張彥青，王曉紅

(衡水學(xué)院 化工學(xué)院，河北 衡水 053000)

亮藍(lán)色素是一種常見(jiàn)的食用合成色素，合成成本較低，應(yīng)用廣泛。溶菌酶是一種的天然蛋白質(zhì)，在人體多種組織中都廣泛存在，穩(wěn)定性很好，耐熱，可在干燥條件下長(zhǎng)期保存，分子質(zhì)量較小。溶菌酶與藥物的相互作用方面的文獻(xiàn)報(bào)道不少[1-3]， 但研究溶菌酶與食用合成色素結(jié)合相互作用的文獻(xiàn)不多。本文利用熒光光譜法研究亮藍(lán)與溶菌酶之間的相互作用。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

主要儀器：FA2204B電子天平-上海精密科學(xué)儀器股份有限公司；F-7000熒光分析儀-日立。

試劑：亮藍(lán)-天津多福源實(shí)業(yè)有限公司；溶菌酶-上海伯奧生物科技有限公司。

2×10-5mol·L-1溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液；1×10-4mol·L-1亮藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)溶液。本實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

1.2 方法

1.2.1 熒光光譜分析

分別移取1.0×10-4mol/L的亮藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.5、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 mL于10 mL比色管中，再分別加入2×10-5mol/L溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液1 mL，用二次蒸餾水定容，配成亮藍(lán)-溶菌酶體系溶液，配置成三組，分別至于290、304、323 K三種不同的溫度水浴鍋中，穩(wěn)定10 min，設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm、激發(fā)和發(fā)射單元狹縫均為5.0 nm，在波長(zhǎng)范圍300～450 nm內(nèi)掃描亮藍(lán)-溶菌酶體系的熒光譜圖。

1.2.2 同步熒光光譜分析

分別吸取1.0×10-4mol/L的亮藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.5、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 mL于10 mL比色管中，再分別加入2×10-5mol/L溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液1 mL，用二次蒸餾水定容，配制成以亮藍(lán)為變量的亮藍(lán)-溶菌酶體系溶液，設(shè)定Δλ=15 nm和Δλ=60 nm，掃描同步熒光光譜。

2 結(jié)果與討論

2.1 亮藍(lán)與溶菌酶體系的有熒光猝滅機(jī)理

2.1.1 熒光光譜

由圖1可知，溶菌酶在344 nm處有最高峰值，隨著亮藍(lán)濃度的逐漸增高，溶菌酶的強(qiáng)度明顯下降，說(shuō)明亮藍(lán)對(duì)于溶菌酶有猝滅作用[11]這說(shuō)明亮藍(lán)對(duì)溶菌酶能夠產(chǎn)生熒光猝滅，更進(jìn)一步說(shuō)明兩者可以發(fā)生相互作用。按方程(1)進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)如圖2。

F0/F=1+Ksv[Q]=1+kqτ0[Q] (1)

式中Ksv為猝滅常數(shù)，L·mol-1；[Q]為亮藍(lán)的濃度，mol-1·L；Kq是速率常數(shù)，L·mol-1·s-1；τ0為無(wú)猝滅劑存在下熒光分子的平均壽命，s。

根據(jù)直線的斜率可求得溫度為290、304、323 K時(shí)的動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)Ksv分別為7.70×104，4.17×104，3.41×104mol/L，Kq分別為7.70×1012，4.17×1012，3.41×1012mol/L，相關(guān)系數(shù)分別為0.9982，0.9976，0.9974，表明各條曲線呈線性。而亮藍(lán)對(duì)溶菌酶的猝滅常數(shù)Ksv隨溫度升高而降低，表明只存在一種猝滅類型。通常情況下認(rèn)為，各種熒光猝滅劑對(duì)生物大分子的動(dòng)態(tài)猝滅速率常數(shù)的最大值約為2.0×1010L·mol-1·s-1。本實(shí)驗(yàn)在290、304、323 K時(shí)亮藍(lán)對(duì)溶菌酶的猝滅常數(shù)遠(yuǎn)大于2.0×1010L·mol-1·s-1，因此可知亮藍(lán)對(duì)溶菌酶的猝滅過(guò)程屬于靜態(tài)猝滅。

