侯飛俠+曹靜+王沙沙++王茜+袁媛+彭成+萬德光+國錦琳

[摘要]冬蟲夏草為我國傳統(tǒng)名貴中藥材。資源短缺、價(jià)格昂貴和巨大的市場需求導(dǎo)致市售冬蟲夏草摻偽摻假現(xiàn)象嚴(yán)重，亟需建立快速有效的鑒別方法。該研究基于實(shí)驗(yàn)前期已建立的冬蟲夏草快速鑒定SSPCR方法，按照體外診斷試劑評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)開發(fā)試劑盒，并對試劑盒的特異性、檢測限、重復(fù)性及保存期4項(xiàng)性能進(jìn)行了評價(jià)。結(jié)果顯示冬蟲夏草質(zhì)量占混合物質(zhì)量的1/200（質(zhì)量分?jǐn)?shù)05%以上）以上時(shí)可被成功檢測。試劑盒對冬蟲夏草及其偽品的檢測結(jié)果顯示，僅有冬蟲夏草可被成功擴(kuò)增，并在紫外下顯示綠色熒光。該試劑盒37 ℃溫育7 d仍有效，說明4 ℃保存其在1年內(nèi)穩(wěn)定有效。同一批次試劑盒在不同條件下，不同批次試劑盒在相同條件下，其檢測結(jié)果均一致且準(zhǔn)確，表明試劑盒具有良好的批內(nèi)及批間重復(fù)性。將該試劑盒用于市售冬蟲夏草及其混偽品的檢測，操作簡單快速，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，為下一步中藥快檢試劑盒的商品化奠定了基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞]冬蟲夏草； 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）； 檢測試劑盒Development and evaluation of

[Abstract]Ophiocordyceps sinensis is a valuable traditional Chinese medicine. Due to resource shortage， expensive price and huge market demand， there are many adulterants of O. sinensis in markets. Therefore， it is necessary to establish a rapid and effective method for distinguishing O. sinensis. Based on the speciesspecific PCR of O. sinensis， this study developed a detection kit by optimizing the components and evaluated the specificity， detection limit， repeatability and shelf life of the kit. The results showed that when the quality of O. sinensis accounted for more than 1/200 of that mixture， it could be detected successfully. Moreover， only O. sinensis could be amplified and glowed bright green fluorescence under ultraviolet light. The kit was still in effect when it was placed at 37 ℃ for three days， which indicated that it was stable and effective for one year stored in 4 ℃. The kit in the same batch under different operation conditions， and in different batch under the same operation conditions gave the same result and accuracy， which showed good repeatability of the kit. It is simple， rapid and accurate to distinguish O. sinensis from its adulterants using the kit， and lays the foundation for commercialization of traditional Chinese medicine fast detection kit.

[Key words]Ophiocordyceps sinensis； PCR； detection kit

冬蟲夏草是麥角菌科真菌冬蟲夏草菌Ophiocordyceps sinensis寄生在蝙蝠蛾科昆蟲幼蟲上的子座和幼蟲尸體的干燥復(fù)合體[1]，具有補(bǔ)腎益肺，止血化痰的功效，臨床用于治療腎虛精虧，久咳虛喘等癥，為我國傳統(tǒng)名貴中藥材。由于野生資源有限且受到過度采挖，規(guī)模化的人工培育也尚未實(shí)現(xiàn)，導(dǎo)致冬蟲夏草價(jià)格昂貴。巨大的市場需求也導(dǎo)致市售冬蟲夏草摻偽摻假現(xiàn)象嚴(yán)重，亟需建立快速有效的鑒別方法?，F(xiàn)有的冬蟲夏草真?zhèn)舞b別方法包括性狀鑒別、顯微鑒別、理化鑒別和DNA條形碼技術(shù)[2]等。形狀鑒別主要通過觀察冬蟲夏草蟲體和子座的顏色、大小、足的數(shù)目、氣味等[36]。顯微鑒別主要觀察蟲體中央的結(jié)構(gòu)、軀殼表皮有無著生絨毛、軀殼內(nèi)有無菌絲、子座橫、縱切面、子囊殼的包埋位置、子囊殼及子囊孢子形態(tài)、大小等[35， 7]。理化鑒別包括：紫外吸收光譜法[8]、紅外光譜法[9]、薄層色譜法[10]、毛細(xì)管電泳法[11]、蛋白電泳法[12]、免疫分析法[13]等。以上鑒定方法均需要鑒定者具有一定的理論基礎(chǔ)和豐富的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，同時(shí)耗時(shí)長，多需要大型儀器支持，推廣難度較大。而DNA條形碼技術(shù)是基于不同物種的遺傳信息載體DNA的差異性來進(jìn)行物種鑒別，具有穩(wěn)定性高，重復(fù)性好的特點(diǎn)，但是該技術(shù)基于測序分析需要測序儀等大型儀器，實(shí)驗(yàn)投入大，周期較長，而且對NCBI等數(shù)據(jù)庫依賴性強(qiáng)，準(zhǔn)確度值得商榷。由此可見，目前的冬蟲夏草鑒別方法均不能滿足快速而有效的鑒定要求。本研究基于實(shí)驗(yàn)前期已建立的冬蟲夏草快速鑒定SSPCR（speciesspecific PCR）方法，開發(fā)冬蟲夏草快速檢測試劑盒。1材料與方法

