王緒英 龍永游 鄧 黔

（六盤水師范學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，貴州六盤水553001）

紅豆杉科(Taxaceae)紅豆杉屬(Taxus)植物為國家Ι級重點(diǎn)保護(hù)野生植物（國家林業(yè)局和農(nóng)業(yè)部，1999），全世界紅豆杉屬有11種，我國有4種1變種。紅豆杉(Taxus chinensis)為我國特有種，產(chǎn)于甘肅南部、陜西南部、四川、云南東北部及東南部、貴州西部及東南部、湖北西部、湖南東北部、廣西北部和安徽南部，常生于海拔1 000～1 200 m以上的高山上部（中國科學(xué)院植物研究所編輯委員會，1978）。紅豆杉是珍貴的抗癌植物，對頸部腫瘤、胃癌、肺癌、食道癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、卵巢癌等有較好療效,同時(shí)還具有降低膽固醇、抗炎等功能（陸順能和潘禎陽，2012）。紅豆杉屬不同種的植物化學(xué)成分含量不但隨種類、部位的不同具有一定的差異，而且同一種因生于不同地域環(huán)境，其化學(xué)成分含量也有差異（張潔等，2008）。經(jīng)過考察，六盤水市內(nèi)紅豆杉分布廣，以盤州市分布最集中（左經(jīng)會等，2013；朱軍等，2013）。對六盤水分布的野生紅豆杉進(jìn)行化學(xué)成分預(yù)試，對不同部位的蛋白質(zhì)含量及氨基酸種類進(jìn)行定性研究，為進(jìn)一步開發(fā)六盤水紅豆杉產(chǎn)業(yè)提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

材料：紅豆杉采自貴州省六盤水市盤州市?；l(xiāng)老馬沖（海拔：2 048 m），將其莖、皮、葉陰干，粉碎，備用。

試劑：茚三酮、乙醇、丙酮、a-萘酚、濃硫酸、乙酸酐、磷鉬酸、三氯化鐵、冰醋酸、硼酸、濃鹽酸、鎂粉、氯仿、氫氧化鈉、鹽酸、溴酚藍(lán)、過氧化氫、硼酸、稀氨水、硫酸、氯化汞、碘化鉀、正丁醇、組氨酸、脯氨酸、亮氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、精氨酸、谷氨酸、甘氨酸、酪氨酸均為分析純。

儀器：DFT-200粉碎機(jī)(溫嶺市林大機(jī)械有限公司)；BOXUN烘箱(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；DZKW-4恒溫水浴鍋(上?？莆鲈囼?yàn)儀器廠)；UV紫外燈(合肥塞帆實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；PHS-2C PH計(jì)(姜堰市新康醫(yī)療器械有限公司)；KDN型定氮儀HYP-10系統(tǒng)消化裝置(上海纖檢儀器有限公司)；KDN型定氮儀102C型蒸餾裝置(上海纖檢儀器有限公司)；BS423S塞多利斯科學(xué)儀器電子分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 紅豆杉化學(xué)成分預(yù)試

1.2.1.1 水浸液的浸提：稱取莖粉末4 g于燒杯中，加40 mL去離子水浸泡過夜。

1）氨基酸的預(yù)試

取2～3滴茚三酮試劑加入1 mL冷浸液中，搖勻，沸水浴加熱5 min，冷卻后觀察；還原糖、多糖和甙的預(yù)試，采用a-萘酚試驗(yàn)，取2～3滴a-萘酚乙醇液加入1 mL熱浸液中，搖勻，加入少量濃硫酸，觀察結(jié)果。

