劉俊芬 崔向榮 吳媛霞 蘇丹 武學(xué)清

多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）是青春期及育齡期女性中最常見(jiàn)的具有高度異質(zhì)性伴有糖代謝異常的內(nèi)分泌及代謝紊亂性疾病，是引發(fā)無(wú)排卵性不孕的主要原因，其具體病因尚未闡明［1］。有研究表明，卵泡的發(fā)育受阻及優(yōu)勢(shì)卵泡的選擇與顆粒細(xì)胞凋亡有關(guān)［1］。骨形態(tài)發(fā)生蛋白7（bone morphogenetic protein7，BMP7）作為轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGFβ）超家族中的一員，在胚胎發(fā)育及再生修復(fù)中起重要作用，但BMP7的異常表達(dá)是否與顆粒細(xì)胞凋亡及進(jìn)而引發(fā)卵泡發(fā)育受阻和優(yōu)勢(shì)卵泡選擇閉鎖相關(guān)，目前尚未見(jiàn)報(bào)道［2］。本研究通過(guò)比較PCOS與正常排卵患者顆粒細(xì)胞凋亡情況及BMP7的表達(dá)差異，初步探討PCOS患者體內(nèi)BMP7的異常表達(dá)對(duì)顆粒細(xì)胞增殖的影響，為改善臨床PCOS患者的卵泡發(fā)育及妊娠率提供理論依據(jù)。

對(duì)象與方法

一、對(duì)象

選擇2015年9月—2016年1月于本中心行體外受精胚胎移植技術(shù)（IVF ET）或卵泡質(zhì)內(nèi)單精子顯微注射（ICSI）助孕治療的患者44例，年齡22～37歲，平均（28．9±3．1）歲。符合 2003年荷蘭鹿特丹會(huì)議上制定的PCOS診斷標(biāo)準(zhǔn)的PCOS組33例；無(wú)排卵功能障礙，因輸卵管因素或男性不育接受IVF／ICSI治療的對(duì)照組11例。排除標(biāo)準(zhǔn)：患者近3個(gè)月受過(guò)促排卵治療或服用過(guò)促排卵治療；患者合并有子宮內(nèi)膜異位癥、庫(kù)欣綜合征、腎上腺腫瘤、卵巢功能早衰及卵巢男性化腫瘤等。本研究已由山西省婦幼保健院（兒童）醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書(shū)。

二、方法

1．卵巢刺激方案：本研究中PCOS患者于治療周期前部分口服避孕藥達(dá)英35或炔雌醇環(huán)丙孕酮片。所有患者均采用拮抗劑方案，患者從月經(jīng)周期第2天或口服避孕藥、孕激素撤退出血第2天，通過(guò)陰道B超及血激素水平評(píng)估卵巢基礎(chǔ)狀態(tài)，于月經(jīng)第2～3天開(kāi)始啟動(dòng)促排卵，從啟動(dòng)日起使用FSH（普利康，美國(guó)默沙東公司或麗申寶，珠海麗珠制藥公司）及人絕經(jīng)期促性腺激素（human menopausal gonadotrophin，hMG）（珠海麗珠制藥公司）進(jìn)行促排卵，啟動(dòng)劑量根據(jù)患者年齡、體重指數(shù)（body mass index，BMI）、基礎(chǔ) FSH水平、竇卵泡計(jì)數(shù)等而定。在Gn應(yīng)用4～5天后陰道B超監(jiān)測(cè)卵泡生長(zhǎng)情況，根據(jù)卵泡生長(zhǎng)及血激素水平，及時(shí)調(diào)整促排卵藥物劑量。在優(yōu)勢(shì)卵泡直徑＞14 mm時(shí)開(kāi)始注射GnRH拮抗劑（加尼瑞克，美國(guó)默沙東公司）0．25 mg／d。當(dāng)有3枚以上卵泡直徑≥18 mm時(shí)，于當(dāng)晚給予人絨毛膜促性腺激素（hCG，珠海麗珠制藥公司）5 000～10 000 U肌肉注射，注射hCG后36～38 h行超聲引導(dǎo)下經(jīng)陰道穿刺取卵術(shù)。其余操作按照本中心的常規(guī)進(jìn)行。