11樣品

本文所用樣品均經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)國錦琳教授鑒定，憑證樣品保存于成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，樣本信息見表1。

12試劑盒的組成

冬蟲夏草PCR快速鑒定試劑盒規(guī)格為50次/盒，試劑組成見表2，其中Primer premix為1對冬蟲夏草特異引物（SIF6： 5′TTGGTGAACCAGCGGAGGGATCATT3′，SIR6：5′GCTTGCTTCTTGACTGAGAGGTGCC3′），根據(jù)其rDNA ITS序列的特異性位點(diǎn)設(shè)計(jì)而來，擴(kuò)增片段大小為174 bp。以冬蟲夏草基因組DNA為陽性對照，無菌ddH2O為陰性對照。

13試劑盒的使用

試劑盒使用方法如下：①改良堿裂解法快速提取蟲草基因組DNA。在約10 mg蟲草子座粉末中加入80 μL Buffer A，混勻，再加入160 μL Buffer B混勻后，靜置5 min，取上清液即得蟲草基因組DNA。②PCR擴(kuò)增：擴(kuò)增體系為25 μL /PCR，包含125 μL 2×Taq PCR master mix，2 μL Primer premix，待檢樣品或陽、陰性對照品 1 μL，補(bǔ)充ddH2O至25 μL；擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性1 min，然后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，條件為94 ℃變性30 s，67 ℃退火并延伸30 s。③熒光檢測：在擴(kuò)增產(chǎn)物中加入2 μL 100×SYBR Green Ⅰ混勻后，置紫外燈下觀察是否顯示綠色熒光，若顯示，則為冬蟲夏草，反之，則為偽品。

侯飛俠等：冬蟲夏草PCR快速檢測試劑盒的研制與效果評價(jià)14試劑盒的性能檢測

參考2015年版《中國藥典》三部生物診斷試劑盒的要求[14]，對試劑盒的特異性、檢測限、重復(fù)性和保存期等性能進(jìn)行了考察。

141特異性以表1所列蟲草的基因組DNA為模板，用本研究開發(fā)的試劑盒進(jìn)行特異性檢測。

142檢測限分別將質(zhì)量為5，125，25，50，100，200，400，5 000 μg的冬蟲夏草子座粉末混勻于蛹蟲草子座粉末中，使混合粉末的質(zhì)量為5 mg，再分別用試劑盒進(jìn)行檢測。

143重復(fù)性隨機(jī)取同批次組裝的試劑盒3盒，分別在不同操作條件（不同操作時(shí)間、人員、地點(diǎn)、人員以及不同型號的PCR儀）下對陽性對照和陰性對照進(jìn)行檢測，考察批內(nèi)重復(fù)性，見表3。

隨機(jī)選取3盒不同批次的試劑盒，在相同的試驗(yàn)條件下對陽性對照和陰性對照進(jìn)行檢測，考察批間重復(fù)性。

144保存期參考生物診斷試劑盒保存期加速破壞試驗(yàn)，37 ℃保存3 d后仍有活性，表明該試劑盒可在4～8 ℃保存6個(gè)月，37 ℃保存7 d后仍有活性，表明該試劑盒可在4～8 ℃穩(wěn)定保存1年。本研究將試劑盒分別置于37 ℃ 3 d和7 d后取出對陽性對照和陰性對照進(jìn)行檢測，考察試劑盒的保存期。