2）皂甙的預(yù)試

（1）采用泡沫試驗(yàn)：取1～2 mL熱浸液，激烈震蕩，產(chǎn)生大量蜂窩狀泡沫，放置10 min后，加入乙醇，觀察結(jié)果。

（2）乙酸酐-濃硫酸反應(yīng)：取乙醇液1～2 mL，蒸發(fā)乙醇，用乙酸酐溶解殘?jiān)?滴濃硫酸，觀察結(jié)果。

（3）揮發(fā)油的預(yù)試：取水浸液滴在濾紙上，噴5%磷鉬酸水溶液，熱風(fēng)吹1 min，觀察結(jié)果。

1.2.1.2 醇提取液的浸提：稱取莖粉末5 g，加入60 mL 95%乙醇，放入索式提取器中水浴加熱回流提取20 min。

1）酚類化合物和鞣質(zhì)的預(yù)試，將醇提取液用乙酸酸化，取1 mL，加1%三氯化鐵1～2滴，觀察結(jié)果；黃酮類化合物的預(yù)試，取1 mL醇提取液，加少許鎂粉，再滴入數(shù)滴濃硫酸，觀察結(jié)果；甾體、三萜類化合物的預(yù)試，氯仿-濃硫酸反應(yīng)：將醇提取液溶解于氯仿，加濃硫酸，觀察結(jié)果；內(nèi)酯和香豆素的預(yù)試：（1）熒光試驗(yàn)：取醇提取液于濾紙上，置于紫外燈下觀察，是否有藍(lán)色熒光，觀察結(jié)果；（2）開環(huán)-閉環(huán)試驗(yàn)：加1%氫氧化鈉于醇提取液中，觀察醇提取液是否變澄清，再加2%鹽酸，觀察醇提取液是否變渾濁。

2）有機(jī)酸的預(yù)試

（1）pH計(jì)檢測：用pH計(jì)檢查醇提取液的pH。

（2）溴酚藍(lán)試驗(yàn)：取醇提取液于濾紙上，噴灑1%溴酚藍(lán)乙醇液，觀察結(jié)果。

3）蒽醌類的化學(xué)預(yù)試

（1）1%硼酸水溶液試驗(yàn)：取醇提取液于濾紙上，噴灑1%硼酸，觀察結(jié)果。

（2）堿性試驗(yàn)：取1 mL醇提取液于試管，加1 mL 1%氫氧化鈉，觀察是否顯現(xiàn)出紅色，接著加少量30%過氧化氫并加熱，看紅色是否褪去，再加酸液酸化，觀察結(jié)果。

1.2.1.3 酸提取液的浸提:稱取莖粉末2 g，加0.5%鹽酸乙醇10 mL，放置于索式提取儀器中水浴加熱回流提取10 min。

生物堿的預(yù)試：先用稀氨水將酸提取液調(diào)至中性，水浴蒸干，再加5%硫酸4 mL溶解殘?jiān)^濾，取濾液1 mL，加1～2滴碘化汞鉀試劑，觀察結(jié)果。

1.2.2 紅豆杉樣品制備

稱取紅豆杉莖、皮、葉粉末各1 g分別裝入消化管中，加入15 g加速劑和25 mL濃硫酸，搖均。同樣做一份空白對照(不加樣品)，消化完全冷卻，加入10 mL去離子水蒸餾。當(dāng)加入15 mL硼酸—混合指示劑的錐形瓶體積達(dá)到100～150 mL時(shí)，取下錐形瓶。

1.2.3 紅豆杉中蛋白質(zhì)的酸水解

稱取0.4 g紅豆杉粉末，放入聚乙烯管，加入2 mL 6 moL/L鹽酸，在110℃干燥箱中水解20 h，將水解液倒入蒸發(fā)皿中，沸水浴加熱除去鹽酸，蒸干溶于2 mL 10%異丙醇中。

