李曉梅++郭體環(huán)++張來軍++李由明

摘要：為探討在未來海洋酸化背景下重金屬對貝類免疫的影響，在實(shí)驗(yàn)室條件下設(shè)置0.05、0.50、5.00 mg/L 3種硝酸鉛質(zhì)量濃度，以0 mg/L作為對照，比較正常海水（pH值8.0）與酸化海水（pH值7.6）條件下鉛脅迫對近江牡蠣鰓組織溶菌酶含量的影響。結(jié)果表明，低pH值高鉛質(zhì)量濃度組[pH值7.6，Pb（NO3）2質(zhì)量濃度5.00 mg/L]的鰓組織溶菌酶含量隨時(shí)間的延長直線下降，其余各試驗(yàn)組的鰓組織溶菌酶含量總體呈先下降、后上升、再下降的變化趨勢。至30 d時(shí)，對照組[pH值8.0，Pb（NO3）2質(zhì)量濃度0.00 mg/L]的溶菌酶含量顯著高于其他組（P<0.05），而低pH值高鉛質(zhì)量濃度組顯著低于其他組（P<0.05），酸化組的近江牡蠣鰓組織溶菌酶含量均低于正常海水組，差異顯著（P<0.05）。在2種pH值條件下，近江牡蠣鰓組織溶菌酶含量均隨硝酸鉛質(zhì)量濃度的增加而降低。研究表明，近江牡蠣長時(shí)間暴露于低pH值、鉛脅迫或低pH值與鉛脅迫共存的環(huán)境下，均導(dǎo)致其鰓組織溶菌酶含量降低、免疫力下降；海洋酸化和鉛對近江牡蠣具有聯(lián)合毒性效應(yīng)。

關(guān)鍵詞：海洋酸化；鉛；鰓；溶菌酶；近江牡蠣

中圖分類號： X55文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）12-0297-03

收稿日期：2015-10-28

基金項(xiàng)目：[JP2]國家自然科學(xué)基金（編號：31260139）；海南省自然科學(xué)基金（編號：314086）；海南省教育廳高?？蒲许?xiàng)目（編號：Hjkj2013-39）。

作者簡介：李曉梅（1975—），女，碩士，副教授，主要從事海洋生物學(xué)研究。E-mail：xiaomeili1215@sina.com。

溶菌酶（lysozyme）別稱N-乙酰胞壁質(zhì)聚糖水解酶，是一種小分子量的堿性蛋白水解酶，參與機(jī)體內(nèi)多種免疫反應(yīng)，在機(jī)體正常防御和非特異免疫中具有重要作用，是生物體內(nèi)重要的非特異性免疫因子，常作為評價(jià)機(jī)體免疫水平的重要指標(biāo)之一[1-2]。

重金屬是一類典型的環(huán)境污染物。環(huán)境中重金屬污染的來源主要是化工、采礦、金屬冶煉及加工、電鍍、輪船制造等行業(yè)，以及農(nóng)用殺蟲劑、生活污水、垃圾滲出液等。對于生物體而言，重金屬包括必需金屬和非必需金屬。鉛（lead，Pb）屬于非必需金屬，不參與有機(jī)體的代謝活動，組織內(nèi)含有較低濃度時(shí)便對有機(jī)體產(chǎn)生顯著的毒性[3-4]。

近年來，隨著我國工業(yè)的發(fā)展，工業(yè)廢棄物的排放隨之增加，重金屬污染越來越嚴(yán)重，嚴(yán)重危害著包括人類在內(nèi)的各種生命體的健康與生存。在所有已知重金屬毒性物質(zhì)中，由鉛引起的污染和危害事件數(shù)量較多，從而備受關(guān)注。生物體即使攝入極少量的鉛，也會造成極大損害。

