陳罡

(遼寧省林業(yè)科學(xué)研究院，遼寧 沈陽 110032)

林木組培快繁技術(shù)中常見問題及對(duì)策

陳罡

(遼寧省林業(yè)科學(xué)研究院，遼寧 沈陽 110032)

針對(duì)林木組培快繁過程中經(jīng)常出現(xiàn)的污染、褐化及玻璃化問題的產(chǎn)生原因和控制措施進(jìn)行了綜述，為今后林木組培快繁研究提供技術(shù)參考，同時(shí)也為開展新品種苗木組培的科研和生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)和實(shí)踐指導(dǎo)。

林木；組織培養(yǎng)；污染；褐化；玻璃化

植物組培快繁技術(shù)是在植物細(xì)胞具有全能性的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的無性繁殖技術(shù)，該技術(shù)已有100多年的歷史，至今已日趨成熟[1]。其技術(shù)核心是通過無菌操作，將從植物體中分離出所需的細(xì)胞、組織、器官等在人工控制條件下進(jìn)行培養(yǎng)并獲得再生的完整植株或生產(chǎn)具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值產(chǎn)品的現(xiàn)代生物技術(shù)。目前，已在花卉、蔬菜、作物、經(jīng)濟(jì)植物及珍稀植物中的科研和生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用，也是植物轉(zhuǎn)基因、遺傳育種、脫毒培養(yǎng)及種質(zhì)資源保護(hù)等研究中的重要技術(shù)手段。由于組培快繁技術(shù)不受地域、氣候等條件限制，一旦獲得植物材料便可進(jìn)行繁殖等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)于生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，某些有性繁殖困難以及扦插成活率低的林木來說，更是具有巨大的應(yīng)用價(jià)值，目前已有200多種木本植物開展了組織培養(yǎng)、體細(xì)胞培養(yǎng)及工廠化育苗等研究。在進(jìn)行林木組培快繁工作時(shí)，由于操作不當(dāng)、林木一些自身生理特性及外界環(huán)境條件等原因，常會(huì)遇到污染、褐化和玻璃化等一系列難題，影響植物材料的正常發(fā)育，嚴(yán)重時(shí)，會(huì)給科研和生產(chǎn)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，了解這些問題產(chǎn)生的原因、影響因素及解決方法，不僅可以節(jié)省技術(shù)成本，更是提高林木組織培養(yǎng)成功率的關(guān)鍵，同時(shí)為今后開展組培快繁新技術(shù)提供參考。

1 污染及對(duì)策

微生物污染問題始終出現(xiàn)并貫穿整個(gè)組培過程，如何避免和降低污染率是植物組培快繁技術(shù)的首要難題。微生物污染主要分為接種前污染、接種中污染和接種后污染3個(gè)階段。接種前污染即前期準(zhǔn)備階段，主要由培養(yǎng)基、接種工具、接種環(huán)境滅菌和消毒不徹底引起的[2]；接種中污染即無菌操作階段，主要由超凈工作臺(tái)濾除菌超標(biāo)、外植體消毒處理不當(dāng)、無菌操作不規(guī)范造成操作過程中有交叉污染等引起的[3]；接種后污染即培養(yǎng)階段，主要由培養(yǎng)環(huán)境不潔凈以及由真菌和細(xì)菌引起的內(nèi)源菌污染等[4]。

對(duì)于避免接種前污染，要做到定期對(duì)接種環(huán)境進(jìn)行通風(fēng)換氣和消毒，紫外線照射消毒，75%酒精噴霧消毒，培養(yǎng)基及接種器具力求徹底高壓滅菌消毒，培養(yǎng)基即配即用，對(duì)于剩余放置超過一周的培養(yǎng)基和器皿再次使用要進(jìn)行二次消毒，避免非工作人員進(jìn)出接種室，每次接種前要對(duì)超凈工作臺(tái)面和接種室進(jìn)行紫外燈滅菌30 min。對(duì)于預(yù)防接種中污染，主要是外植體合理的選擇和適宜的處理[5]。首先要根據(jù)不同材料選擇合適的外植體，再根據(jù)外植體選擇與其相適宜的消毒劑和消毒方法，如一般常選用的消毒劑有乙醇、氯化汞、次氯酸鈉、過氧化氫等，先根據(jù)每種消毒劑的特性，對(duì)消毒劑濃度和時(shí)間進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)后再確定最佳消毒體系，如有需要，也可以將消毒劑進(jìn)行組合使用。