2．體外受精胚胎移植和黃體支持治療：兩組均在hCG注射后36～38 h后經(jīng)陰道B超引導(dǎo)下行取卵術(shù)，取卵日開(kāi)始進(jìn)行黃體支持（注射用黃體酮40 mg／d）。根據(jù)患者病情行常規(guī)受精或單精子卵胞漿內(nèi)注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI），16～18 h后觀察受精情況，授精后18～20 h觀察，有清晰雙原核者（2PN）為受精卵。在取卵后第3天進(jìn)行可用胚胎評(píng)估并移植，可用胚胎為受精第3天卵裂球4～8個(gè)，分級(jí)為2級(jí)及以上的胚胎，取卵后3 d或5 d行ET術(shù)。

3．卵泡液及顆粒細(xì)胞的收集：于患者取卵當(dāng)天，收集PCOS及對(duì)照組婦女未經(jīng)血液污染的卵泡液，經(jīng)4 000 r／min離心25 min，將上清液收集便為分析用卵泡液，且將其封存于 15 ml離心管內(nèi)，于－80℃冰箱凍存?zhèn)溆?。用PBS將卵泡液離心后的沉淀清洗3次，用PBS（1 m l）將其混勻，隨后用吸管將其吸取且加入具有等體積的淋巴細(xì)胞分享液中，于2 500 r／min條件下離心20 min，將第2層顆粒細(xì)胞（白色云霧狀細(xì)胞團(tuán)）收集于離心管內(nèi)，且用PBS將其清洗3次后于－80℃冰箱凍存?zhèn)溆茫糜谙嚓P(guān)指標(biāo)檢測(cè)。

4．Real time PCR：檢測(cè)膜受體 BMP7、Bcl2及Caspase3 mRNA轉(zhuǎn)錄水平。用PBS將收集的卵丘顆粒細(xì)胞洗滌3次，采用 RNA提取試劑盒（TIANGEN，天根生化科技有限公司）提取細(xì)胞總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，采用Real time PCR對(duì)逆轉(zhuǎn)錄的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。以GAPDH，進(jìn)而優(yōu)化反應(yīng)條件，使目的基因與內(nèi)參的擴(kuò)增效率接近100%，Ct值代表基因的起始拷貝數(shù)，可根據(jù)Ct值比較基因的表達(dá)量。ΔΔCt＝（Ct目的基因Ct內(nèi)參基因）（Ct陰性對(duì)照Ct內(nèi)參基因），以2ΔΔCt計(jì)算各組 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。基因引物序列如下：BMP7上游 5′CTCCAAGACGCCCAAGAACCAGG3′， 下 游 5′GCTGTCATCGAAGTAGAG GACGGA3′；Bcl2上游5′GGTGGGGTCATGTGTGTGG3′， 下 游 5′CGGTTCAGGTACTCAGTCATCC3′；Caspase3上 游5′CATGGAAGCGAATCAATGGACT3′， 下 游 5′CTGTACCAGACCGAGATG TCA3′；GAPDH上游 5′ATGGGCAGCCGTTAGGAAAGC3′， 下 游 5′CCTGGAAGATGGTGATGGGATT3′，所有引物均由上海Invitrogen生物工程有限公司合成。

5．Western blotting檢測(cè)卵巢顆粒細(xì)胞中BMP7的蛋白表達(dá)水平：取4μl蛋白上樣緩沖液與20μl卵泡液混合，于100℃水中煮沸10 min。隨后采用SDS PAGE膠對(duì)顆粒細(xì)胞中的蛋白進(jìn)行電泳分離，采用半干轉(zhuǎn)膜，用5%的牛奶封閉液對(duì)PVDF膜進(jìn)行封閉 1 h，隨后加入 BMP7的多克隆一抗（Proteintech公司）于4℃搖床孵育過(guò)夜。辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)二抗（康為世紀(jì)）孵育2 h后，加入化學(xué)發(fā)光劑曝光。各組以βactin為研究?jī)?nèi)參，比較各組卵泡液中蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