海洋酸化已被廣泛確認(rèn)為CO2濃度上升導(dǎo)致的又一重大環(huán)境問題[5]。化石燃料的使用等人類活動導(dǎo)致大氣中CO2濃度不斷升高，可能已經(jīng)導(dǎo)致了全球變暖和氣候異常等[6]，海洋不斷從大氣中吸收CO2，對緩解全球變暖起著重要作用[7]。然而，自工業(yè)革命以來，海洋大量吸收人類排放的CO2，已導(dǎo)致上層海水的pH值下降了0.1[8]。根據(jù)IPCC預(yù)測模型（A1F1）的推測，至2100年大氣CO2濃度將升高至800～1 000 μL/L，表層海水pH值將下降0.3～0.4，這種酸化速度在過去3億年間的任何時(shí)期均未曾有過[9]。海洋酸化引起的海洋化學(xué)變化（碳酸鹽系統(tǒng)及物質(zhì)形態(tài)）正在改變海洋生物賴以生存的化學(xué)環(huán)境，海洋生物的代謝過程會受到影響，海洋生態(tài)的穩(wěn)定性會發(fā)生變化[10]。海洋酸化引起的海水pH值降低會改變海洋生物的多項(xiàng)生理功能，使海洋生物抵抗不良環(huán)境脅迫與疾病等的能力降低，致使脅迫或疾病對海洋生物造成更嚴(yán)重的損傷，甚至在較低脅迫強(qiáng)度下造成生物個體死亡。另外，海洋酸化還可導(dǎo)致己經(jīng)穩(wěn)定在沉積物中的重金屬二次釋放。在pH值呈堿性和中性的條件下，重金屬溶解很少，但在pH值為6的處理?xiàng)l件下，6～18 d期間鎘的釋放量為4～13 μg/L，19～21 d期間達(dá)到40～50 μg/L；19～21 d 期間鉛的釋放量達(dá)到100～370 μg/L；鋅的釋放量最高可達(dá)160 μg/L[11]。

近江牡蠣（Crassostrea rivularis Gould）是我國主要的牡蠣養(yǎng)殖品種之一，隸屬于軟體動物門（Mollusca）瓣鰓綱（Lamellibranchia）珍珠貝目（Pterioida）牡蠣科（Ostridae），屬于半咸水種類，主要分布于我國華南沿海眾多的河口地帶。由于近江牡蠣生活在河口區(qū)域，不斷有淡水經(jīng)此流入海洋，再加上潮汐、海浪等的影響，近江牡蠣的生活環(huán)境經(jīng)常發(fā)生劇烈變化；而且，近江牡蠣固定在巖石或其他物體上生活，不像其他海洋生物可以移動和趨利避害，從而使近江牡蠣自身形成了一系列應(yīng)對環(huán)境脅迫的適應(yīng)機(jī)制，因此近江牡蠣是用于研究環(huán)境脅迫響應(yīng)的良好材料。

目前，有關(guān)海洋酸化和鉛對貝類生物學(xué)影響的研究多為單一因素的影響，包括海洋酸化對貝類受精、發(fā)育、免疫、攝食、繁殖的影響[12-14]，以及鉛對貝類免疫的影響[15]等，很少有研究關(guān)于鉛和海洋酸化共存的復(fù)合脅迫對貝類的影響。本試驗(yàn)通過研究海水酸化和鉛雙重脅迫對近江牡蠣溶菌酶活性的影響，為近江牡蠣的健康養(yǎng)殖、棲息地環(huán)境檢測、防治污染、海洋環(huán)境保護(hù)等提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

供試近江牡蠣于2015年3月購自海南省昌江縣昌化鎮(zhèn)，采捕后立即送至試驗(yàn)場地，洗刷干凈后置于4.0 m×4.0 m×1.5 m的室內(nèi)水泥池暫養(yǎng)7 d。經(jīng)測定，近江牡蠣采集地和試驗(yàn)地海水中的鉛含量均小于0.01 mg/L，無顯著性差異（P>0.05）。暫養(yǎng)期間采用靜態(tài)換水法，每天換水1次。養(yǎng)殖用水為過濾海水，主要水環(huán)境因子按采樣地調(diào)控，水溫（27±1）℃、pH值8.0、鹽度3%，以金藻和青島大扁藻作為餌料，24 h 連續(xù)充氧。暫養(yǎng)結(jié)束后，死亡率<1%，符合試驗(yàn)要求，挑選大小均勻的近江牡蠣個體作為受試動物，其質(zhì)量為（1036±1.83） g/只。

本試驗(yàn)所用硝酸鉛為分析純，購自恒興化工。使用硝酸鉛作為污染物，將其配制成10 mg/mL的母液，按需要稀釋至相應(yīng)質(zhì)量濃度來進(jìn)行鉛脅迫試驗(yàn)。

