余垚穎，劉金丹，郭應(yīng)菊，楊 雪，王明富*

(1.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，四川 成都 610066；2.四川省農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣總站，四川 成都 610041)

SSR標(biāo)記技術(shù)在水稻抗稻瘟病研究中的應(yīng)用

余垚穎1，劉金丹2，郭應(yīng)菊1，楊 雪1，王明富1*

(1.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，四川 成都 610066；2.四川省農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣總站，四川 成都 610041)

稻瘟病是水稻生產(chǎn)上最具毀滅性的世界三大病害之一。微衛(wèi)星 DNA分子標(biāo)記為輔助選育抗稻瘟病水稻新品種和抗性鑒定提供了新的方法和手段。本文闡述SSR對(duì)稻瘟病研究的作用，介紹 SSR的機(jī)理和方法。

稻瘟病；SSR分子標(biāo)記；微衛(wèi)星DNA序列；基因

水稻是我國(guó)最重要的糧食作物，我國(guó)水稻面積約占糧食作物總面積的30 % ，產(chǎn)量占糧食總產(chǎn)的40%，我國(guó)50%以上的人口以稻米為主食。但是，隨著水稻高產(chǎn)栽培措施的推廣，稻瘟病已成為水稻生產(chǎn)的主要障礙，是水稻生產(chǎn)中最嚴(yán)重的病害。水稻稻瘟病的爆發(fā)嚴(yán)重影響我國(guó)的水稻產(chǎn)量，在流行年份重病地區(qū)每年都會(huì)造成水稻減產(chǎn)10%～20%，嚴(yán)重的地區(qū)損失達(dá)40%～50%，局部田塊甚至顆粒無(wú)收[1]。SSR標(biāo)記是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的建立在PCR基礎(chǔ)上的DNA分子標(biāo)記，由于其具有多態(tài)性高、易于檢測(cè)及結(jié)果穩(wěn)定可靠等優(yōu)點(diǎn)，在水稻抗稻瘟病育種方面得到了廣泛的應(yīng)用。本研究對(duì)SSR標(biāo)記的原理和方法及其對(duì)水稻抗稻瘟病研究的作用進(jìn)行了綜述，以期為選育出抗稻瘟病的水稻新品種提供科學(xué)依據(jù)。

1 SSR分子標(biāo)記原理及特點(diǎn)

遺傳標(biāo)記是指可以追蹤染色體的某一節(jié)段、某個(gè)基因或某一特定DNA序列在家系中傳遞軌跡的任何一種遺傳特性。微衛(wèi)星DNA序列[2,3]又稱簡(jiǎn)單重復(fù)序列(simple sequence repeat，SSR)，也是DNA分子標(biāo)記的一種，是一類由幾個(gè)(多為1～5個(gè))堿基組成的基序串聯(lián)重復(fù)而成的DNA串聯(lián)重復(fù)序列，其長(zhǎng)度一般較短，大約在300bp以內(nèi)，且廣泛布于基因組的不同位置，如(CA)n，(AT)n，(GG C)n等重復(fù)。目前微衛(wèi)星已經(jīng)廣泛應(yīng)用于植物圖譜構(gòu)建、基因定位、物種進(jìn)化與分類、品種遺傳多樣性、品種保護(hù)、親子分析與純度鑒定、雜種優(yōu)勢(shì)機(jī)理及預(yù)測(cè)、分子標(biāo)記輔助育種等研究領(lǐng)域[4，5]?？偟膩?lái)說(shuō)，SSR標(biāo)記之所以為當(dāng)前研究者青睞，主要在于它具備以下特點(diǎn)及優(yōu)點(diǎn)[6，7]：①數(shù)量豐富，覆蓋整個(gè)基因組。對(duì)水稻基因組文庫(kù)的研究表明，水稻基因組中估計(jì)有5700～10000個(gè)微衛(wèi)星[8]。②多態(tài)性高，等位位點(diǎn)多，信息含量豐富。③通常為共顯性遺傳，可以很好的解決雜合體帶來(lái)的假陽(yáng)性問(wèn)題。④試驗(yàn)操作簡(jiǎn)單，對(duì)DNA數(shù)量和質(zhì)量要求不高。⑤重復(fù)性、穩(wěn)定性較好，微衛(wèi)星位點(diǎn)的突變率小于10-4，在多態(tài)性與穩(wěn)定性間有了一個(gè)很好的平衡。

近年來(lái)SSR標(biāo)記已經(jīng)成為植物遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位、物種進(jìn)化與分類、品種遺傳多樣性、品種保護(hù)、親子分析與純度鑒定、雜種優(yōu)勢(shì)機(jī)理及預(yù)測(cè)、分子標(biāo)記輔助育種等研究領(lǐng)域中重要的分子標(biāo)記[9，10]。目前，在大麥[11]、水稻[12]、玉米[13]、擬南芥[14]等植物中有較多應(yīng)用。但是在病原菌中，尤其在稻瘟病菌中，SSR引物的開(kāi)發(fā)相對(duì)較晚，有關(guān)SSR應(yīng)用的報(bào)道也較少。

