林 釗

（福建省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗研究院，福建 福州 350002）

燕窩的分子生物學檢測技術(shù)現(xiàn)狀及其發(fā)展概述

林 釗

（福建省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗研究院，福建 福州 350002）

基因檢測方法以其快速、準確、高效、靈敏的特點在食品的真?zhèn)舞b別中得到廣泛運用。文章對燕窩檢測中的聚合酶鏈式反應(yīng) （polymerase chain reaction，PCR）、實時熒光PCR、分子指紋、基因芯片、基因測序等基因檢測技術(shù)現(xiàn)狀進行了綜述，并對以后的發(fā)展進行了展望，以期為研究者提供一定的理論參考。

燕窩；基因檢測；真?zhèn)舞b別

基因是生物遺傳信息的載體，以脫氧核糖核酸（Deoxyribonucleic acid， DNA）的形式存在于所有組織和細胞中。遺傳信息直接決定了生物體的本質(zhì)，所以，通過基因?qū)ι镂锓N進行鑒別是權(quán)威和科學的方法。隨著生物學的發(fā)展，快速、準確分析基因信息的技術(shù)方法不斷出現(xiàn)，如聚合酶鏈式反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）、實時熒光PCR、分子指紋、基因芯片、基因測序等。由于分子生物學檢測方法具有特異性好、靈敏度高以及方便快捷等優(yōu)勢，因此在真?zhèn)舞b別中也得到了運用。

燕窩作為一種唾液和絨羽的混合物，其唾液中口腔上皮細胞和絨羽的構(gòu)成細胞，可提供相關(guān)的生物信息。燕窩中糖蛋白存在的主要形式是粘蛋白，不易分離，黃秀麗等[1]利用液相等點聚焦電泳，使燕窩水提蛋白質(zhì)以及丙酮沉淀蛋白質(zhì)無雜質(zhì)干擾，滿足電泳分析的需要。同時，黃秀麗課題組研究燕窩中的蛋白質(zhì)樣品制備的方法，發(fā)現(xiàn)80%丙酮作為蛋白沉淀劑不僅能有效去除雜質(zhì)，而且分離效果更佳。林潔茹等[2]將SDS-PAGE應(yīng)用于燕窩中蛋白質(zhì)分離，并應(yīng)用等點聚焦電泳實現(xiàn)燕窩真?zhèn)巫R別。郭麗麗等[3]將雙向電泳技術(shù)用于燕窩中水溶性蛋白的分離和鑒定。研究人員利用不同的方法對燕窩及其制品進行DNA提取，建立了有效快速的DNA提取方法，為生物方法用于燕窩真?zhèn)螠y定的發(fā)展提供依據(jù)。

1 PCR技術(shù)及其在燕窩檢測中的運用

PCR技術(shù)是一種體外核酸擴增技術(shù)，以待擴增的兩條DNA鏈為模板，在1對人工合成的寡核苷酸引物的介導下，通過耐高溫DNA聚合酶的酶促作用，快速特異地擴增出特定的DNA片段。隨著科技的發(fā)展，研究人員將PCR技術(shù)大量改進，由此產(chǎn)生了一系列相關(guān)PCR技術(shù)方法，其中包括原位PCR、巢式PCR、反向PCR、錨定PCR、多重PCR、不對稱PCR、重PCR、標記PCR、免疫PCR等主要用于定性檢測的技術(shù)。1996年，實時熒光PCR技術(shù)的誕生，PCR技術(shù)實現(xiàn)了從定性到定量的飛躍。實時熒光PCR技術(shù)通過在反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號監(jiān)測PCR反應(yīng)過程，然后根據(jù)標準曲線對未知模板進行定量。