6．流式細(xì)胞儀檢測(cè)顆粒細(xì)胞凋亡率：用PBS將顆粒細(xì)胞洗滌3次后，將顆粒細(xì)胞懸液的深度調(diào)整到1×106個(gè)／m l，隨后取1 ml顆粒細(xì)胞懸液經(jīng)1 000 r／min離心10 min，去PBS后垂直加入預(yù)冷的70%乙醇中固定1～2 h。經(jīng)離心將固定液棄去，于3 ml PBS中重懸 5 min，再經(jīng) 1 000 r／min離心5 min，棄去 PBS，加入碘化丙啶（propidium iodide，PI，100μg／ml）于4℃避光 30 min上機(jī)。于 PI熒光的直方圖上，凋亡細(xì)胞于G1／G0期會(huì)出現(xiàn)一個(gè)亞二倍體峰，其所占樣本數(shù)的比例即為顆粒細(xì)胞凋亡率。

7．統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用SPSS 170統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料用（珋x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料用率（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)。p＜005為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、兩組一般參數(shù)及用藥情況比較

兩組腰臀比（waist hip ratio，WHR）及超排天數(shù)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；PCOS組年齡、FSH及Gn用量均低于對(duì)照組，而B(niǎo)MI、LH、E2、T值均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表1。

表1 兩組一般參數(shù)及用藥比較

二、兩組間顆粒細(xì)胞凋亡情況

兩組卵丘顆粒細(xì)胞固定后于流式細(xì)胞儀上檢測(cè)其凋亡率，PCOS患者顆粒細(xì)胞凋亡細(xì)胞的DNA含量為（3．51±0．23）顯著高于對(duì)照組（1．32±0．09），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖1）。

圖1 兩組間顆粒細(xì)胞凋亡情況

三、兩組 BMP7、Bcl2及 Caspase3 mRNA轉(zhuǎn)錄水平

PCOS組卵丘顆粒細(xì)胞內(nèi)Bcl2轉(zhuǎn)錄水平顯著降低對(duì)照組，Caspase3轉(zhuǎn)錄水平高與對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；BMP7 mRNA轉(zhuǎn)錄水平略低與對(duì)照組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表2和圖2。

表2 兩組BMP7、Bcl2及Caspase3 mRNA轉(zhuǎn)錄水平比較

圖2 兩組 BMP7、Bcl2及 Caspase3mRNA轉(zhuǎn)錄水平

四、兩組顆粒細(xì)胞內(nèi)BMP7蛋白的表達(dá)情況

PCOS組顆粒細(xì)胞內(nèi) BMP7表達(dá)為（036±004），低于對(duì)照組（079±017），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖3。

圖3 兩組卵泡液中卵源性蛋白BPM7的表達(dá)情況

討 論

PCOS是育齡期女性最常見(jiàn)的內(nèi)分泌紊亂性疾病，臨床主要表現(xiàn)為持續(xù)無(wú)排卵、高雄激素血癥及B超下卵巢呈多囊樣改變，其病理生理特點(diǎn)主要表現(xiàn)為卵泡發(fā)育障礙，然而迄今為止其病因及具體發(fā)病機(jī)制尚未探明［3］。目前認(rèn)為，PCOS患者卵泡發(fā)育障礙可能是異常內(nèi)分泌及旁分泌因子、代謝障礙及卵泡內(nèi)微環(huán)境改變共同作用的結(jié)果。其中卵泡內(nèi)微環(huán)境是影響卵母細(xì)胞的質(zhì)量及卵裂能力的關(guān)鍵因素之一，可通過(guò)自分泌及旁分泌形式產(chǎn)生的局部調(diào)節(jié)因子構(gòu)建一個(gè)不斷變化而又相對(duì)穩(wěn)定的微環(huán)境，進(jìn)而影響卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育，在PCOS的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。同時(shí)有研究表明，TGFβ超家族成員BMP7可通過(guò)旁分泌和自分泌的方式影響卵泡發(fā)育及促進(jìn)顆粒細(xì)胞生長(zhǎng)成熟、減緩顆粒細(xì)胞凋亡，抑制孕酮分泌等［4］。因此，對(duì)本中心IVF／ICSI助孕治療的女性患者取卵當(dāng)天顆粒細(xì)胞中BMP7進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)PCOS患者的顆粒細(xì)胞BMP7蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組降低而mRNA與對(duì)照組無(wú)差異，因此，推測(cè)BMP7的異常改變可能不是由轉(zhuǎn)錄水平引起。BMP7不僅是卵泡生成過(guò)程中重要的調(diào)控因子，且可通過(guò)旁分泌及自分泌作用參與卵丘擴(kuò)展，對(duì)于維持卵母細(xì)胞的最佳微環(huán)境及正常排卵、受精具有重要意義。

