劉佳/遼寧省大連市畜牧總站

ELISpot檢測技術操作要求及質量控制

劉佳/遼寧省大連市畜牧總站

酶聯(lián)免疫斑點檢測技術( enzyme-link immunospot assay，ELISpot) 是近年來發(fā)展起來的檢測細胞因子免疫學檢測技術，是在酶聯(lián)免疫吸附技術(ELISA)基礎上與細胞培養(yǎng)技術充分結合而建立起來的一種可以在體外檢測單細胞水平培養(yǎng)的特異性抗體分泌細胞的新型檢測技術，此技術可以快捷、簡便的對細胞因子分泌量進行定量，目前已經成為國際公認的抗原特異性T細胞免疫學研究的主流技術。由此可以預見，該檢測方法在動物免疫研究領域將會得到廣泛應用，發(fā)揮其重要作用。但是，此項技術尚未形成標準化，對細胞含量、細胞濃度、孵育、顯色時間等優(yōu)化條件還沒有形成完整體系。因此，在檢測工作實踐中，總結實驗操作步驟注意事項，提高檢測水平，對提高ELISpot技術檢測的準確性以及對各個因素進行優(yōu)化，建立穩(wěn)定的檢測體系具有重要意義。

一、細胞質量控制

1.采血。選取45～50日齡，沒有疫苗接種經歷的仔豬，從前腔靜脈采集外周靜脈血，保證無菌操作，抗凝劑抗凝。采血后輕搖，使血液與抗凝劑充分混勻，避免出現(xiàn)血凝塊，影響分離效果。震蕩過于劇烈或保存不當，會出現(xiàn)溶血現(xiàn)象。

2.淋巴細胞分離。6 h內進行外周血單個核細胞(PBMC)的分離，時間過長會影響活細胞數(shù)，淋巴細胞的活細胞比例直接影響酶聯(lián)免疫斑點的形成。將稀釋好的細胞懸液沿管壁緩慢加至淋巴細胞分離液液面上，2 000轉/分鐘離心10 min，轉速不宜過高，否則會使細胞壁破裂。離心后，離心管中由上至下細胞分為四層，即血漿或者組織勻漿液層、環(huán)狀乳白色淋巴細胞富集層、透明分離液層、紅細胞層。吸出中間環(huán)狀乳白色PBMC富集層，吸取方法可以將組織勻漿層用吸管去掉，將乳白色淋巴細胞吸出，也可以直接將吸管插入淋巴細胞富集層吸出。吸液要慢、穩(wěn)，避免吸出紅細胞。洗滌后，如果有紅細胞存在，可以使用紅細胞裂解液，將紅細胞去除。

3.計數(shù)。用血球計數(shù)板計數(shù)，注意加細胞懸液時要干凈利落，加量適中，過多容易使蓋玻片漂移或淹過蓋玻片，過少容易出現(xiàn)氣泡。細胞懸液混合不均勻直接影響計數(shù)的準確性。鏡下計數(shù)時，若方格中細胞分布明顯不均，需重新將細胞懸液進行混合，再進行計數(shù)。

4.細胞凍存與復蘇。

細胞凍存：可以選擇對細胞無毒性、溶解度大、容易穿透的保護劑，比如二甲亞砜、甘油等。若不添加保護劑直接凍存，會導致胞內和外環(huán)境中的水形成冰晶，細胞內發(fā)生機械損傷引起細胞死亡。降溫的順序應從室溫→4℃（20 min〕→冰箱冷凍室（30 min）→低溫冰箱（-30℃/1 h）→氣態(tài)氮（30 min）→液氮，使用液氮時避免低溫凍傷。

細胞復蘇：取細胞時要戴防低溫手套、護目鏡，取出細胞將其放入37℃水浴快速搖晃，使細胞完全復蘇，此步驟動作要迅速，使細胞避免經過容易受損的0℃，復蘇后要對細胞重新進行計數(shù)，活細胞數(shù)過低會對檢測結果造成影響。

二、刺激物質量控制

1.特異性刺激物。特異性刺激物通常包括病毒、疫苗毒、T細胞表位多肽等，可以根據檢測目的不同來選擇。在提取疫苗毒可通過反復凍融、超聲波、加化學物質等方法來提取。

2.非特異性刺激物。ELISpot檢測中最常用的是將植物血球血凝素（PHA）或有絲分裂原ConA作為非特異性刺激物，刺激物濃度的選擇尤為重要，濃度過高時，斑點連片不清晰，背景顏色略深；濃度過低時，斑點數(shù)量較少，均達不到對照的效果。通常情況下，PHA的斑點數(shù)100左右為佳。

三、操作質量控制

1.加樣。使用移液器時，保證垂直、懸空加樣，速度要慢，避免液體濺出，排液時速度要快，注意管壁不要殘留液體或者由于排液過慢導致回吸而產生氣泡，使用排槍時，注意液面要齊。加液時不能用力觸碰板低，操作不當會損壞PVDF膜，影響結果判定。

2.孵育。CO2的濃度、濕度、抗體濃度、作用時間都會造成背景和敏感性差異。ELISpot檢查技術常用的孵育溫度是 37℃，溫度不宜過高，孵育過程中，反應溫度要均勻，使所有的反應樣品盡可能達到平衡，不要將反應板疊加放到CO2培養(yǎng)箱內，受熱不均會導致部分細胞無法得到充分刺激。由于孵育時間較長，為避免液體蒸發(fā)，反應板放入培養(yǎng)箱之前應貼上封板膜或蓋好蓋子，也可放入濕盒，培養(yǎng)期間定期觀察CO2濃度情況。

3.試劑。試劑現(xiàn)用現(xiàn)配，分裝成管，反復凍融會造成試劑（抗體或重組細胞因子）失活，因此，配好的試劑盡量在保質期內使用。試劑的用量要不斷的優(yōu)化，要與細胞的數(shù)量成相應的比例，檢測不同的細胞因子應加入合適的細胞量，因為CK分泌細胞分泌不同細胞因子的量是不同的，如果細胞濃度過大，大量分泌的細胞因子將融合形成斑點，從而造成技術誤差。

4.顯色。對顯色反應溫度和時間的把控，是試驗數(shù)據有效、精準的必要條件，顯色時間過長會導致背景加深，過短會使顯色不完全。讀板時，PDFV膜在濕潤的情況下儀器無法讀取斑點數(shù)，所以在底物洗去后應將板倒置自然控干，避免液體回流到板底。特異性斑點呈邊緣模糊，有暈，形狀圓而規(guī)則。

四、結語

總之，隨著ELISpot技術的不斷發(fā)展，此技術在動物疫病診斷的領域也將更加廣泛深入，近幾年利用ELISpot技術對豬藍耳病、口蹄疫的研究層出不窮，ELISpot技術即將成為基礎實驗室及獸醫(yī)診斷實驗室的標準技術。試劑質量、細胞質量、人員操作、主觀判定等都是影響此項檢測技術結果準確與否的主要因素。正確的實驗方法和操作細節(jié)對ELISpot在獸醫(yī)領域的研究和診斷意義重大。

（略）