1.2海水處理

試驗(yàn)前，采用醋酸調(diào)配pH值為7.6的酸化海水。為防止酸化海水在使用過程中pH值升高，經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)，最終采用輸液管勻速緩慢地向試驗(yàn)容器中滴加醋酸以穩(wěn)定水體pH值。以pH值為8.0的正常海水作為對照。

1.3試驗(yàn)分組

中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)（UCD 551463）海水水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)（GB 3097—1997）四類海水、農(nóng)業(yè)部無公害食品海水養(yǎng)殖用水水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)（NY 5052—2001）中均規(guī)定鉛含量≤0.05 mg/L，本試驗(yàn)以此為依據(jù)，按等比數(shù)列分別設(shè)立0.05、0.50、5.00 mg/L 3個硝酸鉛質(zhì)量濃度組，以0 mg/L作為對照組，每組均設(shè)置3個平行。各試驗(yàn)組海水的pH值及硝酸鉛質(zhì)量濃度見表1。試驗(yàn)在150 L的塑料桶中進(jìn)行，每桶加入100 L試驗(yàn)溶液，每組放入50只經(jīng)暫養(yǎng)的近江牡蠣。試驗(yàn)期間每24 h更換1次試驗(yàn)溶液，以金藻和青島大扁藻作為餌料，將條件控制在水溫（27±1）℃、鹽度3%，24 h連續(xù)充氧。

1.4樣品制備

試驗(yàn)開始的當(dāng)天記為0 d，分別于試驗(yàn)開始后5、10、15、20、25、30 d從各桶隨機(jī)取3只近江牡蠣，每組9只。取鰓組織并稱質(zhì)量，按1 g ∶[KG-*3]9 mL比例添加預(yù)冷的生理鹽水，冰上勻漿，于4 ℃、5 000 r/min下離心10 min，取上清液，置于 -80 ℃ 超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5溶菌酶活性的測定

采用A050型溶菌酶檢測試劑盒（南京建成生物工程研究[CM（25]所研制）測定溶菌酶活性，按照試劑盒使用說明書進(jìn)行操作，每個待測樣品測試3次。

1.6數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。采用Excel、SPSS等軟件進(jìn)行單因素方差分析并制作圖表。

2結(jié)果與分析

由圖1、表2可知，在pH值相同的情況下，5、15、25、30 d時(shí)近江牡蠣的鰓組織溶菌酶含量均隨硝酸鉛質(zhì)量濃度的增加而降低；10 d時(shí)溶菌酶含量隨硝酸鉛質(zhì)量濃度的增加而先降后升。20 d時(shí)不同pH值條件下，溶菌酶含量隨硝酸鉛質(zhì)量濃度的變化趨勢出現(xiàn)較大差異，pH值為8.0時(shí)，各組溶菌酶含量無顯著差異（P>0.05）；pH值為7.6時(shí)，溶菌酶含量隨硝酸鉛質(zhì)量濃度增加先升后降，相鄰各組間差異顯著（P<005），0.00 mg/L與0.50 mg/L間差異不顯著（P>0.05）。

各處理間差異隨時(shí)間的延長而增大，5 d時(shí)僅組2、組4與組5間存在顯著性差異（P<0.05），其余各組均無顯著差異（P>0.05）；隨著時(shí)間的延長，存在顯著差異的組越來越多，30 d時(shí)差異達(dá)到最大。

由圖1可知，對照組（組1）鰓組織溶菌酶含量在整個試驗(yàn)過程中穩(wěn)定在（79.02±3.91）g/L（P>0.05），至30 d時(shí)對照組溶菌酶含量顯著高于其他組（P<0.05），表明近江牡蠣長時(shí)間暴露在低pH值、鉛脅迫或低pH值與鉛脅迫共存的環(huán)境下均會使鰓組織溶菌酶基因的表達(dá)受到抑制，導(dǎo)致溶菌酶含量降低。組8的鰓組織溶菌酶含量自20 d開始隨時(shí)間的延長幾乎呈直線下降趨勢，至30 d時(shí)溶菌酶含量顯著低于其他組（P<0.05），表明低pH值與高質(zhì)量濃度鉛（5.00 mg/L）共同脅迫時(shí)，近江牡蠣鰓組織溶菌酶的表達(dá)受到明顯抑制。其余各試驗(yàn)組的鰓組織溶菌酶含量總體呈先下降、后上升、再下降的變化趨勢，表明低刺激強(qiáng)度下近江牡蠣在一定時(shí)期內(nèi)具有一定代謝適應(yīng)能力。

