朱超亞，劉志剛，黃俊，魏清柱，劉愛群，吳碧芳，洪國保，祝爽爽，鄒和群

(1南方醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院·泌尿疾病研究所，廣州 510630；2深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)院; 3廣州市第一人民醫(yī)院)

特發(fā)性膜性腎病患者血清中小麥蛋白抗體的水平變化及意義

朱超亞1，劉志剛2，黃俊3，魏清柱1，劉愛群1，吳碧芳1，洪國保1，祝爽爽1，鄒和群1

(1南方醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院·泌尿疾病研究所，廣州 510630；2深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)院; 3廣州市第一人民醫(yī)院)

目的 探討特發(fā)性膜性腎病(IMN)患者血清中小麥蛋白抗體的水平變化及意義。方法 運(yùn)用液氮研磨丙酮提取法粗提取小麥總蛋白，以此蛋白作為抗原，采用ELISA雙抗體間接法檢測40例IMN患者(IMN組)、34例其他腎小球腎炎患者(其他腎炎組)和40例健康人(對照組)血清中小麥蛋白特異性抗體IgG、IgA和IgE水平，并對患者進(jìn)行食物過敏情況問卷調(diào)查，觀察小麥蛋白特異抗體水平明顯變化患者的臨床特征。結(jié)果 IMN組血清中小麥蛋白特異性IgG水平低于對照組(P<0.01)、其他腎炎組(P<0.05)；其他腎炎組與對照組比較，P﹥0.05；各組血清中小麥蛋白特異性IgA水平比較，P>0.05；各組血清中均未檢測到小麥蛋白特異性IgE。與其他腎炎組比較，IMN組血清肌酐、24 h尿蛋白定量升高，血漿白蛋白降低(P均<0.05)；兩組eGFR比較，P﹥0.05。20例血清中小麥蛋白特異性IgG抗體水平明顯降低(低于中位數(shù))的IMN患者中12例尿蛋白大于5 g/24 h，且血清白蛋白水平<20.0 g/L。結(jié)論 IMN 患者血清中小麥蛋白特異性IgG升高，IgA、IgE無變化，IgG可能與IMN發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。

特發(fā)性膜性腎??；小麥蛋白抗體；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

膜性腎病是一種以腎小球毛細(xì)血管袢上皮側(cè)下大量免疫復(fù)合物沉積，并伴有腎小球基底膜彌漫增厚及足細(xì)胞足突廣泛融合為特征的病理診斷[1]。根據(jù)其病因分為特發(fā)性、繼發(fā)性及家族性三大類，而原因未明的特發(fā)性膜性腎病(IMN)約占2/3[2],其是導(dǎo)致成人出現(xiàn)腎病綜合征最常見原因[3，4]。隨著病情緩慢進(jìn)展，IMN患者中有30%～50%可在20年內(nèi)進(jìn)展為終末期腎臟病。然而，IMN的確切病因及致病機(jī)制仍不明確。2011年Debiec等[5]研究發(fā)現(xiàn)，陽離子牛血清白蛋白(BSA)可能是兒童，特別是小于5歲的IMN患兒的主要致病靶抗原之一，而牛奶是獲得這一致病抗原的主要途徑，這提示食物抗原可能導(dǎo)致或參與IMN的發(fā)病。目前在國內(nèi)尚未見食物抗原與IMN發(fā)病關(guān)系的報(bào)道,我們率先研究了國內(nèi)IMN患者與食物小麥的關(guān)系，檢測和比較了IMN患者、其他腎臟疾病患者及健康人血清中小麥粗提蛋白特異性抗體IgG、IgA和IgE水平，旨在初步探討小麥在IMN發(fā)病中可能存在的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2013年6月～2015年11月于南方醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院經(jīng)腎活檢病理診斷為IMN的患者40例(IMN組)，男21例、女19例，年齡(47.65±13.46)歲；經(jīng)腎活檢病理診斷為其他腎小球腎炎患者34例(其他腎炎組)，包括IgA腎病患者15例、系膜增生性腎小球腎炎患者7例、局灶性節(jié)段性腎小球硬化患者3例、微小病變腎病患者3例、狼瘡膜性腎病患者3例，血管炎性腎病患者、乙肝相關(guān)性系膜增生性腎小球腎炎患者、糖尿病腎病患者各1例，該組中男15例、女19例，年齡(35.85±12.09)歲。選取40例健康體檢結(jié)果無異常發(fā)現(xiàn)的健康體檢者(對照組)，其中男22例、女18例，年齡(38.65±10.61)歲。IMN患者除外過敏性紫癜、乙肝病毒相關(guān)性腎炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、腫瘤等繼發(fā)性病因者。對照組均無腎病及其他疾病個(gè)人史和家族史，尿常規(guī)、腎功能及其他健康體檢實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果均正常。IMN組年齡高于其他腎炎組及對照組，性別差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 臨床資料收集 收集血肌酐、血清白蛋白、24 h尿蛋白，采用腎臟病膳食改良試驗(yàn)簡化公式計(jì)算GFR估算值(eGFR)，MDRD簡化公式：eGFR=[175× (Scr)-1.234×(年齡)-0.179×(男性,×0.79)]。并對所有入組者進(jìn)行食物過敏情況問卷調(diào)查。