15應(yīng)用

使用該試劑盒，分別對成都荷花池中藥材專業(yè)市場銷售的冬蟲夏草12份，偽品及金針蟲蟲草Cordyceps agriota各6份進(jìn)行檢測。

2結(jié)果

21試劑盒的特異性及檢測限

利用該試劑盒對表1所列的冬蟲夏草、涼山蟲草、蛹蟲草、古尼蟲草及蟬花進(jìn)行檢測。僅有冬蟲夏草可擴(kuò)增出174 bp的目的條帶。在擴(kuò)增產(chǎn)物中加入核酸染料SYBR Green I后，僅有冬蟲夏草顯示綠色熒光，結(jié)果見圖1。

冬蟲夏草和蛹蟲草不同比例混合的5 mg粉末采用本試劑盒進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，含有25 μg及以上質(zhì)量的冬蟲夏草可顯示綠色熒光，即冬蟲夏草與混合物的比例為1∶200以上時(shí)可被成功檢測，見圖2。

22試劑盒的重復(fù)性

從2015年12月19日組裝的試劑盒中隨機(jī)選取3盒，在不同操作條件（不同操作時(shí)間、地點(diǎn)、人員、儀器）下分別對陽性對照和陰性對照進(jìn)行測試。結(jié)果表明，陽性對照在紫外下均顯示綠色熒光，陰性對照均無，說明試劑盒具有良好的批內(nèi)重復(fù)性，見圖3。在相同的操作條件下，利用3盒不同批次的試劑盒分別對陽性和陰性對照進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，陽性對照均顯示綠色熒光，陰性對照則不顯示，說明試劑盒批間重復(fù)性良好，見圖4。

23試劑盒的保存期

試劑盒中NaOH和TrisHCl在常溫下性質(zhì)穩(wěn)定，而引物、含有DNA Taq酶和dNTP的2×Taq PCR master mix需在-20 ℃凍存以保持活性。試劑盒的保質(zhì)期表現(xiàn)了試劑盒在未經(jīng)使用時(shí)本身的穩(wěn)定性，本研究參考藥典規(guī)定的生物制劑試劑盒的保存期加速破壞試驗(yàn)，測試結(jié)果見圖5，37 ℃溫育3 d，陽性對照仍可被有效擴(kuò)增，37 ℃溫育7 d，陽性對照仍能被有效擴(kuò)增。保存期考察表明，試劑盒4 ℃保存在1年內(nèi)穩(wěn)定有效。

24試劑盒的實(shí)踐應(yīng)用

采用本研究研制的試劑盒分別對市售的12份冬蟲夏草，6份偽品蟲草和6份金針蟲蟲草進(jìn)行檢測。結(jié)果見圖6。 12份冬蟲夏草的試劑盒檢測均為陽性，而12份非冬蟲夏草的試劑盒檢測為陰性，說明該試劑盒可用于檢測市售冬蟲夏草的真?zhèn)巍?/p>

3討論

冬蟲夏草產(chǎn)于青藏高原海拔3 000 m以上的高山草甸及灌木叢下，近年來由于全球變暖導(dǎo)致雪線上移，寄主昆蟲蝙蝠蛾大量死亡，加之過度采挖，野生資源下降明顯，目前尚無規(guī)?；娜斯づ嘤夹g(shù)，但市場需求巨大，供需矛盾日益顯著。全世界冬蟲夏草的近緣物種有近300種，部分形態(tài)與冬蟲夏草相似度極高，常規(guī)形態(tài)鑒別方法難以區(qū)分，粉末、飲片等加工品更是難以鑒別，導(dǎo)致市售冬蟲夏草摻偽摻假現(xiàn)象頻發(fā)[15]，嚴(yán)重影響臨床用藥安全和人民健康。現(xiàn)鑒定方法大多對實(shí)驗(yàn)環(huán)境、操作人員經(jīng)驗(yàn)要求高，操作復(fù)雜，多需大型儀器，推廣應(yīng)用有一定的難度。而物種特異性PCR（speciesspecific PCR，SSPCR）擴(kuò)增技術(shù)，通過設(shè)計(jì)高特異性的引物，序列經(jīng)PCR擴(kuò)增后，通過檢測靶標(biāo)片段的有無，從而實(shí)現(xiàn)鑒別物種的目的。該技術(shù)特異性強(qiáng)，同時(shí)通過電泳圖譜實(shí)現(xiàn)定性鑒別，省去測序分析等，降低成本，節(jié)約時(shí)間。目前已運(yùn)用SSPCR方法成功鑒別了白花蛇舌草[16]、金銀花[17]、蘄蛇[18]、烏梢蛇[19]、人參[20]、黃芪[21]等中藥材。本研究在冬蟲夏草的SSPCR技術(shù)基礎(chǔ)上，開發(fā)出了其快速檢測試劑盒。本試劑盒首先采用改良的堿裂解法提取蟲草基因組DNA，提取過程中無需離心，擺脫了其對離心機(jī)的依賴性。同時(shí)本試劑盒利用SSPCR技術(shù)對冬蟲夏草進(jìn)行鑒定，采用SYBR Green I 熒光檢視代替瓊脂糖凝膠電泳，無需使用電泳儀及凝膠成像系統(tǒng)等大型儀器，節(jié)約了時(shí)間，使冬蟲夏草的現(xiàn)場檢測成為可能。本研究證實(shí)了該試劑盒的特異性、重復(fù)性和穩(wěn)定性良好，對市售冬蟲夏草的真?zhèn)舞b定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，為下一步中藥快檢試劑盒的商品化奠定了基礎(chǔ)。

