陳小敏,陳 勇,吳海冰,辜運富

(1.四川農業(yè)大學資源學院，成都 溫江 611130)

四川12株野生靈芝遺傳多樣性的ISSR分析

陳小敏,陳 勇,吳海冰,辜運富*

(1.四川農業(yè)大學資源學院，成都 溫江 611130)

目前靈芝生產菌種品性退化，故野生靈芝資源的篩選評價對于選育優(yōu)質新品種具有重要意義。本研究從四川采集12株野生靈芝，采用苯酚-硫酸法、香草醛-高氯酸顯色法測定了子實體多糖和總三萜含量，并進一步采用ISSR(inter-simple sequence repeat)和ITS(internal transcribed spacer)分子技術分析它們的遺傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)育特征。表明：SICAU-12子實體多糖含量、SICAU-5子實體總三萜含量明顯高于其它菌株子實體。ISSR聚類分析顯示出供試菌株的總體相似性為0.52，相似系數(shù)為0.54時聚為兩大類群；系統(tǒng)發(fā)育樹將供試野生靈芝分為赤芝(Ganoderma Lucidum)和紫芝(Ganoderma Sinense)兩大類群。四川收集的野生靈芝菌株具有較為明顯的遺傳多樣性；SICAU-12多糖含量高、SICAU-5總三萜含量高，具有潛在應用價值。

四川野生靈芝；多糖；總三萜；遺傳多樣性

靈芝隸屬于真菌界(Kingdom Fungi)，擔子菌門(Basidiomycota)，擔子菌綱(Basidiomycetes)，靈芝目(Ganodermatales)，靈芝科(Ganodermataceae)，有“仙草”、“瑞草”等稱呼，主要活性成分為多糖、三萜化合物等，具有抗癌、抗腫瘤、保肝解毒等方面的作用[1-3]。目前，人工栽培靈芝規(guī)模逐漸擴大，生產栽培方式呈多樣化，但是栽培效益每況愈下。由于長期引種和環(huán)境因素的影響，導致靈芝菌種品性退化、名稱混雜[4]。菌種是靈芝產量低下、品質難于控制的關鍵問題[5]，靈芝產業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展依賴于優(yōu)質靈芝新品種的選育。野生靈芝作為雜交育種的基礎材料，挖掘野生資源并對其進行基礎研究具有十分重要的意義。野生靈芝的形態(tài)特征易受到野外環(huán)境的脅迫，形成了多樣化的表型特征，僅靠形態(tài)學特征難以真正鑒定靈芝菌種[6-7]，所以科學準確地鑒定野生靈芝菌株的遺傳特性顯得尤為重要。隨著分子生物學的不斷發(fā)展，人們開始從分子遺傳水平上認識物種的遺傳特性，目前ITS和ISSR這兩種分子技術已廣泛用于探討真菌種內變異和屬內種間的親緣關系。真核生物rDNA的ITS區(qū)段保守性強且具有特異性[8-10]，張肖雅[11]等人采用ITS分子技術對11株靈芝菌株進行了鑒定分析。ISSR[12]分子標記技術穩(wěn)定、簡便、多態(tài)性豐富，在研究菌株遺傳多樣性上具有優(yōu)越性，被廣泛用于大型食用真菌的遺傳多樣性研究[13]。四川氣候類型多變，擁有豐富的林木資源，靈芝資源豐富。本文利用ISSR分子標記、ITS測序技術對12株四川野生靈芝進行遺傳多樣性分析，并結合子實體多糖和總三萜含量等指標來綜合評價收集到的野生靈芝的多樣性及應用價值，以期為豐富靈芝資源庫，選育高活性成分的優(yōu)質靈芝新品種及科學管理靈芝菌種提供基礎理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試野生菌株12株，采自四川攀枝花市、峨眉山市、樂山市等地(見表1)。

1.2 靈芝子實體多糖測定

標準曲線的制備[14]：無水葡萄糖60℃烘干至恒重，精確稱取0.10g，加水定容至100mL。分別吸取0、20、60、100、160、200、300μL葡萄糖標準溶液，水補足至2mL，各加入1mL5%的苯酚溶液和5mL濃硫酸，室溫下反應30min，490nm處比色測定其吸光度。將采集到的成熟子實體60℃烘干至恒重，粉碎過60目篩。精確稱取0.50g，加50mL超純水，沸水回流2h后過濾。取濾液加入無水乙醇至終濃度為75%，低溫醇沉過夜，Sevage試劑(氯仿/正丁醇5∶1)去蛋白。吸取上清液，各加入1mL 5%的苯酚溶液和5mL濃硫酸，室溫下反應30min，490nm處測定吸光度。