圖1 290 K亮藍(lán)-溶菌酶體系熒光光譜圖

圖2 不同溫度時(shí)亮藍(lán)對(duì)溶菌酶的熒光猝滅Stern-Volmer曲線

2.1.2 亮藍(lán)-溶菌酶的結(jié)合常數(shù)

對(duì)于靜態(tài)猝滅，亮藍(lán)-溶菌酶作用之間的結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)用公式(2)[4]求得

lg[(F0-F)/F]=lgKA+nlg[Q] (2)

式中：F0、F分別為加入亮藍(lán)前后溶菌酶的熒光強(qiáng)度；K為結(jié)合常數(shù)，L·mol-1；n為結(jié)合位點(diǎn)數(shù)；[Q]為亮藍(lán)的濃度，mol-1·L。由表1可知在不同的溫度體系下結(jié)合常數(shù)K較大，說(shuō)明兩者之間的結(jié)合作用較大。

2.1.3 熱力學(xué)參數(shù)

化學(xué)小分子與生物大分子之間的作用力通常有有疏水作用、范德華力、氫鍵作用、靜電作用[5]，它們間的作用力可以根據(jù)反應(yīng)前后熱力學(xué)焓變(ΔH)和熵變(ΔS)的相對(duì)大小求得。即ΔH>0，ΔS<0，主要為疏水作用；若ΔH<0，ΔS<0，則主要是范德華力和氫鍵作用；若ΔH<0，ΔS>0，則是靜電作用。根據(jù)公式 (3)(4)(5)可求得ΔH，△G和ΔS，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，不同溫度下的△G均小于0，表明亮藍(lán)和溶菌酶之間的相互作用是自發(fā)的。由焓變和熵變可知，亮藍(lán)與溶菌酶之間的主要作用力為范德華力和氫鍵[13]。

ln(K2/K1) =(1/T1-1/T2)(ΔH/R) (3)

ΔG=-RTlnK (4)

ΔG=ΔH-TΔS (5)

表 1 亮藍(lán)與溶菌酶之間的熱力學(xué)參數(shù)

2.2 亮藍(lán)與溶菌酶體系的同步熒光光譜

分別將的Δλ設(shè)定為15和60 nm，掃描即得到溶菌酶在加入亮藍(lán)前后酪氨酸和色氨酸殘基的同步熒光特征光譜[6]，結(jié)果見(jiàn)圖3。

當(dāng)Δλ為15nm時(shí)亮藍(lán)-溶菌酶體系的同步熒光光譜圖

當(dāng)Δλ為60nm時(shí)亮藍(lán)-溶菌酶體系的同步熒光光譜圖圖3 亮藍(lán)濃度對(duì)溶菌酶同步熒光光譜的影響

由圖3可知，隨著亮藍(lán)濃度的增加而熒光強(qiáng)度降低，溶菌酶的峰形基本保持不變，說(shuō)明沒(méi)有改變?nèi)芫傅臉?gòu)象，Δλ=60熒光強(qiáng)度下降較為明顯，所以結(jié)合位點(diǎn)更接近色氨酸殘基，進(jìn)一步表明亮藍(lán)-溶菌酶之間發(fā)生了熒光猝滅。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用熒光光譜法亮藍(lán)與溶菌酶的相互作用，研究表明亮藍(lán)與溶菌酶是靜態(tài)猝滅，兩者之間的作用力主要是范德華力和氫鍵作用；從同步熒光光譜中可以得知亮藍(lán)沒(méi)有改變?nèi)芫傅臉?gòu)象。這些結(jié)論對(duì)于溶菌酶的進(jìn)一步探究提供了積極意義。