龐璐陽 潘五九 王偉明

（黑龍江省中醫(yī)藥科學院·哈爾濱 150036）

槐角Fructus sophorae 為豆科植物槐Sophora japonica L．的果實，多用于腸熱便血、痔腫出血，肝熱頭痛、眩暈目赤［1］的治療，隨著研究的逐步深入，近年來發(fā)現(xiàn)槐角中的黃酮類化合物多達27種，種類和含量多于銀杏仁，異黃酮總含量高達29.58g·kg-1，是大豆的18倍［2］，鑒于異黃酮類化合物具有雌激素樣活性，本課題研究出了一種槐角新藥，專門治療女性泌尿生殖道萎縮的栓劑，可避免長期應用化學雌激素藥物的致癌風險［3］；黃酮類化合物具有降血壓、抗生育和抗癌等藥理作用?；诖瞬⒄障嚓P文獻［4-5］采用正交試驗設計法，優(yōu)選槐角中總黃酮的最佳提取工藝，為新藥的制備提供參考。

1　實驗儀器與材料

1.1　儀器

紫外可見分光光度計（Lambda 563，PerkinElmer）電子天平（BSA224S-CW，德國奧多利斯）sartorius電子分析天平（BP211D，德國奧多利斯）超聲波清洗器（KQ-300DB，昆山市超聲儀器有限公司）電子恒溫水浴鍋（HWS26型，上海-恒科技有限公司）

1.2　材料

蘆丁標準品（中國藥品生物制品檢定所，批號100080-200707）槐角藥材均由專業(yè)人員采購，并經(jīng)我院王偉明研究員鑒定為槐角藥材。

2　方法與結果

2.1　紫外分光光度法測定

2.1.1標準曲線的繪制 精密稱取蘆丁標準品5.31mg，用60%乙醇定容于25mL容量瓶，濃度為0.531mg·mL-1的標準溶液。分別精密吸取0.20，0.40，0.60，0.801.00，1.20，1.40，1.60mL標準溶液于10mL容量瓶，分別加入1.80，1.601.40，1.20，1.00，0.80，0.60，0.40依次加入0.50mL的5%NaNO3溶液，0.50mL的10%Al(NO3)3溶液，4.00mL的4%NaOH溶液，每次添加中靜置6min，最后用60%乙醇定容，15min后進行測量。對溶液進行全波長掃描，在520nm處有最大吸收波長。

2.1.2標準曲線 以吸光度Y對濃度X進行線性回歸，標準曲線方程為Y=11.364X+0.0214，R=0.9997，線性范圍為 0.01062-0.08496mg·mL-1。見圖2-1。

圖2-1 總黃酮標準曲線Fig.2-1 The standard curve of flavonoids

2.2　提取條件的選擇

2.2.1單因素考察

2.2.1.1提取方法的選擇精確稱取槐角粉末1.00g，選取70%乙醇溶液、料液比1:10（W/V），1.0h，提取1次，考察超聲波提取法，乙醇回流法對提取總黃酮含量的影響。提取液過濾，濃縮蒸干，用70%乙醇定容于10mL容量瓶。采用亞硝酸鈉顯色法在紫外可見分光光度計下測定溶液吸光度值，計算總黃酮含量及提取率。結果見表2-1，由此可知水浴回流法提取率高于超聲波提取法，故選取水浴回流法為提取方法。

表2-1 不同提取方法的總黃酮提取率Tab.2-1 The yield of flavonoids with different extraction processes

2.2.1.2提取次數(shù)的選擇 精確稱取槐角粉末1.00g，選取70%乙醇溶液、料液比1:10（W/V），水浴回流法提取1.0h，考察提取1次，2次，3次對提取總黃酮含量的影響。提取液過濾，濾液合并，濃縮蒸干，用70%乙醇定容于10mL容量瓶。采用亞硝酸鈉顯色法在紫外可見分光光度計下測定溶液吸光度值，計算總黃酮含量及提取率。結果見表2-2，由此可知，提取3次提取率高于其他的提取次數(shù)，故選取3次為提取次數(shù)。

