李進偉，田 力，薛維爽，陳漢澤，付開磊，滕偉禹*

·綜述·

非編碼RNA與卒中后繼發(fā)性腦損傷的研究進展

李進偉1，田 力2，薛維爽1，陳漢澤1，付開磊1，滕偉禹1*

非編碼RNA(ncRNA)是一類不編碼蛋白質的RNA，但在轉錄、翻譯等過程中起著至關重要的調控作用，其功能尚未完全明確。腦卒中作為一類高死亡率、高致殘率的疾病，ncRNA的出現(xiàn)為卒中的診治提供了新的方向。本文旨在將近些年來ncRNA與卒中后繼發(fā)性腦損傷的研究進展進行總結。

腦卒中；微小RNA；長鏈非編碼RNA；環(huán)狀RNA；與Piwi蛋白相互作用的RNA

0 引言

腦卒中(Cerebral stroke)主要包括缺血性卒中(Ischemic stroke)和出血性卒中(Hemorrhagic stroke)，其中缺血性卒中約占卒中的60%～80%。卒中是一類高發(fā)病率、高死亡率、高致殘率的一組疾病，在我國占疾病死因首位，給社會帶來了沉重的經濟負擔。由于目前沒有有效的治療手段，長久以來對于腦卒中的治療，重在預防。近年來，隨著神經免疫學的興起，腦卒中后的炎癥反應越來越受到廣大神經科醫(yī)生的重視。炎癥反應在卒中后既起到促進血管再生等保護作用，也加重了卒中后腦組織的損傷。

非編碼RNA(Non-coding RNA，ncRNA)是指一類不編碼蛋白質的RNA。廣義的ncRNA包括核糖體RNA(ribosomal RNA，rRNA)、轉運RNA(transfer RNA，tRNA)、核小RNA(small nuclear RNA，snRNA)等作用機制比較明確的RNA，以及微小RNA(microRNA，miRNA)、長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)、環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA)、與Piwi蛋白相互作用的RNA(piwi-interacting RNA，piRNA)等未知功能的RNA。這些未知功能的ncRNA最早被認為是RNA酶剪切后的噪音。隨著基因芯片與第二、三代測序技術的成熟，研究者發(fā)現(xiàn)，與正常人相比,患病人群這些ncRNA存在明顯的差異性。而隨著慢病毒等各種載體、小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)、crispr-cas 9基因敲除等技術的出現(xiàn)，越來越多的ncRNA被證實在轉錄及轉錄后調控中起到重要的作用。ncRNA與腦卒中后炎癥反應、自噬、凋亡、神經再生等成為近年來的研究熱點，本文對近年來ncRNA與卒中后繼發(fā)性腦損傷的研究進展做一總結。

1 腦卒中后繼發(fā)性腦損傷機制

腦梗死(Cerebral infarction)發(fā)生后，在缺血早期，腦血流減少，導致腦組織缺氧，細胞膜鈉鉀泵失調，細胞外鈣離子緩沖系統(tǒng)失調，無氧糖酵解增加，產生過多的氧自由基及大量炎癥因子直接對腦組織產生損傷。隨后，隨著血管再通及側支循環(huán)的形成，缺血再灌注損傷也誘導了更為強大的炎癥反應。最終導致腦、淋巴器官、血液循環(huán)等一系列的炎癥級聯(lián)反應，對缺血后的腦組織造成損傷[1]。

腦出血(Cerebral hemorrhage)后繼發(fā)性腦損傷機制包括以下幾種原因：①血腫及水腫的直接壓迫，組織缺血，細胞壞死。②炎癥反應對腦組織的損傷。腦出血后腦組織內存在中性粒細胞和巨噬細胞浸潤，小膠質細胞激活和炎癥因子參與的炎癥反應[2]，炎癥反應是腦水腫產生的重要因素，而腦水腫是ICH病情加重的關鍵所在，所以目前絕大多數(shù)的研究集中在如何減輕腦出血后炎癥反應。③氧自由基生成對腦組織形成損傷。④腦組織與血腫相接觸，啟動內源性及外源性凝血途徑，產生凝血酶，促進各種炎性細胞釋放炎性因子。⑤細胞壞死凋亡。

近年來，隨著動物及細胞實驗技術的發(fā)展，鼠大腦中動脈阻塞(Middle cerebral artery occlusion，MCAO)再灌注模型[3]、鼠腦出血模型[4]、細胞缺氧缺糖(Oxygen glucose deprivation，OGD)模型[5]等動物細胞模型的成熟，腦卒中后的損傷機制越來越多地在動物及細胞實驗中被證實。