2 分子標(biāo)記在水稻抗稻瘟病研究中的應(yīng)用

2.1 抗稻瘟病基因SSR標(biāo)記的方法

尋找與抗稻瘟病基因緊密連鎖的SSR標(biāo)記主要有2種方法：分離群體分組分析法(Bulked Segregant Analysis , BSA)和利用近等基因系分析法(Near-isogenic Lines)。目前，已鑒定出40多個(gè)稻瘟病抗性主效基因位點(diǎn)[15,16]，并分別被定位到水稻除第3條染色體外的11條染色體上，而以SSR標(biāo)記為基礎(chǔ)的水稻遺傳連鎖圖基本上已經(jīng)覆蓋了水稻基因組的所有區(qū)域。因此，利用SSR標(biāo)記篩選和定位抗稻瘟病基因，具有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。福建農(nóng)林大學(xué)作物科學(xué)學(xué)院的陳志偉等[17]在廣譜的抗稻瘟病基因Pi-2(t)的附近篩選到了1個(gè)新的SSR標(biāo)記SRM24，并利用該標(biāo)記成功地將Pi-2(t)從供體材料“5173”導(dǎo)入到迄今為止廣泛使用的雄性不育保持系“珍汕97B”中，獲得了Pi-2(t)的“珍汕97B”近等基因系。

2.2 分子標(biāo)記在抗稻瘟病研究中的作用

稻瘟病是植物-病原物相互作用的模式系統(tǒng)，其抗病性不單與水稻品種本身的基因型有關(guān)，亦與病原菌的基因型相關(guān)。稻瘟病菌的易變性和群體結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性是水稻品種稻瘟病抗性易喪失的根本原因之一，因此全面準(zhǔn)確地掌握育種地區(qū)稻瘟病病原菌的結(jié)構(gòu)及其演化變異規(guī)律，是開(kāi)展水稻稻瘟病持久抗性育種必不可少的工作內(nèi)容。已有的初步研究結(jié)果表明，病原真菌中的SSR一般都有2～5個(gè)等位位點(diǎn)，不但可用于種群遺傳多樣性、近緣種的比較及系譜研究[17]，而且還可用于不同寄主分離物之間的比較[18]，或是菌株、小種之間的比較[19]。因此，利用稻瘟病菌基因組中數(shù)量豐富、分布廣泛的SSR標(biāo)記，能夠?yàn)槿后w研究提供大量遺傳信息。

水稻品種的抗病性之所以容易喪失，關(guān)鍵在于品種或抗源的單一化。通過(guò)聚合雜交，累積多個(gè)抗病基因于同一材料，培育出多抗品種，是避免或減緩水稻品種抗性喪失的一種有效途徑。SSR標(biāo)記對(duì)抗稻瘟病研究起到十分重要的作用，為抗病基因的聚合提供了一種有效的工具。陳志偉等[19]利用與抗病基因緊密連鎖的序標(biāo)位STS及SSR標(biāo)記OSR20、OSR32、RM213、RM207、RM262，跟蹤篩選了抗稻瘟病基因，將Pi-d(t)1、Pi-b、Pi-ta2聚合于G46中，在相對(duì)較短的時(shí)間內(nèi)，培育出了抗多個(gè)生理小種的相對(duì)持久的抗病品系，對(duì)利用分子標(biāo)記進(jìn)行多個(gè)抗病基因的輔助選擇提供了有實(shí)用價(jià)值的實(shí)證。

3 展望

分子生物學(xué)的發(fā)展，大大推進(jìn)了水稻抗瘟性遺傳研究的進(jìn)程。迄今已定位出了50多個(gè)主效抗瘟基因和一批抗性QTL位點(diǎn)，開(kāi)發(fā)出大量與抗性基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，利用稻瘟病菌基因組中數(shù)量豐富、分布廣泛的SSR標(biāo)記，能夠?yàn)槿后w研究提供大量遺傳信息。歷來(lái)稻瘟病病菌的變異機(jī)制、品種抗性“喪失”機(jī)理和品種抗性持久化問(wèn)題一直是困繞抗瘟育種工作者的3大難題。水稻品種的抗病性之所以容易喪失，關(guān)鍵在于品種或抗源的單一化。通過(guò)聚合雜交，累積多個(gè)抗病基因于同一材料，培育出多抗品種，是避免或減緩水稻品種抗性喪失的一種有效途徑。SSR標(biāo)記對(duì)抗稻瘟病研究起到十分重要的作用，為抗病基因的聚合提供了一種有效的工具。隨著人們對(duì)SSR標(biāo)記技術(shù)的不斷完善，將會(huì)篩選出更多的與抗稻瘟病基因緊密連鎖的SSR標(biāo)記。新的抗性基因標(biāo)記的出現(xiàn)，可為水稻抗稻瘟病遺傳育種工作提供更有利的輔助工具，將大大加快抗稻瘟病水稻品種輔助選育的進(jìn)程。

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2017-02-27

四川省科技支撐(2014NZ0097)

余垚穎(1985-)，女，四川米易人，助理研究員，碩士，主要從事植物病害與營(yíng)養(yǎng)研究。E-mail：kellyyyzsj@163.com。*為通訊作者。