[參考文獻(xiàn)]

[1]中國藥典一部[S] 2015：115.

[2]Chen Y Q， Wang N， Qu L H， et al Determination of the anamorph of Cordyceps sinensis inferred from the analysis of the ribosomal DNA internal transcribed spacers and 58S rDNA[J] Biochem Syst Ecol， 2001（29）：597

[3]孫超不同產(chǎn)地冬蟲夏草的質(zhì)量參數(shù)測定[J]環(huán)境昆蟲學(xué)報(bào)，2015（5）：1049

[4]徐如英冬蟲夏草的真?zhèn)舞b別[J]中國藥業(yè)，2010，19（24）：69

[5]楊艷青，段軍華冬蟲夏草與其偽品的鑒別[J]世界中西醫(yī)結(jié)合雜志，2012，7（1）：31

[6]康帥，張繼，林瑞超冬蟲夏草的性狀和顯微鑒定研究[J]藥學(xué)學(xué)報(bào)， 2013，48（3）：428

[7]Au Dawn， Wang Lijing， Yang Dajian， et al Application of microscopy in authentication of valuable Chinese medicine ICordyceps sinensis， its counterfeits， and related products[J] Microsc Res Tech， 2012， 75（1）：54

[8]徐小東冬蟲夏草的正品與混淆品的鑒別方法分析[J]醫(yī)藥前沿，2015，5（23）：309

[9]張聲俊紅外光譜法對冬蟲夏草的三級鑒定和研究[J]山地農(nóng)業(yè)生物學(xué)報(bào)，2011，30（3）：230

[10]滕偉卓蝙蝠蛾擬青霉菌株發(fā)酵工藝優(yōu)化、菌粉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及免疫活性研究[D]長春：吉林大學(xué)，2015

[11]古今，劉萍，馮建涌用高效毛細(xì)管電泳法鑒別冬蟲夏草及其偽品[J]藥學(xué)服務(wù)與研究，2005， 5（3）：230

[12]陳璐名貴中藥冬蟲夏草特征性蛋白質(zhì)成分與鑒定方法研究[D]成都：成都中醫(yī)藥大學(xué)，2011

[13]李楊冬蟲夏草免疫鑒定技術(shù)研究[D]沈陽：遼寧大學(xué)，2013

[14]中國藥典三部[S] 2015：378

[15]姜碧清冬蟲夏草及其混淆品、摻雜品、偽品的性狀鑒別[J].中國藥業(yè)，2009， 18（8）：56

[16]劉忠權(quán)，丁小余，丁秉中物種特異性PCR在中藥材白花蛇舌草鑒定中的應(yīng)用[J] 南京師大學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版， 2006， 29（3）：91

[17]唐曉晶，馮成強(qiáng)，黃璐琦，等蘄蛇及其混淆品高特異性PCR鑒別[J] 藥物分析雜志， 2006（2）：152

[18]蔣超中藥現(xiàn)場、快速鑒別方法的建立——以金銀花為例[D]北京：中國中醫(yī)科學(xué)院，2013

[19]唐曉晶，馮成強(qiáng)，黃璐琦，等高特異性PCR方法鑒別烏梢蛇及其混淆品[J]中國藥學(xué)雜志， 2007， 42（5）：333

[20]Wang H， Kim M K， Kwon W S， et al Molecular authentication of Panax ginseng and ginseng products using robust SNP markers in ribosomal external transcribed spacer region[J] J Pharm Biomed Anal， 2011， 55（5）：972

[21]龍平， 崔占虎， 李虔全， 等 基于位點(diǎn)特異性PCR的黃芪與紅芪鑒別方法研究[J]中國中藥雜志， 2013， 38（16）：2581[責(zé)任編輯呂冬梅]