木本植物木質(zhì)化程度高，盡量避免選取木質(zhì)化莖，而選取胚、幼嫩莖尖、當(dāng)年新生枝條等為外植體，選取原則是污染少。如有條件，最好是能夠?qū)⒅参锘蛑l在室內(nèi)培養(yǎng)一段時(shí)間后再取。針對(duì)不同外植體選擇不同消毒劑類型、濃度和消毒時(shí)間，初次接種時(shí)，要根據(jù)不同植物品種對(duì)其進(jìn)行試驗(yàn)摸索，既能將消毒率達(dá)到最高，又對(duì)外植體的傷害降到最低。接種過程中操作人員要嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)室無菌操作流程進(jìn)行，工具用一次消毒一次，培養(yǎng)器皿瓶口用70%酒精擦拭后在開蓋，以避免交叉污染。此外，要對(duì)超凈工作臺(tái)潔凈等級(jí)和工作狀態(tài)進(jìn)行定期檢查。為防止培養(yǎng)階段污染，培養(yǎng)環(huán)境要潔凈，可根據(jù)需要在培養(yǎng)基中加入藥劑以抑制內(nèi)源污染菌，如抗生素、單寧酸等抑菌劑。在使用抑菌劑時(shí)要注意抑微生物污染的種類和使用濃度，要注意避免對(duì)培養(yǎng)的植物組織有不良影響。此外，如單獨(dú)使用抑菌劑效果不理想，也可在培養(yǎng)基中加兩種或兩種以上抑菌劑[6]。

2 褐化及對(duì)策

褐化現(xiàn)象是木本植物組織培養(yǎng)中的常見問題，即外植體在培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基和培養(yǎng)物變褐而最終導(dǎo)致培養(yǎng)物死亡的現(xiàn)象[7]，它能夠嚴(yán)重影響外植體再分化和脫分化進(jìn)程。褐化與外植體內(nèi)酚類物質(zhì)的含量呈正相關(guān)，因此又稱酚污染[8]。由于酚類糖苷化合物的含量又與植物中的木質(zhì)素、單寧和色素含量相關(guān)，而在木本植物中三者的含量要比草本植物高，因此木本植物更容易發(fā)生褐化現(xiàn)象[9]，也是木本植物組培快繁能否取得成功的重要因素。已有研究表明，產(chǎn)生褐化的原因主要有兩個(gè)方面：一個(gè)是非酶促褐化，一個(gè)是酶促褐化[10]。非酶促褐化主要是由外界環(huán)境引起的程序化死亡[9]；酶促褐化是培養(yǎng)物組織中多酚氧化酶、過氧化物酶或苯丙氨酸解氨酶等被激活[11]，將多酚化合物氧化成褐色的醌類物質(zhì)，這些醌類物質(zhì)引起外植體中其他酶失活，導(dǎo)致代謝紊亂，生長(zhǎng)受阻[12]。影響褐化發(fā)生的主要因素有三個(gè)方面：外植體的選擇(外植體年齡、大小、種類、和消毒等)、培養(yǎng)條件(溫度、光照和pH值等)和培養(yǎng)基(培養(yǎng)基成分、狀態(tài)、硬度和激素、添加劑等)[13]。

在實(shí)際培養(yǎng)過程中，外植體的褐化一般會(huì)受到以上多種因素的相互作用的影響，因此防止褐化發(fā)生也是多種多樣，然而每種方法都有一定適用性和局限性，因此，要根據(jù)具體實(shí)際情況，有選擇性的采取相應(yīng)措施抑制或減輕褐化現(xiàn)象的發(fā)生。首先要選擇適宜的外植體。在木本植物中，多年生、木質(zhì)化程度高的枝條褐化程度高，高度分化的組織易發(fā)生褐化[14]，在選取外植體時(shí)應(yīng)選擇幼齡枝條或當(dāng)年生枝條，外植體采樣時(shí)間則盡量選在冬春季，處于休眠期的枝條酚類物質(zhì)含量較少，在對(duì)外植體進(jìn)行消毒時(shí)，消毒時(shí)間不宜過長(zhǎng)。其次，在接種前先將外植體遮光低溫一段時(shí)間，再用無菌水反復(fù)清洗可起到減輕外植體的褐化作用。祁翔等[15]對(duì)紅掌組培研究中發(fā)現(xiàn)在接種前培養(yǎng)基中添加抗氧化劑有助于減少外植體的褐化。適宜的培養(yǎng)基和培養(yǎng)環(huán)境能夠很好地調(diào)控褐化現(xiàn)象。再次，要注意培養(yǎng)基成分、蔗糖濃度和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑水平的配比。一般來說，固體培養(yǎng)基的褐化率最高，而液體培養(yǎng)基褐化率低[16]。無機(jī)鹽和大量元素濃度偏高會(huì)使褐化率增高，微量元素偏多會(huì)使褐化率減低，細(xì)胞分裂素的濃度也不宜過高，較低的pH值可以抑制褐化的發(fā)生。在培養(yǎng)基中加入防褐劑(抗壞血酸、聚乙烯吡咯烷酮、硫代硫酸鈉、硝酸銀、檸檬酸)和吸附劑(活性炭)是目前常用的一種有效措施， 李萍等[17]研究了4種防褐劑對(duì)牡丹組培中褐化的控制作用及對(duì)組培苗的生長(zhǎng)和增殖作用，較好地解決了牡丹組培快繁中的褐化問題。此外，還要注意調(diào)節(jié)光照、溫度和通風(fēng)。15 ℃～20 ℃、弱光或黑暗條件下培養(yǎng)可減輕培養(yǎng)物褐變的發(fā)生。

