陳 俊， 馬雨東

(江蘇省南通大學附屬醫(yī)院輸血科， 江蘇 南通 226000)

探討RhD陰性表型中個體D基因多態(tài)性研究

陳 俊， 馬雨東

(江蘇省南通大學附屬醫(yī)院輸血科， 江蘇 南通 226000)

目的：探討RhD陰性表型中個體D基因的多態(tài)性。方法：隨機抽取2014年11月至2015年10月采集的135例無親緣關系的RhD陰性血液樣本作為研究對象。采用抗人球蛋白試驗(又稱Coombs試驗)來檢測RhD陰性表型個體，并運用序列特異引物引導的PCR反應(簡稱PCR-SSP方法)對RhD陰性表型中個體基因結構特點進行分析與統(tǒng)計。結果：135例經Coombs試驗檢測為陰性表型個體中，檢測結果顯示為外顯子完全缺失有75例，占比55.56%(75/135)，外顯子部分缺失29例，占比21.48%(29/135)，外顯子完整31例，占比22.96%(31/135)；采用PCR-SSP法進行基因分型，RHD基因完整中RhD(1227A)占比16.30%(22/135)，弱D15型占比0.74%(1/135)，RHD陽性占比5.19%(7/135)；檢測RHD基因部分缺失中RHD-CE(2-9)-D占比5.93%(8/135)，DVa(Has)占比0.741%(1/135)，DVIⅢ占比0.74%(1/135)。結論：我國RhD陰性人群的RhD基因基礎結構呈現多態(tài)性特征，且不同地區(qū)的人群有著相同的Rh血型遺背景，今后可以嘗試采用血清學與基因分型聯合方法檢測RhD陰性中的D抗原。

RhD陰性； 個體D基因； 多態(tài)性

Rh血型包括54種抗原抗體系統(tǒng)，而與臨床醫(yī)療有密切聯系的有5種，它們是。相對于其他4種抗原，D抗原具有較強的免疫原性，因此D抗原是臨床上最重要的抗原體。目前，有許多國內外研究表明，具有種族差異的血液在Coombs試驗中檢測為RhD陰性表型個體中仍發(fā)現RhD基因，表明RhD陰性個體因種族不同而有所差異，同時具有基因多態(tài)性特征[1]。如果人體血液紅細胞中包含Rh凝集原，則是Rh陽性血，不包含Rh凝集原，則是Rh陰性血。這使得紅細胞A、B、O和AB四種血型又分別被一分為二地劃分為Rh陽性血與Rh陰性血。隨著對Rh血型的研究不斷深入，發(fā)現Rh血型是人體紅細胞血型中最復雜的一個血型系統(tǒng)。據有關研究表明，99.7%的中國漢族及大部分少數民族人血液屬于Rh陽性血[2]。在我國，僅有3‰～4‰的人群血液屬于RH陰性血型。因此RH陰性血型被稱為“熊貓血”，是一種非常罕見的血型。Rh陰性血型的發(fā)現，有利于醫(yī)學上更加科學地開展輸血工作。現隨機抽取2014年11月至2015年10月我血站中心采集的135例無親緣關系的RhD陰性血液樣本作為研究對象，探討RhD陰性表型中個體D基因的多態(tài)性。具體研究報道如下。

1 資料與方法

1.1 血樣資料:隨機抽取2014年11月至2015年10月我血站中心采集的135例無親緣關系的RhD陰性血液樣本作為研究對象，血液樣本10mL/份，獻血自愿者中女55例，男80例，志愿者年齡19～51歲，平均年齡(35±1.06)歲。

1.2 方 法

1.2.1 血清學方法:對135例RhD陰性血液樣本進行Coombs試驗。采用混合抗試劑對RhD陰性血液樣本進行篩選，采用三種不同廠家提供的抗血清試劑與樣本抗血清作對比，通過Coombs試驗、乙醚放散試驗將部分D、Del及弱D等樣本剔除，從而檢測出真正的RhD血液樣本。

1.2.2 DNA制備:運用DNA電泳檢測法來制備血樣基因組的DNA。先完成1%濃度的瓊脂糖凝膠板的制備，再進行基因組的DNA電泳實驗，接著使用瓊脂糖凝膠電泳分離DNA，然后采用基因組的DNA提取試劑盒(由北京宜科思源科技有限公司提供，貨號：D3471-00)從所選的RhD血樣標本中制備基因組的DNA，操作步驟嚴格按照試劑盒的說明書來進行。