何國林等[4]設(shè)計1條具有良好特異性和靈敏度的特異靶向雨燕屬和金絲燕屬細胞色素基因的TaqMan探針，結(jié)合實時熒光PCR技術(shù)對燕窩樣品進行檢測分析；Lin 等[5]建立了以線粒體細胞色素b基因為靶標的燕窩遺傳學分子鑒定方法。通過對11個燕窩樣品中線粒體細胞色素b基因的PCR擴增、測序及序列比對、聚類分析后，發(fā)現(xiàn)該方法能夠?qū)⒀喔C來源區(qū)分開，同時認為該方法具有用于燕窩真?zhèn)舞b定的可能性。實時熒光PCR法以及雙向電泳法作為燕窩測定的行業(yè)標準得到廣泛應(yīng)用，作為分子生物學鑒定方法可以準確地檢測燕窩成分；Wu[6]等將PCR技術(shù)和雙向凝膠電泳技術(shù)應(yīng)用于真?zhèn)伪鎰e中。PCR技術(shù)主要用于評價產(chǎn)品中燕窩成分的存在，靈敏度比較高，可檢測0.5%燕窩含量的銀耳燕窩類加工制品，而雙向凝膠電泳則可確定燕窩蛋白占總蛋白的比例；王鳳云等[7]探究了32種不同品種和產(chǎn)地燕窩的生物基原，對其中的DNA進行提取、擴增和測序后，利用MEGA 6.0軟件進行序列比對，分析變異位點，計算Kimura-2參數(shù)遺傳距離，構(gòu)建鄰接（NJ）系統(tǒng)發(fā)育樹，從而鑒別燕窩的基原。結(jié)果表明，NJ系統(tǒng)發(fā)育樹顯示相同生物基原的燕窩物種將聚為1支，其所建立的實時熒光定量PCR檢測方法具有良好的特異性、靈敏性、重復性和穩(wěn)定性等特點。

2 DNA指紋技術(shù)

DNA指紋技術(shù)建立在DNA分子標記基礎(chǔ)上，以生物個體間核苷酸序列變異為基礎(chǔ)的遺傳標記（分子標記），直接在DNA水平上檢測生物個體的差異，是生物個體在DNA水平上遺傳變異的直接反映。DNA分子指紋技術(shù)種類繁多，包括限制性片段長度多態(tài)性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）、簡單重復序列（Simple Sequence Repeats，SSR）、隨機擴增多態(tài)性（Randomly Amplified Polymorphic DNA，RAPD）、擴增長度多態(tài)性（Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP）、單鏈構(gòu)象多態(tài)性（Singlestrand Conformation Polymorphism，SSCP）、變性高效液相色譜（Denaturing High Performance Liquid Chromatography，DHPLC）等技術(shù)。

DNA 指紋技術(shù)主要具有如下優(yōu)點：1.不受組織類別、發(fā)育階段等影響；2.不受環(huán)境影響；3.標記數(shù)量多，遍及整個基因組；4.多態(tài)性高，自然存在許多等位變異；5.有許多標記表現(xiàn)為共顯性，能鑒別純合基因型和雜合基因型，提供完整的遺傳信息；6.DNA分子標記技術(shù)簡單、快速、易于自動化；7.提取的DNA樣品在適宜條件下可長期保存，這對于進行追溯性或仲裁性鑒定是非常有利的。因此，DNA 指紋技術(shù)可應(yīng)用于動、植以及微生物源性產(chǎn)品的真?zhèn)舞b定、摻假鑒定以及名特優(yōu)產(chǎn)品產(chǎn)地溯源鑒定。

羅志勇等[8]采用AFLP指紋遺傳標記技術(shù)分析了人參、西洋參、引種西洋參基因組多態(tài)性，經(jīng)凝膠電泳檢測，成功構(gòu)建了多態(tài)性廣、重復性好的指紋圖譜，為人參、西洋參等的鑒定提供了依據(jù)；張銘等[9-11]采用RAPD指紋技術(shù)對15種鐵皮石斛、石斛屬的26個種和金石斛屬的1個種及13種石斛屬植物進行鑒定，成功地將鐵皮石斛和金石斛屬等石斛屬植物區(qū)分開，為鑒別市售的偽劣鐵皮石斛提供了有效指紋鑒別圖譜；孫淑霞等[12]利用ISSR標記對28份桃種進行了品種鑒定及親緣關(guān)系檢測，獲得了相關(guān)指紋圖譜，篩選出9條特異DNA片段和11條特異缺失DNA片段，為有效地鑒別桃的品種、桃種質(zhì)資源研究和新品種保護提供理論基礎(chǔ)；楊文毅等[13]利用48個SSR分子標記對來自9個不同國家的90個水稻品種進行了遺傳相似性分析，結(jié)果共檢測到269個等位基因，90個品種在相似系數(shù)0.12 處，分為秈、粳2個亞種類群，在聚類樹形圖上可以有效地追溯到各品種的地理來源。