3 玻璃化及對(duì)策

玻璃化也是在草本和木本植物組織培養(yǎng)過程中經(jīng)常遇到的不良現(xiàn)象，是指在培養(yǎng)過程中，組培苗生長(zhǎng)異常，呈半透明鮮綠水漬狀[1]。葉片縱向卷曲或腫脹，且脆弱易碎。玻璃化苗內(nèi)體含水量高、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量少、光合能力差、酶活性低，其繼代培養(yǎng)分化能力低，生根培養(yǎng)困難，移栽后不易成活[18]。

在林木組培過程中有許多因素會(huì)產(chǎn)生玻璃化苗，主要包括外植體材料本身、培養(yǎng)基條件和培養(yǎng)環(huán)境幾個(gè)方面。外植體的種類和類型會(huì)影響玻璃化的產(chǎn)生，選取幼小外植體容易發(fā)生玻璃化現(xiàn)象[13]。從培養(yǎng)基狀況來看，產(chǎn)生玻璃化苗的因素包括培養(yǎng)基中pH值、激素水平、蔗糖、瓊脂以及NH4+的濃度等；培養(yǎng)條件也是產(chǎn)生玻璃化的關(guān)鍵因素。培養(yǎng)環(huán)境中的溫濕度和光照等均在不同程度上影響著玻璃化苗的發(fā)生率。因此為防止玻璃化苗的出現(xiàn)，應(yīng)從以上因素著手解決，尤其是在培養(yǎng)基條件和培養(yǎng)環(huán)境上?？梢允褂霉腆w培養(yǎng)基，適當(dāng)增加瓊脂和蔗糖濃度降低培養(yǎng)基滲透勢(shì)或使用滲透劑[1]，以及酸性條件培養(yǎng)等來降低玻璃化程度。楊雪等[19]對(duì)紅葉石楠組培苗玻璃化影響因子及其克服技術(shù)進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，培養(yǎng)基離子濃度或細(xì)胞分裂素增高玻璃化苗增多，降低溫度或提高培養(yǎng)基硬度可使玻璃化苗減少，卡拉膠比瓊脂更容易導(dǎo)致玻璃化。鄒恩強(qiáng)等[20]研究表明，在培養(yǎng)中適當(dāng)降低外源細(xì)胞分裂素(BA)和NH4+的濃度，可有效降低玻璃化的發(fā)生。

胡淑英等[21]在對(duì)濱梅組培苗玻璃化成因及克服技術(shù)研究中發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)溫度和光照時(shí)間是玻璃化的重要影響因子，因此要注意對(duì)培養(yǎng)溫度的控制，避免環(huán)境溫度過高，必要時(shí)還要進(jìn)行低溫處理來消除玻璃化。還應(yīng)注意對(duì)光照時(shí)間和光照強(qiáng)度的控制，培養(yǎng)初期可適當(dāng)進(jìn)行弱光培養(yǎng)或暗培養(yǎng)，分化階段再進(jìn)行強(qiáng)光培養(yǎng)，適當(dāng)增加自然光照，自然光中的紫外線可以促進(jìn)組培苗成熟，抑制玻璃化的產(chǎn)生[13]。此外還要注意培養(yǎng)容器的通風(fēng)，通氣性差的封口膜可提高玻璃化苗的發(fā)生率，因此，要選擇通透性好的透氣膜以促進(jìn)氣體交換，降低培養(yǎng)容器內(nèi)的相對(duì)濕度以減少玻璃化的出現(xiàn)。

4 展望

開展林木組培快繁技術(shù)研究，對(duì)促進(jìn)林木良種選育、保護(hù)珍優(yōu)林木品種、推廣種植優(yōu)良樹種以及滿足苗木市場(chǎng)需求等方面具有十分重要意義。但在進(jìn)行林木組培快繁研究和生產(chǎn)中，不可避免地會(huì)受到污染、褐化以及玻璃化現(xiàn)象的影響，這不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)工提高研究和生產(chǎn)成本，更會(huì)影響林木種苗的技術(shù)推廣及工廠化生產(chǎn)的實(shí)施與進(jìn)度。因此，如何更好地避免和解決三大問題，是林木組培研究急需解決的問題，使其在科研和生產(chǎn)上得以廣泛應(yīng)用。本文闡述了這些問題的產(chǎn)生原因以及解決方法，既可以預(yù)防和控制其發(fā)生，對(duì)于已發(fā)生問題的組培苗，又可通過以上解決措施進(jìn)行二次處理后重新培養(yǎng)，以免造成更大損失。隨著科學(xué)水平的持續(xù)發(fā)展，基礎(chǔ)理論的不斷深入、組培新技術(shù)[22](開放式組培、光自養(yǎng)組培)的不斷更新以及技術(shù)設(shè)備的日益完備，組織培養(yǎng)中三大難題的控制措施，尤其是褐化與玻璃化機(jī)制研究將會(huì)取得更大的進(jìn)展。

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1005-5215(2017)04-0100-03

2017-03-12

陳罡(1980-)，男，遼寧沈陽人，碩士，高級(jí)工程師，主要從事林木生物技術(shù)研究，Email：chengang1625@163.com

S821.3

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10.13601/j.issn.1005-5215.2017.04.038