1.2.4 紅豆杉蛋白質(zhì)含量測定

用已知濃度的酸滴定蒸餾接收液，記錄消耗鹽酸體積，滴定2次，按下列公式計(jì)算樣品中蛋白質(zhì)含量：

粗蛋白質(zhì)含量=[(V2-V1)×0.05×0.014 0×6.25]/[(W×V'/V)×100]×100%

式中，V2為滴定試樣時(shí)消耗標(biāo)準(zhǔn)酸體積；V1為滴定空白時(shí)消耗標(biāo)準(zhǔn)酸體積；0.05為標(biāo)準(zhǔn)酸溶液濃度；6.25為氮換算成粗蛋白質(zhì)的系數(shù)；W為試樣重量；V'為試樣分解液蒸餾所用體積；V為試樣分解液總體積；0.014 0為氮的毫克當(dāng)量數(shù)。

1.2.5 紅豆杉中氨基酸的紙層析法

將標(biāo)準(zhǔn)氨基酸和蛋白質(zhì)樣品點(diǎn)于層析濾紙的標(biāo)記位置，進(jìn)行層析，層析后電爐上烘干濾紙。用0.5%的茚三酮正丁醇溶液顯色。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅豆杉植物成分的檢測

預(yù)試結(jié)果見表1。

表1 紅豆杉預(yù)試液中植物化學(xué)成分的檢測

由表1可知，紅豆杉植物中含有蛋白質(zhì)（氨基酸、多肽或脯氨酸）、還原糖、多糖和甙、皂甙、揮發(fā)油、酚類化合物和鞣質(zhì)、黃酮類化合物、甾體、三萜類化合物、內(nèi)酯、香豆素、強(qiáng)心甙、有機(jī)酸、蒽醌類和生物堿；不含氰甙和油脂。

2.2 蛋白質(zhì)含量測定

取紅豆杉莖、皮、葉各1 g，用凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)含量，結(jié)果見表2。

由表2可知，蛋白質(zhì)含量由高到低依次為莖、葉、皮。

表2 紅豆杉莖、皮、葉中蛋白質(zhì)含量

2.3 紙層析法測定紅豆杉葉中氨基酸種類

用紙層析法測定紅豆杉中氨基酸種類結(jié)果見圖1。由圖1、圖2、圖3可知紅豆杉莖、葉、皮中都含組氨酸、脯氨酸、亮氨酸、色氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸。

圖1 紅豆杉葉提取物紙層析圖譜

圖2 紅豆杉樹皮提取物紙層析圖譜

圖3 紅豆杉莖提取物紙層析圖譜

3 結(jié)論與討論

目前，紅豆杉研究主要集中在抗癌成分紫杉醇的提取純化（蘇應(yīng)娟等，2000；王達(dá)明，2004；鄭德勇，2003；衛(wèi)強(qiáng)和孫濤，2016）、繁殖技術(shù)和遺傳多樣性(張蕊等，2009，2011;任旻瓊等，2009;李乃偉等，2010)、適宜栽培區(qū)的研究（李鴻杰等，2014）、栽培技術(shù)以及組培研究（劉新星 等，2015），關(guān)于其營養(yǎng)成分的研究很少有人涉及。

本研究發(fā)現(xiàn)紅豆杉植物中含有蛋白質(zhì)(氨基酸、多肽或脯氨酸)、還原糖、多糖和甙、皂甙、揮發(fā)油、酚類化合物和鞣質(zhì)、黃酮類化合物、甾體、三萜類化合物、內(nèi)酯、香豆素、強(qiáng)心甙、有機(jī)酸、蒽醌類和生物堿；不含氰甙油脂。紅豆杉莖、葉、皮中均含有組氨酸、脯氨酸、亮氨酸、色氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸，蛋白質(zhì)含量由高到低依次為莖、葉、皮。氨基酸是蛋白質(zhì)的基本組成單位，是構(gòu)成人體最基本的物質(zhì)之一，是生命代謝的物質(zhì)基礎(chǔ)，氨基酸不僅具有重要的營養(yǎng)價(jià)值，每種氨基酸還具有特定的藥理功能，通過對紅豆杉中化學(xué)成分的研究，進(jìn)一步挖掘紅豆杉非藥用成分的營養(yǎng)功能，以期為紅豆杉開發(fā)成為藥食功能產(chǎn)品提供參考。

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