表1 供試菌株

1.3 靈芝子實體總三萜測定

標準曲線的制備[14]：準確稱取10mg齊墩果酸標準品，氯仿溶解定容至100mL。分別吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL標準溶液，100℃水浴蒸干溶劑，加0.3mL5%香草醛-冰醋酸，1.4mLHClO4，混勻，60℃水浴20min，冰水浴冷卻，加5mL冰醋酸，混勻后548nm處測吸光度。精密稱取子實體樣品2g于100mL容量瓶中，加入氯仿超聲30min后過濾。吸取濾液1mL，100℃水浴蒸干溶劑，加0.3mL5%香草醛-冰醋酸，1.4mLHClO4，混勻，60℃水浴20min，冰水浴冷卻，加5mL冰醋酸，混勻后548nm處測吸光度。

1.4 菌種分離

用75%乙醇對野生靈芝表面進行消毒，無菌環(huán)境下取黃豆大小菌肉于PDA斜面培養(yǎng)基中，25℃避光培養(yǎng)5～8d，菌種純化后即得野生靈芝菌株。

1.5 DNA的提取及ISSR擴增

挑取斜面培養(yǎng)基表面生長旺盛的菌絲，液氮研磨，按照Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒(上海生工Sangon Biotech)給定的步驟進行操作，提取出的DNA于-20℃保存?zhèn)溆?。在前期的試驗中，選用引物P1-P49進行ISSR擴增，結果表明引物P8(5'-GGAGGAGGAGGAGGA-3')擴增效果最佳，譜帶穩(wěn)定、清晰、多態(tài)性豐富。反應體系為20μL：2×Taq PCR Master Mix 10μL (TIANGEN)、DNA模板1μL(10ng.μL-1)、引物P8 2μL(10μmol.L-1)，ddH2O補齊至20μL。擴增程序：94℃預變性2min；94℃變性1min，52℃復性1min，65℃延伸8min，30個循環(huán)；65℃最終延伸16min；4℃終止反應。取PCR產物8μL在含EB的2%瓊脂糖凝膠上水平電泳檢測，80V/cm電泳90min，以DNA MarkerDL2000作為分子量標準，自動凝膠成像系統(tǒng)拍照檢測。根據(jù)ISSR擴增出的譜帶圖，將同一位置條帶出現(xiàn)與否記為1、0，構建數(shù)字化矩陣，用軟件NTSYSpc2.1進行遺傳聚類分析[15]。

1.6 ITS測序

用通用引物ITS1和ITS4對12個靈芝菌株ITS序列進行擴增[16]。反應體系為50μL：2×Taq PCR Master Mix25μL(TIANGEN)、引物ITS1/ITS4各0.5μL(10μmol.L-1)、DNA模板1μL(10ng.μL-1)，加ddH2O補齊至50μL。擴增程序：94℃預變性5min；94℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，32個循環(huán)；72℃最終延伸1min；10℃終止反應。取PCR產物3μL在含EB的1%瓊脂糖凝膠上水平電泳檢測，120V/cm電泳20min，以DNA MarkerDL2000作為分子量標準，自動凝膠成像系統(tǒng)拍照檢測。將其產物交由擎科生物技術有限公司(成都)完成測序，向NCBI提交供試菌株的ITS序列，獲得序列號：KX262896-KX262907。

1.7 數(shù)據(jù)處理

用Excel 2003進行數(shù)據(jù)基礎處理，數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析由SPSS 20完成。利用NTSYSpc2.1構建基于ISSR分析的聚類圖譜，利用MEGA5的Neighbor-Joining tree程序構建基于ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結果與分析

2.1 靈芝子實體多糖和總三萜含量

供試靈芝子實體多糖和總三萜含量如表2所示。由表2可知，SICAU-12子實體的多糖含量顯著高于其他靈芝菌株子實體，為1.37%，SICAU-8子實體多糖含量最低，為0.72%，SICAU-7、SICAU-12兩個菌株的子實體多糖含量顯著高于其它菌株。由表2可以看出，不同靈芝子實體總三萜含量有著明顯的差異，SICAU-5含量最高，為1.37%，SICAU-4的含量最低，僅為0.43%。

表2 不同靈芝菌株子實體多糖、總三萜含量

注：小寫字母a-i表示95%置信度的顯著性差異

2.2 ISSR聚類分析

ISSR-PCR擴增出的條帶大小在2000bp～100bp之間，聚類圖譜如圖1所示。由圖1可知，供試的12個靈芝菌株總體相似性為0.52，具有明顯的遺傳多樣性。遺傳相似系數(shù)小于0.52時，所有的菌株都聚為一類；在0.54的相似系數(shù)水平上，供試菌株聚為2大類群，SICAU-1、SICAU-4、SICAU-5、SICAU-6、SICAU-7和SICAU-10 等6個菌株聚為一類，其余6個菌株聚為一類。SICAU-1和SICAU-10的遺傳相似系數(shù)高達0.96，兩者的遺傳關系最近；SICAU-6和SICAU-9的遺傳關系最遠。