2 miRNA和卒中性疾病

miRNA是一種內源性非編碼單鏈RNA，長度約為22～25 nt，具有很高的生物學保守性。miRNA由前體，即pri-miRNA經過2次修飾加工后形成。通過堿基互補配對與mRNA 3′端UTRs相結合，降解信使RNA(messenger RNA，mRNA)或抑制mRNA的翻譯，從而起到轉錄調控作用。一種miRNA可以和多個mRNA相結合，而一個mRNA又有多個miRNA結合位點，生物學作用機制復雜。miRNA通過細胞分化、凋亡、再生、炎癥等多種生物學途徑，參與了生物體生長發(fā)育以及疾病的發(fā)展轉歸。

2.1 臨床關于miRNA和卒中性疾病的研究 Guo等[6]選擇16例腦出血患者、15例腦梗死患者以及8例健康人的血漿，通過基因芯片篩選出只在腦出血患者中過表達，并且在男性及女性患者中都存在的miRNA，定量即時聚合酶鏈鎖反應(quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR)驗證其中miR-27a、miR-365、miR-150、miR-34c-3p這4條miRNA，并通過機制分析認為其與炎癥反應相關。Leunq等[7]在74例腦梗死及19例腦出血患者血漿中驗證得到miR-124-3p 和miR-16兩條microRNA，認為其可以作為生物學標志物(biomarker)鑒別腦出血及腦梗死。Zhu等[8]通過對3例腦出血患者及3例健康正常人的miRNA基因芯片篩選，并在30例患者及30例正常對照組中進行驗證。與患者腦出血后CT影像學顯示水腫范圍做相關性分析，得出miR-126與腦出血后腦水腫密切相關。通過軟件預測得到miR-126的靶基因位于VCAM1、SPRED1、PIK3R2，影響炎癥通路并減輕出血后水腫。研究認為，mir-126可以作為預測腦出血預后的一種biomarker。Zheng等[9]選擇腦出血后血腫擴大患者30例，腦出血后血腫不擴大患者49例及健康人30例，取患者外周血，通過基因芯片及qRT-PCR驗證，得到在出血后血腫擴大患者中10個差異性表達的miRNA。認為這些miRNA可以作為出血后血腫擴大的預測因子。

2.2 動物及細胞實驗關于miRNA和卒中性疾病的研究 Liu等[10]建立腦梗死及腦出血大鼠模型，取模型外周血與腦組織做miRNA測序分析，篩選出在腦組織及外周血中同時差異性表達的miRNA，其認為這些miRNA可以作為biomarker應用于臨床。Zhao等[11]選取c57/bl6小鼠大腦皮層原位細胞，驗證在腦出血后，miR-233可以通過和NLRP3 mRNA中3′UTR端含有保守的miR-223結合位點結合，下調NLRP3，通過caspase-1和IL-1β抑制炎癥，減少腦水腫，改善神經功能，其認為miR-233可以作為治療腦出血后水腫的一種新途徑。Wang等[12]發(fā)現(xiàn),在腦出血患者中，血清中miR-130a的表達量與血中周圍水腫體積相關。通過建立大鼠腦出血模型，驗證了這種關系。細胞實驗證實，miR-130a可以通過下調牛窖蛋白-1(caveolin-1，cav-1)以及上調基質金屬蛋白酶(Matrix metalloproleinase-2/9，MMP-2/9)影響出血周圍水腫。Wang等[12]認為，miR-130a可以作為一種biomarker或者生物學治療方式應用于臨床中。

Kim等[13]在大鼠腦出血模型腦組織中發(fā)現(xiàn)Let7c存在差異性表達。在體外細胞實驗及大鼠體內實驗證實，腦出血后上調的Let7c可以通過IGF1R作用減少腦水腫和細胞損傷，從而達到減輕腦出血后腦水腫的治療目的。

3 lncRNA和卒中性疾病

lncRNA長度200 nt，通常不編碼蛋白質，但是在多種層面上參與轉錄編碼、基因調控。lncRNA起初被認為是基因轉錄的“噪音”，是RNA聚合酶Ⅱ轉錄的副產物，沒有生物學意義。然而，近年來大量的研究證實，lncRNA可以從多個層面調控基因表達。目前研究集中在以下幾個方面：①調控表觀遺傳，如：參與DNA、RNA甲基化，修飾染色體結合蛋白等。②轉錄調控，lncRNA可以和轉錄因子結合，控制基因轉錄活性。③轉錄后調控，一些lncRNA還可以直接參與mRNA的轉錄后調控，影響基因的表達。④調控miRNA，起到海綿作用。