1.3 小麥蛋白粗提取 將小麥放入液氮中研磨成粉末后，轉(zhuǎn)移燒杯中加4 ℃預(yù)冷的丙酮浸泡(按1體積粉末加4體積丙酮比例)，放入冰水中冰浴，放4 ℃冰箱。期間每隔2小時(shí)更換新的丙酮，直至丙酮澄清，放置4 ℃冰箱1 d。倒去上層丙酮，將沉淀在燒杯底部的蛋白倒在保鮮膜上或者錫紙上鋪開，放在通風(fēng)廚吹干。吹干后，將粉末收集到燒杯中，加入PBS磁鐵攪拌子攪拌溶解，4 ℃冰箱中，攪拌過夜，或用分散儀破碎。溶解完后冷凍離心機(jī)上10 000 r/min離心15 min，取上清繼續(xù)離心，共3次。上清液在冰上用0.45 μm分子篩注射過濾，收集過濾液，即為蛋白粗提液。用BCA試劑盒測蛋白濃度，按照試劑盒標(biāo)準(zhǔn)步驟進(jìn)行。剩余蛋白粗提液凍存于-80 ℃冰箱待用。根據(jù)測得濃度上樣50 μg，進(jìn)行SDS-PAGE電泳(按標(biāo)準(zhǔn)步驟進(jìn)行)。

1.4 各組血清中小麥蛋白特異性抗體IgG、IgA、IgE的檢測 IMN組和其他腎炎組留取腎活檢當(dāng)日清晨空腹靜脈血，對照組留取清晨空腹靜脈血，標(biāo)本均采5 mL，置于促凝劑試管中，立即用離心機(jī)離心15 min，轉(zhuǎn)速為4 000 r/min,分離留取上層血清,凍存于-80 ℃冰箱待檢。采用ELISA雙抗體間接法檢測：將小麥粗提蛋白用CBS稀釋至1 μg/mL，向96孔板中每孔加入稀釋后的小麥蛋白液100 μL，置4 ℃冰箱過夜后取出；每孔中加入用PBS稀釋成5%濃度的BSA液200 μL，置37 ℃恒溫箱中2 h后取出，每孔加入PBST 300 μL，置于自動(dòng)洗板儀上振蕩清洗，2 min/次，共2次；拍干96孔板，向孔中加入用PBST稀釋的血清(血清∶PBST體積比為1∶30)，100 μL/孔，置37 ℃恒溫箱中1 h后取出，每孔加入PBST 300 μL置于自動(dòng)洗板儀上振蕩清洗，2 min/次，共5次；拍干96孔板，向孔中加入用PBST稀釋的IgG(IgG∶PBST體積比為1∶8 000)或IgA(IgA∶PBST體積比為1∶6 000)或IgE(IgE∶PBST體積比為1∶400)，100 μL/孔，置37 ℃恒溫箱中1 h后取出，每孔加入PBST 300 μL置于自動(dòng)洗板儀上振蕩清洗，2 min/次，共6次。拍干96孔板，每孔中加入現(xiàn)配A+B混合液(A∶B體積比為1∶1) 100 μL，置室溫中待96孔板顯色后，立即向孔中加入終止液2 mol/L H2SO450 μL，并立即置于酶標(biāo)儀中檢測。TWB吸收波長450 nm處讀值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。連續(xù)性計(jì)量資料用中位數(shù)與四分位數(shù)間距表示，兩組間比較用Mann-WhitneyU非參數(shù)檢驗(yàn)，多組間比較采用Kruskal-WalisH非參數(shù)檢驗(yàn)，組間多重比較用Dunn′st檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料用頻次或百分比表示，比較采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 粗提取的小麥蛋白 提取到小麥蛋白，經(jīng)BCA試劑盒測得濃度為5.063 mg/mL，并經(jīng)SDS-PAGE電泳驗(yàn)證。

2.2 食物過敏情況調(diào)查結(jié)果 參與本研究的所有IMN患者否認(rèn)進(jìn)食某些食物后出現(xiàn)嘴唇或面部腫脹、全身風(fēng)團(tuán)、瘙癢、蕁麻疹、腹痛、腹瀉、惡心、嘔吐、發(fā)熱、氣管收縮或抽搐等。所有IMN患者無明確的食物過敏史。