圖1 供試靈芝菌株的ISSR聚類分析

2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹

將測序得到的12個靈芝菌株ITS序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中比對，選擇匹配度最高的參比菌株(如圖2所示)，對12個供試菌株和6個GenBank參比序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

圖2 供試菌株系統(tǒng)發(fā)育樹，加粗為供試菌株

由圖2可知，與供試靈芝菌株相似性高的為Ganoderma Lucidum(赤芝)和Ganoderma Sinense(紫芝)。供試12個野生靈芝菌株在系統(tǒng)發(fā)育樹主要分為兩個大支，菌株SICAU-1、SICAU-2、SICAU-3、SICAU-6、SICAU-10、SICAU-11、SICAU-12與赤芝(Ganoderma lucidum，GU213476、GU213478、EF188277)聚在一個大群中。菌株SICAU-4、SICAU-5、SICAU-7、SICAU-8和SICAU-9等5個菌株與紫芝(Ganoderma sinense，HQ235633、DQ424982、DQ425014)聚在第二個群中。

3 討論

本試驗測定了四川不同地區(qū)采集的12株野生靈芝子實體多糖和總三萜含量，靈芝多糖和三萜類化合物是靈芝主要的活性物質，起著關鍵藥效作用[17-18]。供試靈芝菌株子實體多糖含量在0.72%～1.37%范圍之間，總三萜含量在0.43%～1.37%之間，采集的四川地區(qū)野生靈芝子實體的多糖和總三萜含量有著明顯的差異性，SICAU-12子實體多糖含量、SICAU-5總三萜含量最高。付立忠等人分析與評價12 個靈芝品種的子實體多糖和三萜含量，多糖含量為0.75%～1.16%，三萜含量為0.41%～1.19%[14]。對比前人研究結果，菌株SICAU～7、SICAU-12子實體多糖含量及SICAU-5三萜含量更高，說明這3株野生靈芝在藥效方面上更具潛在的應用價值。

靈芝的生長易受到野外環(huán)境的影響，造成靈芝形態(tài)特征的多樣性，因此傳統(tǒng)的形態(tài)學分類法不能有效區(qū)分野生靈芝菌株。分子生物學的發(fā)展，推動了分子標記法在菌株鑒定上的應用。ISSR分子標記技術自1994年由Ziekiewicz提出以來，廣泛用于食用菌遺傳多樣性[19-20]和菌株的鑒定鑒別[21-22]。不同的靈芝菌株的DNA序列存在差異，在ISSR-PCR擴增時DNA序列與引物結合，不同菌株就會出現(xiàn)獨特的ISSR條帶，因此，ISSR分子標記技術能反應出供試菌株間的遺傳多樣性。在本試驗中，供試野生靈芝菌株的ISSR電泳圖譜具有明顯的差異性，聚類分析顯示出相似系數(shù)小于0.52時，供試菌株聚為一類，相似系數(shù)為0.54時，聚類兩大類群，說明供試12株靈芝菌株間表現(xiàn)出明顯的遺傳多樣性。

近年來，研究人員采用DNA序列分析研究微生物的系統(tǒng)發(fā)育學，食用菌的DNA序列研究集中在rDNA上，基于ITS序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹是目前研究食用菌種間、種內水平差異的主要分子手段[23-24]。本研究中基于ITS序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹將供試菌株分為赤芝和紫芝兩大類群，這與相似系數(shù)為0.54的ISSR聚類分析結果相似。SICAU-1、SICAU-2、SICAU-3、SICAU-6、SICAU-10、SICAU-11和SICAU-12與赤芝聚在一個大群中；SICAU-4、SICAU-5、SICAU-7、SICAU-8和SICAU-9與紫芝聚在另一個大群中。

綜上所述，本研究運用ISSR分子標記和ITS測序對四川不同地區(qū)收集到的12株野生靈芝菌株進行遺傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)育分析，同時測定了這些野生資源的多糖和三萜化合物含量。結果表明，供試四川野生靈芝菌株具有明顯的遺傳多樣性；SICAU-12多糖含量、SICAU-5總三萜含量高，且二者的遺傳關系遠，可作為潛在高活性物質的靈芝新品種雜交親本。

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2017-03-18

四川省“十三五”育種攻關項目資助(2016NYZ0040)

陳小敏(1992- )，女，四川什邡人，碩士研究生，研究方向為食用菌品種選育。*為通訊作者。