3.1 臨床關于lncRNA和卒中性疾病的研究 Dykstra-Aiello等[14]通過對臨床266個腦梗死患者外周血基因芯片篩查發(fā)現(xiàn)，男性中有44個、女性中有33個lncRNA顯著變化。

INK4基因座中反義非編碼RNA(Antisense non-coding RNA in the INK4 locus，ANRIL)，是一個由19個外顯子組成的長鏈非編碼RNA，位于9p21。Congrains等[15]綜述顯示，ANRIL在心血管疾病、阿爾茲海默病、2型糖尿病、青光眼、子宮內膜異位癥及牙周炎中起到調控作用。Zhang等[16]通過對724例動脈粥樣硬化斑塊形成、466例腔梗、462例出血性卒中及1 664例對照組患者進行平均4.5年的隨訪觀察發(fā)現(xiàn)，ANRIL與動脈粥樣硬化血栓形成、出血性卒中易感性有關，并可以作為預測卒中復發(fā)及預后的生物學指標。

這些通過基因芯片、高通量測序等手段，在疾病中得到的差異性表達生物標記物，可以作為biomarker，預測疾病的發(fā)生、發(fā)展與預后，并指導基礎實驗進一步完善機制分析。

3.2 動物及細胞實驗關于lncRNA和卒中性疾病的研究 lncRNA可以通過與染色質修飾蛋白相互作用，影響生物表觀遺傳學。Dharap等[17]用RNA免疫沉淀技術(RNA immunoprecipitation，RIP)，將腦缺血小鼠腦組織中與Sin3A和coREST形成RNA-蛋白質的復合物沉淀下來，通過芯片高通量分析，發(fā)現(xiàn)了177個與之相結合的lncRNA。這項研究表明，缺血性卒中后誘導的lncNRA，也可以與染色質修飾蛋白結合，調控梗死后生物表觀遺傳。Mehta等[18]研究發(fā)現(xiàn)，lcnRNA FosDT可以和REST相關性染色質修飾蛋白結合，促進梗死后腦組織損傷。

一些lncRNA在卒中后的組織損傷、細胞凋亡及細胞再生中起到轉錄調控作用。長期非編碼RNA，轉移相關肺腺癌轉錄物-1(lncRNA Malat1)，是一種預測肺癌預后的生物標志物。Zhang等[19]在OGD細胞模型、MCAO小鼠模型及LncRNA Malat1基因敲除鼠中證實，Malat1在腦微血管系統(tǒng)中發(fā)揮抗凋亡和抗炎作用，以減少缺血性腦血管和實質損傷。在另外一項研究中，Zhang等[20]在大鼠實驗中證實，過表達的lncRNA ANRIL在腦梗死合并糖尿病中，激活NF-κB信號通路，上調VEGF并促進血管生成。Yan等[21]研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA MEG3可以激活p53，調節(jié)腦梗后細胞凋亡。其通過在皮層神經元細胞和N2a 細胞完善機制分析，MCAO小鼠中完善qRT-CPR驗證，對腦梗死小鼠做顱腦磁共振檢查測得梗死面積，得出該結論，并認為lncRNA MEG3可以作為一個新的治療靶點。Wu等[22]在動物實驗中研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA-N1LR可以通過調節(jié)p53磷酸化，在小鼠腦梗死后提高細胞周期，加快細胞增殖，從而改善癥狀。Zhang等[23]通過在OGD模型中篩出的lncRNA，在小鼠MCAO模型建模24 h后取得的血管內皮細胞中進行驗證，發(fā)現(xiàn)這些內皮反應性lncRNA可能介導了內皮細胞對于缺血再灌注損傷的病理機制。

此外，lncRNA還可以通過與miRNA的內源競爭RNA(Competing endogenous RNA，ceRNA)機制，參與卒中后mRNA的轉錄。Chen等[24]在大鼠MCAO模型及細胞OGD模型中證實，lncRNA TUG1可以通過和microRNA-9的海綿機制，上調bcl2l11促進神經細胞凋亡。抑制lncRNA TUG1的表達，可能作為一種新的腦梗死后治療靶點。

活化的小膠質細胞能夠在腦梗死后釋放大量的炎性因子，對腦組織造成損傷。Qi等[25]在MCAO及OGD模型中證實，lncRNA SNHG14通過抑制miR-145-5p增加PLA2G4A的表達，導致腦梗死中小膠質細胞的激活，從而造成腦損傷。抑制lncRNA SNHG14的表達，可以減少小膠質細胞的激活，從而減輕腦損傷。