表2-2 不同提取次數(shù)的總黃酮提取率Tab.2-2 The yields of flavonoids with different extraction times

2.2.2總黃酮提取工藝正交試驗 采用正交試驗方法，優(yōu)化總黃酮提取工藝。選擇不同溶劑濃度、料液比、提取時間，進行三因素三水平的正交試驗。試驗因素表如下。

表2-3 L9（33）因素水平表Table 2-3 L9（33）factor levels

采用亞硝酸鈉顯色法在紫外可見分光光度計下測定溶液吸光度值，計算總黃酮含量及提取率，結果見表2-4。方差分析見表2-5。

表2-4 總黃酮提取工藝正交結果表Table2-4 Resultand analysis of flavonoids extraction process in orthoganol test

L9（33）正交試驗結果421210.95627.39%522111.29228.23%623310.10025.28%731310.94027.35%832111.38028.45%933211.36428.41%K126.7625.9726.62 K226.9728.8528.55 K328.0726.9826.63 R 1.312.881.93

表 2-5 正交結果方差分析表Tab.2-5 variance analysis of orthogonal results

由此可以得出，各因素對槐角總黃酮提取率影響大小的順序為B＞C＞A，因素B提取時間的水平改變對提取率的影響具有顯著的影響，其最佳水平組合為B2C2A3，按此工藝進行驗證試驗結果為總黃酮提取率為33.203%，大于正交試驗中的任一結果，故槐角總黃酮提取最佳工藝為：以70%乙醇溶液為提取劑，料液比為1:10（W/V），水浴回流法提取3次，每次60min。

2.3　驗證試驗

為進一步確定優(yōu)化工藝的可靠性，選取3份藥材，每份20g，按照上述篩選最佳工藝B2C2A3進行提取，測定方法同上。結果見表2-9。結果表明此最佳工藝合理，并且也具有穩(wěn)定性。

表2-5 驗證結果Tab2-5 Verification results

2.4　不同產(chǎn)地總黃酮的含量測定

2.4.1藥材來源 選取河北唐山、北京、新疆、遼寧大連四個產(chǎn)地的為測試樣品。

2.4.2總黃酮的含量測定 依據(jù)上述篩查的最佳提取工藝進行槐角藥材總黃酮的提取，并且按照相同的方法進行總黃酮的含量測定，結果如下表2-6.

表2-6 不同產(chǎn)地槐角總黃酮含量Tab2-10 The content of total flavonoids in Sophora japonica from different habitats

2.5　結論

（1）通過正交試驗最終確定槐角總黃酮最佳提取工藝為：以70%乙醇溶液為提取劑，料液比為1:10（W/V），水浴回流法提取3次，每次60min。（2）本實驗在提取溶劑的選擇上，主要選取的是實驗室易得、成本低且毒副作用小的乙醇，考察不同濃度對槐角總黃酮提取率的影響。該工藝符合工業(yè)化生產(chǎn)要求，為開發(fā)槐角新藥奠定了基礎。（3）通過測定不同產(chǎn)地的槐角總黃酮含量可知河北的最優(yōu)，北京的最差，這可能是由于當?shù)氐耐寥罈l件，土質(zhì)酸堿性、氣候條件有關，但這也有待進一步研究分析。

[1] ChP(中國藥典)[S].2015.VolⅠ(一部):560.

[2] 陳翔，鄭國平，于治國.一測多評法測定槐角中異黃酮類成分的含量[J].藥物分析雜志，2013，33(11):1904-1909.

[3] 王偉明，潘五九.一種治療女性泌尿生殖道萎縮的栓劑及其制備方法:中國，CN201610915612.2[p].2017-03-08.

[4] 韋華梅，閆騰蛟，林宣沛，王劍波，等.正交試驗優(yōu)選槐角總黃酮的提取工藝及不同來源槐角中總黃酮的含量測定[J].陜西中醫(yī)，2011，32（9）：1231-1233.

[5] 張蕓蘭，王文淵，等.正交設計法優(yōu)選杜鵑花中總黃酮的提取工藝[J].廣州化工，2009，37（3）：134-138.