xiàn)出很強(qiáng)的培養(yǎng)基選擇性。此外，樣品之間也差異明顯，同樣是乳酸處理，樣品FS1A與FS1B的還原速率增長(zhǎng)程度明顯高于樣品FS2C和FS2D。

對(duì)用于室內(nèi)培養(yǎng)的鐵氧化物樣品中微生物群落進(jìn)行分析的結(jié)果可視為培養(yǎng)體系的初始微生物組成。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各樣品中具有鐵還原能力的菌屬含量較低，只有樣品FS1B中達(dá)到總測(cè)定序列的28%，樣品FS1A中只檢測(cè)到小于1%的Geobacter。然而，無(wú)論是添加乳酸或乙酸的處理，樣品FS1B的鐵還潛勢(shì)卻低于樣品FS1A，而2個(gè)樣品的基本理化性質(zhì)與鐵氧化礦物組成均比較接近。因此，可能還有影響鐵還原潛勢(shì)的其他重要原因存在。

研究表明，鐵還原細(xì)菌更喜好非結(jié)晶態(tài)鐵氧化物，如水鐵礦[10，20]，但也有一些細(xì)菌可以還原結(jié)晶態(tài)氧化鐵[9]。在本試驗(yàn)中，樣品FS1A與FS1B的還原速率明顯高于FS2B和FS2D，而前二者氧化物主要成分為結(jié)晶度較差的施氏礦物Schwertmannite，后者則含有多種無(wú)定形與結(jié)晶態(tài)鐵氧化物。據(jù)報(bào)道，Schwertmannite較容易被微生物利用進(jìn)行鐵還原[21]，不難解釋樣品鐵還原潛勢(shì)的差異。因此，調(diào)控環(huán)境中鐵氧化的存在要綜合考慮有機(jī)碳源與鐵氧化物底物因素。

pH值是影響異化鐵還原的重要因素，不但影響體系中Fe（Ⅲ）溶解度及各氧化還原體系間的化學(xué)反應(yīng)，而且還會(huì)影響微生物生長(zhǎng)和形態(tài)及其代謝過(guò)程中的酶活性。吳超等研究發(fā)現(xiàn)，初始體系pH值與鐵還原過(guò)程呈顯著正相關(guān)，與水稻土微生物群落的鐵還原能力均有顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，但在pH值為6.0時(shí)效果最佳[22]。這與本試驗(yàn)條件弱酸性有很好的統(tǒng)一性。

綜上所述，抽測(cè)樣點(diǎn)排水管道中鐵氧化物主要由施氏礦物組成，其微生物群落結(jié)構(gòu)以樣點(diǎn)間相似度更大。添加小分子有機(jī)酸對(duì)鐵還原潛勢(shì)有一定促進(jìn)作用，不同有機(jī)酸表現(xiàn)的作用有差異，其中以乳酸的促進(jìn)作用最大，甲酸最??；厭氧培養(yǎng)改變了樣品微生物群落結(jié)構(gòu)，鐵還原細(xì)菌得到了富集；培養(yǎng)前后體系的硫酸根則無(wú)明顯變化。

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