2.3 IMN組與其他腎炎組臨床指標(biāo)比較 IMN組血清肌酐、血漿白蛋白、24 h尿蛋白定量、eGFR分別為109.5(84.50～173.75)μmol/L、21.29(19.40～23.65)g/L、4.36(3.84～5.48)g、67.69(36.85～92.57)mL/(min·1.73 m2)，其他腎炎組分別為83(61.00～118.00)μmol/L、37.00(31.30～42.20)g/L、0.46(0.31～2.89)g、90.31(67.08～133.05)mL/(min·1.73 m2)。IMN組與其他腎炎組血清肌酐、血漿白蛋白、24 h尿蛋白定量比較，P均<0.05；兩組eGFR比較，P﹥0.05。另外，我們觀察了血清中小麥蛋白特異性IgG抗體水平明顯降低(低于中位數(shù))的20例IMN患者的臨床資料，發(fā)現(xiàn)其中12例尿蛋白大于5 g/24 h，且血清白蛋白水平<20.0 g/L。

2.4 各組血清中小麥蛋白特異性抗體IgG、IgA、IgE水平比較 各組血清中小麥蛋白特異性IgG水平對應(yīng)OD值中位數(shù)由高到低分別為：對照組1.020 0、其他腎炎組0.741 4、IMN組0.543 9；IMN組低于對照組(P<0.01)、其他腎炎組(P<0.05)；其他腎炎組與對照組比較，P﹥0.05。各組血清中小麥蛋白特異性抗體IgA水平對應(yīng)OD值中位數(shù)由高到低分別為：IMN組0.500 3、其他腎炎組0.429 8、對照組0.376 5；三組比較，P>0.05。各組血清中均未檢測到小麥蛋白特異性IgE。

3 討論

本研究是國內(nèi)首次研究食物小麥與IMN關(guān)系的研究。我們通過檢測和比較多組腎臟病患者血清以及健康人血清中小麥蛋白特異性抗體IgG、IgA、IgE水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IMN患者血清中小麥蛋白特異性抗體IgG水平低于其他腎炎組及對照組；而血清中小麥蛋白特異性抗體IgA水平在各組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在各組血清中均未檢測到小麥蛋白特異性抗體IgE。提示小麥特別是小麥蛋白特異性抗體IgG可能參與IMN的發(fā)病過程或者疾病進(jìn)程。

早在20世紀(jì)80年代末，就有關(guān)于飲食與IMN關(guān)系的研究。Kawaguchi等[6]在被動(dòng)IMN模型大鼠中發(fā)現(xiàn)，高蛋白飲食會(huì)引起嚴(yán)重的蛋白尿和腎小球硬化腎小管損傷，在給予低蛋白飲食一段時(shí)間后，大鼠的蛋白尿完全消失，提示日常飲食對IMN臨床發(fā)展具有一定影響。另有學(xué)者在研究黏膜免疫與原發(fā)腎小球腎炎的關(guān)系中發(fā)現(xiàn)，在IMN患者血清中有高水平抗BSA、卵白蛋白、雞溶解酵素、α乳白蛋白等抗食物蛋白的IgA抗體，進(jìn)一步提示食物與IMN有一定關(guān)系。

2014年周朝敏等[7]在研究IgA腎病患者6種食物(花生、牛奶、雞蛋、大豆、蝦、魚)主要抗原特異性抗體水平中發(fā)現(xiàn)了食物抗原特異性IgG水平的升高，與本研究中各組腎病患者小麥蛋白特異性IgG水平低于健康人水平的結(jié)果相反，這可能與其檢測的是食物中特異抗原對應(yīng)的特異性抗體，而我們檢測的是小麥粗提總抗原蛋白特異性抗體有關(guān)；同時(shí)也可能與我們選入的各類腎病患者在納入研究時(shí)病情較重、病程較長有關(guān)；另外，也可能是血清中小麥蛋白特異性抗體IgG經(jīng)過血液循環(huán)沉積于腎小球上，降低了血清中IgG水平。本研究結(jié)果顯示，三組小麥蛋白特異性抗體IgA水平雖然在數(shù)據(jù)上有差異，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與Rostoker等[8]研究結(jié)果相似，可能與本研究中使用的小麥抗原蛋白是粗提總蛋白有關(guān)。