有研究表明，延遲成熟的卵母細(xì)胞與顆粒細(xì)胞的凋亡密切相關(guān)，且可對(duì)胚胎的發(fā)育潛能造成影響［5］。PCOS患者雙側(cè)卵巢存在大量小竇卵泡，然而其無(wú)法周期性形成成熟卵泡，進(jìn)而卵泡發(fā)育停滯，無(wú)優(yōu)勢(shì)卵泡排出，其機(jī)制可能與細(xì)胞凋亡調(diào)控異常相關(guān)［6］。Bcl2在細(xì)胞的凋亡進(jìn)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其主要通過(guò)阻止線粒體內(nèi)Ca2＋與細(xì)胞色素C的釋放作用，來(lái)發(fā)揮抗氧化作用進(jìn)而抑制細(xì)胞的凋亡。Caspase3主要通過(guò)破壞DNA修復(fù)及操作基因整性來(lái)引發(fā)細(xì)胞凋亡，且該進(jìn)程會(huì)被 Bcl2阻斷［7］。同時(shí)有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，BMP7可通過(guò)抑制Caspase3及上調(diào)Bcl2的表達(dá)來(lái)抑制線粒體凋亡途徑，進(jìn)而對(duì)損傷組織細(xì)胞起到保護(hù)作用［8］。然而，PCOS患者體內(nèi)BMP7的異常表達(dá)是否與其體內(nèi)凋亡相關(guān)因子的紊亂相關(guān)，目前較少研究。本研究通過(guò)對(duì)顆粒細(xì)胞凋亡率的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，PCOS患者的凋亡率較對(duì)照組顯著增高，且凋亡相關(guān)基因Bcl2表達(dá)下調(diào)而Caspase3表達(dá)顯著增高。同時(shí)，另有研究報(bào)道，BMP7能刺激大鼠顆粒細(xì)胞內(nèi)DNA的合成，抑制含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白酶激活的脫氧核糖核酸酶的釋放以減緩顆粒細(xì)胞凋亡［9］。由此可以推斷，在PCOS患者體內(nèi)存在BMP7信號(hào)通路的異常，而此通路的異?？赡芘c顆粒細(xì)胞增殖存在一定的相關(guān)性。

綜上所述，BMP7可于人的卵丘顆粒細(xì)胞中檢測(cè)到，且于PCOS患者卵泡液中表達(dá)量顯著降低，BMP7的異常表達(dá)可能是引發(fā)PCOS患者卵母細(xì)胞成熟障礙及胚胎發(fā)育潛能降低的重要因素。同時(shí)驗(yàn)證了PCOS患者顆粒細(xì)胞凋亡率的增加及凋亡調(diào)控蛋白的異常改變，說(shuō)明BMP7的異常改變與PCOS的發(fā)病有一定的關(guān)系，且參與了卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡過(guò)程，但要確切知道引發(fā)BMP7蛋白水平改變的原因需從表觀遺傳學(xué)角度進(jìn)一步進(jìn)行研究。

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