[JP2]由圖2可知，30 d時(shí)在各硝酸鉛質(zhì)量濃度下，酸化組近江牡蠣的鰓組織溶菌酶含量均低于正常pH值組，硝酸鉛質(zhì)量濃度分別為0.00、0.50、5.00 mg/L時(shí)差異顯著（P<0.05），0.05 mg/L時(shí)差異不顯著（P>0.05）；在2種pH值條件下，近江牡蠣鰓組織溶菌酶含量均隨硝酸鉛質(zhì)量濃度的增加而降低。

[TPLXM2.tif]

3結(jié)論與討論

McHenery等以30種貝類為研究對象，在其消化腺、外套膜、鰓、肌肉中均能檢測到溶菌酶活性[16]。本研究中，所有處理組的近江牡蠣鰓中均能檢測到較高含量的溶菌酶，而溶菌酶是生物體內(nèi)重要的非特異免疫因子之一，在機(jī)體免疫過程中不僅能催化水解細(xì)菌細(xì)胞壁而導(dǎo)致細(xì)菌溶解死亡，還可誘導(dǎo)調(diào)節(jié)其他免疫因子的合成與分泌[2]?？梢?，包括近江牡蠣在內(nèi)，貝類的鰓在防止病原微生物入侵方面起著重要作用。近江牡蠣受到pH值降低和鉛脅迫后，鰓組織溶菌酶含量呈先下降、后上升、再下降的趨勢。近江牡蠣在遭遇外界脅迫時(shí)，代謝受到抑制，溶菌酶含量降低；而后由于適應(yīng)性代謝加強(qiáng)，溶菌酶含量逐漸上升，甚至超過原有水平；隨著時(shí)間的延長，脅迫依然沒有解除，長時(shí)間的環(huán)境刺激超出近江牡蠣的適應(yīng)范圍，導(dǎo)致溶菌酶含量逐漸降低，免疫力下降。在養(yǎng)殖生產(chǎn)過程中，應(yīng)盡量避免養(yǎng)殖水體pH值過低、鉛含量過高，一旦發(fā)現(xiàn)應(yīng)及時(shí)調(diào)整，以保證近江牡蠣的免疫力維持在正常水平，減少病害的發(fā)生。

本研究表明，海洋酸化使近江牡蠣鰓中的溶菌酶含量降低，免疫力下降。Bibby等研究表明，海洋酸化對貝類的免疫系統(tǒng)具有很大影響；他們認(rèn)為可能的原因是pH值降低使 CaCO3 難以沉積，導(dǎo)致體內(nèi)Ca2+水平升高，Ca2+濃度的改變影響細(xì)胞的信號通路，進(jìn)而影響其新陳代謝和功能[17]。這只是一種可能性推斷，還需通過分子生物學(xué)等手段進(jìn)一步驗(yàn)證。目前，海洋酸化對貝類免疫功能影響的研究相對較少，其影響的生理生化及分子機(jī)制等尚待進(jìn)一步研究。

試驗(yàn)結(jié)果表明，pH值為8.0時(shí)，各硝酸鉛濃度組溶菌酶含量的變化幅度小于pH值為7.6時(shí)，即酸化條件下，鉛對近江牡蠣鰓組織溶菌酶含量的影響大于正常pH值條件時(shí)。當(dāng)pH值為7.6時(shí)，Pb（NO3）2 5.00 mg/L組的鰓組織溶菌酶含量隨時(shí)間的延長幾乎呈直線下降趨勢，至30 d時(shí)溶菌酶含量顯著低于其他組（P<0.05）?？梢?，酸化可加強(qiáng)鉛對近江牡蠣的毒性效應(yīng)，同時(shí)，鉛也可增強(qiáng)酸化對近江牡蠣的毒性效應(yīng)，二者具有聯(lián)合毒性效應(yīng)。

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