本研究中根據(jù)1999 年國際食品法典委員會(huì)第23次會(huì)議公布的常見致敏食物清單，選擇了小麥這種常見致敏食物作為研究對象。小麥蛋白具有較強(qiáng)致敏性或抗原性?？贵wIgE介導(dǎo)速發(fā)型過敏反應(yīng)，過敏患者體內(nèi)會(huì)出現(xiàn)高水平特異性IgE，一般過敏癥狀突出與接觸過敏物質(zhì)有關(guān)，正常情況下抗體IgE在人體血清中含量極低。本研究中的所有對象經(jīng)過問卷調(diào)查，均承認(rèn)日常飲食中有接觸小麥面粉類食物，但均否認(rèn)小麥類食物過敏史及在接觸該食物后出現(xiàn)可疑過敏癥狀，比如唇部或面部腫脹、皮膚瘙癢、腹瀉、嘔吐、發(fā)熱、氣管收縮或抽搐。本研究中入選者血清中均檢測不到抗小麥蛋白特異性IgE，與調(diào)查相一致。

Jacobs等[9]在研究中發(fā)現(xiàn)花生經(jīng)過消化吸收后仍有完整的花生過敏原被血小板運(yùn)輸?shù)襟w內(nèi)，引起過敏反應(yīng)，提示食物通過消化吸收后可以導(dǎo)致疾病發(fā)生。小麥含有豐富的凝集素，凝集素不會(huì)被烹飪或者消化作用破壞。凝集素作為碳水化合物結(jié)合蛋白，能選擇性及特異性地與細(xì)胞表面的糖蛋白或糖脂上的碳水化合物基團(tuán)結(jié)合，而PLA2R是表達(dá)于正常腎小球足細(xì)胞上的糖蛋白重要組成部分。小麥很可能以凝集素的方式識(shí)別并結(jié)合了腎小球上PLA2R，導(dǎo)致IgG-小麥抗原蛋白復(fù)合物在腎小球的沉積。另外，有研究表明腎小球疾病患者的腸道通透性明顯增加，而腸道通透性增加可促進(jìn)腸道多種抗原進(jìn)入血液循環(huán)，因而也更容易使含多種食物抗原的循環(huán)免疫復(fù)合物沉積到腎小球。腸道免疫主要為IgA介導(dǎo)的黏膜免疫，而我們研究中各腎病患者血清中小麥蛋白特異抗體IgA水平均較健康人升高，雖然各組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，仍表明IMN患者黏膜免疫活躍、腸道通透性增加。同時(shí)，我們觀察了血清中小麥蛋白特異性抗體IgG水平明顯降低，且IMN患者中大部分尿蛋白增多、血清白蛋白低。提示小麥可能在IMN的疾病進(jìn)程中有重要作用。

總之，本研究從血清學(xué)水平研究食物小麥與IMN的關(guān)系，提示小麥在IMN致病或進(jìn)程中可能起一定作用，并初步探討小麥參與IMN發(fā)病機(jī)制和發(fā)病進(jìn)程的可能性。為進(jìn)一步研究IMN的發(fā)病機(jī)制指出了一個(gè)新的方向，也為以后探索食物與IMN發(fā)病關(guān)系的研究奠定了一定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

[1] Wasserstein AG. Membranous glomerulonephritis[J]. J Am Soc Nephrol, 1997,8(4):664-674.

[2] Kerjaschki D. Pathogenetic concepts of membranous glomerulopathy (MGN)[J]. J Nephrol, 2000,13( Suppl 3):S96-S100.

[3] Ronco P, Debiec H. Membranous nephropathy: a fairy tale for immunopathologists, nephrologists and patients[J]. Mol Immunol, 2015,68(1):57-62.

[4] Zhou FD, Shen HY, Chen M, et al. The renal histopathological spectrum of patients with nephrotic syndrome: an analysis of 1 523 patients in a single Chinese centre[J]. Nephrol Dial Transplant, 2011,26(12):3993-3997.

[5] Debiec H, Lefeu F, Kemper MJ, et al. Early-childhood membranous nephropathy due to cationic bovine serum albumin[J]. N Engl J Med, 2011,364(22):2101-2110.

[6] Kawaguchi H, Yamaguchi Y, Hattori M, et al. Effects of dietary modulations of protein intake on the progression of glomerulosclerosis in unilaterally nephrectomized rats with passive Heymann nephritis[J]. Nephron,1988,50(3):233-246.

[7] 周朝敏，劉志剛，眭維國，等. IgA腎病患者血清6種常見過敏食物特異性抗體的檢測[J]. 南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2014(3):419-422.

[8] Rostoker G, Delprato S, Benmaadi A, et al. Significance of IGA antigliadin antibodies during primary glomerulonephritis with mesangial IGA deposits[J]. Ann Med Interne (Paris), 1989,140(7):571-574.

[9] Jacobs JF, Baumert JL, Brons PP, et al. Anaphylaxis from passive transfer of peanut allergen in a blood product[J]. N Engl J Med, 2011,364(20):1981-1982.

鄒和群(E-mail: hequnzou@hotmail.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.29.028

R692

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1002-266X(2017)29-0084-03

2017-04-26)