自噬(Autophagy)是細胞吞噬自身蛋白質或細胞器并包入囊泡，并與溶酶體融合形成吞噬溶酶體，降解其中的物質，達到細胞自身新陳代謝的目的，是近年來的研究熱點。Wang等[26]通過對大鼠MCAO模型及SH-SY5Y細胞缺血缺氧處理后，實驗驗證得出lncRNA H19可以通過激活自噬，誘導腦梗死缺血再灌注損傷。

4 其他ncRNA和卒中性疾病

circRNA是一類雙鏈閉合、無3′帽子結構及5′polyA尾、長度在幾百至幾千不等的非編碼RNA。其不受RNA外切酶降解，穩(wěn)定且廣泛地存在于生物界，具有進化保守性。1976年，Sanger等[27]在高等植物中的類病毒里首先發(fā)現(xiàn)了circRNA的存在。2012年，Salzman等[28]發(fā)現(xiàn)，環(huán)狀RNA廣泛且穩(wěn)定地存在于人類在內的真核世界。circRNA的主要作用機制是調節(jié)基因表達，具體機制包括：①miRNA的海綿作用[29]；②調控經典的RNA剪切；③與轉錄調控原件結合調控母基因轉錄。目前大多數(shù)研究主要集中在circRNA作為miRNA海綿作用這種機制。其中CDR1as(ciRS-7)[30]和SRY[29]作用機制比較明確。目前，circRNA的研究主要集中在腫瘤和神經退行性病變。缺血性及出血性卒中與circRNA的許多研究尚在進行中。Shao等[31]用HT22細胞建立OGD/R模型，通過circRNA芯片，發(fā)現(xiàn)3個在缺血再灌注后過表達、12個下調的circRNA，并用qRT-PCR驗證了mmu-circRNA-015947。通過生物信息分析、GO分析及KEGG分析，其預測此circRNA可以通過和一些microRNA的海綿作用，影響缺血再灌注后細胞代謝、免疫反應及細胞凋亡。

piRNA是一種長度在24～31核苷酸的非編碼RNA。物種之間缺乏保守性[32]。其功能和作用機制尚不明確，目前認為，piRNA可以通過控制反轉錄轉座子的轉錄后沉默，防止基因突變，從而保證基因組的完整性[33]。piRNA被證實多存在于生殖細胞中。Dharap等[34]造成大鼠局灶性缺血后，通過基因芯片測得105個piRNA有顯著差異。這些piRNA的轉座子靶點分布在20個常染色體中。通過分析與這些piRNA基因位點有關的轉錄因子，推測這些轉錄因子通過沉默的方式起到調控作用。除Dharap等的研究之外，目前尚缺乏有關piRNA和腦卒中的研究。

5 總結與展望

ncRNA雖然不編碼蛋白質，但是在轉錄、翻譯、修飾等方面起到重要的調控作用。從人們開始認識到這些ncRNA具有作用到現(xiàn)在成為研究熱點僅有短短十幾年的時間。隨著測序技術及基因芯片技術的發(fā)展，越來越多的ncRNA如siRNA、circRNA、piRNA被人們認識。這些ncRNA在預測疾病的發(fā)生、轉歸以及靶向治療方面有著很大的潛力。希望ncRNA今后可以作為一種新的治療靶點用于臨床，減輕腦卒中對患者本人、家庭及社會所帶來的沉重負擔。

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Researchprogressofnon-codingRNAandsecondarybraininjuryafterstroke

LI Jin-wei1,TIAN Li2,XUE Wei-shuang1,CHEN Han-ze1,FU Kai-lei1,TENG Wei-yu1*

(1.Department of Neurology,First Affiliated Hospital of China Medical University,Shenyang 110001,China;2.Shengjing Hospital of China Medical University,Shenyang 110004,China)

Non-coding RNA is a class of RNA that does not encode protein,but plays a vital role in transcription,translation,and so on.However,its function is not yet clear.Stroke is a disease with high mortality and disability.The emergence of non-coding RNA provides a new way for the diagnosis and treatment of stroke.The aim of this study is to summarize the progress of ncRNA and secondary brain injury after stroke in recent years.

Cerebral stroke；miRNA；lncRNA；circRNA；piRNA

2017-07-16

1.中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院神經內科，沈陽110001；2.中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院，沈陽110004

遼寧省科學技術計劃項目(2014226033)；沈陽市科技計劃項目(F16-206-9-03)；中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院院內課題(ME63)

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10.14053/j.cnki.ppcr.201711028