盡管DNA指紋技術(shù)在生物源性食品中具有很強的優(yōu)勢，然而當前國內(nèi)外未曾見到有采用該技術(shù)對燕窩及其制品的檢測鑒定的研究報道。這可能是因為燕窩及其制品在形成商品前，經(jīng)過了一定程度的加工。而在加工過程中降解了部分DNA，富集到的DNA片段多為小分子量的DNA片段，因此不能建立具有特異性的DNA指紋圖譜。然而，在針對燕窩的摻假檢驗與產(chǎn)地溯源檢驗中，可以聯(lián)合應(yīng)用DNA 指紋技術(shù)應(yīng)與理化檢測技術(shù)，為更準確地鑒別假冒偽劣食品和溯源優(yōu)良品種原材料產(chǎn)地提供技術(shù)支持。

3 基因芯片技術(shù)

基因芯片又稱DNA芯片（DNA chip）或DNA微陣列（DNA microarray），20世紀80年代末，基因芯片技術(shù)迅速發(fā)展，并成為生命科學領(lǐng)域一項高新技術(shù)，是一項基于基因表達和基因功能研究的革命性技術(shù)?；蛐酒\用DNA分子作為探針的生物芯片，在一個微小的載體表面點陣式排布大量的可尋址的探針分子，通過目標基因與探針之間的配對反應(yīng)對目標基因進行分析，獲得的光信號、電信號或磁信號被檢測儀器記錄并轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號，然后由計算機軟件自動分析、解讀實驗結(jié)果。

基因芯片技術(shù)在一次實驗中就可以對成千上萬的靶標基因進行測定，鑒于高通量的技術(shù)特點，可以運用于復雜成分的篩查。目前基因芯片正在成為食品和食品原料檢測中一種較新的方法，檢測食品的營養(yǎng)成分，監(jiān)督食品的衛(wèi)生、安全和食品質(zhì)量，保證人類健康，并且將對整個食品領(lǐng)域產(chǎn)生深刻的影響。Borucki等[14]成功構(gòu)建了一種可準確鑒別24種近緣單核增多李斯特菌微陣列基因組芯片；Lee等[15]建立了一種基因芯片檢測技術(shù)可同時檢測7種奶牛乳房炎常見病原微生物（金黃色葡萄球菌、乳房鏈球菌、牛棒狀桿菌、牛支原體、牛鏈球菌、停乳鏈球菌和無乳鏈球菌），該基因芯片能在6h內(nèi)完成整個檢測過程，且靈敏度高，目前已成功應(yīng)用于臨床；成曉維等[16]選取9種常見轉(zhuǎn)基因食品外源基因，制備一種可視芯片，可以一次檢測出5種的常見轉(zhuǎn)基因植物（轉(zhuǎn)基因玉米、大豆、水稻、油菜、小麥），該方法靈敏度可達0.1%，同時擺脫了基因芯片在雜交結(jié)果分析階段對熒光掃描儀的依賴，雜交結(jié)果明顯直觀；Kellya[17]等制備了一種基因檢測芯片，與從工業(yè)廢水處理廠收集樣品提取并通過羥自由基的方法標記核酸的rRNAs，進行雜交，證明了硝化細菌可以借助不需要PCR擴增的芯片雜交來直接檢測到。

然而，基因芯片檢測技術(shù)需要大量已測知且準確的遺傳信息作為基礎(chǔ)，所涉及使用的儀器設(shè)備價格昂貴，同時對操作人員的專業(yè)素質(zhì)要求較高。因此，使用基因芯片技術(shù)檢測燕窩的研究報道鮮有報道。

當前，人類已經(jīng)進入大通量、大規(guī)模、大范圍的基因研究階段[18]，作為一項高新技術(shù)，基因芯片技術(shù)具有十分誘人的前景，但要運用到食品安全檢測中還需解決以下問題：1.芯片制作工藝復雜，信號檢測需要專門的儀器設(shè)備，價格昂貴；2.樣品制備和標記比較復雜，沒有一個統(tǒng)一的質(zhì)量控制標準；3.實驗室不能共享數(shù)據(jù)和資料庫等。這些都在一定程度上限制了基因芯片技術(shù)的運用。為使基因芯片成為實驗室研究或?qū)嵺`中可以普遍采用的技術(shù)，須從以下幾方面著手解決問題：1.提高基因芯片的特異性、重復性；2.簡化樣品制備和標記操作；3.增加信號檢測的靈敏度；4.研制和開發(fā)高度集成化的樣品制備、基因擴增、核酸標記及檢測儀器。

基因芯片技術(shù)盡管存在一定的不足和局限，但

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10.3969/j.issn.1007-550X.2017.05.007

TS207.3

A

1007-550X（2017）05-0047-04

2017-03-03

林釗（1989- ），男，福州永泰人，助理工程師，研究方向：微生物學。