1.2.3 PCR-SSP法基因分型:采用RhD基因檢測試劑盒(由北京宜科思源科技有限公司提供，貨號：D4352-08)對RhD陰性表型中個體基因結構特點進行檢測與分析，檢測RhD陰性等位基因的構成。PCR產物經電泳分離，銀染后呈現出不同的階梯狀擴增片段圖譜。采用凝膠成像儀觀察PCR產物的圖譜特征。

1.3 評定標準:采用Coombs試驗檢測并統(tǒng)計RhD陰性個體中外顯子完全缺失、外顯子部分缺失以及外顯子完整的例數；采用PCR-SSP法檢測并統(tǒng)計RhD陰性個體中外顯子部分缺失與外顯子完整的等位基因的分布種類。

2 結 果

2.1 RhD陰性表型個體表現:135例RhD陰性血液樣本經Coombs試驗確認為RhD陰性個體中檢測結果顯示為外顯子完全缺失75例，占總數比例55.56%(75/135)，外顯子部分缺29例，占總數比例21.48%(29/135)，外顯子完整,31例，占總數比例22.96%(31/135)。具體如表1所示。

表1 RhD陰性表型個體情況

2.2 RhD陰性等位基因構成情況:采用PCR-SSP法進行基因分型，檢測結果顯示RHD基因完整中RhD(1227A)22例，占總數比例16.30%(22/135)，弱D15型1例，占總數比例0.74%(1/135)，RHD陽性7例，占總數比例5.19%；檢測RHD基因部分缺失中RHD-CE(2-9)-D8例，占總數比例5.93%(8/135)，DVa(Has)1例，占總數比例0.741%(1/135)，DVIⅢ1例，占總數比例0.74%(1/135)。具體如表2所示。

表2 RhD陰性等位基因構成情況

3 討 論

最早的研究提示， RhD陰性個體中缺失RHD基因，而RhD陽性個體中存在RHD基因[3]。但隨著檢測技術的進步與研究理論的發(fā)展，有學者研究發(fā)現，RhD陰性可能包含多種等位基因，其具有多態(tài)性特點，并因種族差異而呈現不同的遺傳背景。以高加索人為代表的大部分歐美人種，其RhD陰性個體均表現為RHD基因完全缺失。有學者對RhD陰性表型為的3名澳大利人進行研究，發(fā)現存在三種情況，其中1名完全缺失RHD基因，1名部分缺失RHD基因，另1名有著完整的RHD基因[4]。另有學者對非洲人種的Rh血型進行研究發(fā)現，其中部分非洲人中存在RHD假基因，包含RHD假基因的陰性個體會執(zhí)行對密碼子的抑制，從而致使RHD基無法完成轉變。此外還在部分非洲人種的RhD陰性中發(fā)現RHD-CE-D等位基因，這屬于雜交基因。據國外研究報道，除了在非洲黑人種的RhD陰性中發(fā)現RHD-CE-D雜交位基因外，在對巴西RhD陰性個體進行相關研究時，同樣在巴西RhD陰性個體中發(fā)現RHD假基因與RHD-CE-D雜交位基因，此外，還有部分巴西RhD陰性個體是RHD基因完全缺失的[5]。從以上國外研究報道可以發(fā)現，RhD陰性基因具有多態(tài)性特點，并因種族差異而呈現不同的遺傳背景。

通過本研究發(fā)現，135例RhD陰性血液樣本經Coombs試驗確認為RhD陰性表型個體中，顯示完全缺失D基因75例，占總數比例55.56%，顯示部分缺失D基因29例，占總數比例21.48%，顯示D基因完整31例，占總數比例22.96%，這與我國福建、廣東等地的RhD陰性血型研究報道結果相似。RHD基因完整中RhD(1227A)22例，占總數比例16.30%(22/135)，弱D15型1例，占總數比例0.74%(1/135)，RHD陽性7例，占總數比例5.19%；檢測RHD基因部分缺失中RHD-CE(2-9)-D8例，占總數比例5.93%(8/135)，DVa(Has)1例，占總數比例0.741%(1/135)，DVIⅢ1例，占總數比例0.74%(1/135)。有研究表明，我國人群中約有97%的RHD基因表現為RhD(1227A)突變，這有助于通過PCR-SSP法檢測RHD基的突變位置，所以PCR-SSP法基因分型將會成為今后檢測RhD(1227A)基因的重要手段。除了發(fā)現RhD(1227A)基因外，還發(fā)現了RHD陽性、弱D15型、DVa(Has)、DVI、RHD-CE(2-9)-D8等多種形態(tài)的基因結構。這與我國其他地區(qū)的有關報道較接近，說明我國不同地區(qū)的人群有著相同的Rh血型遺背景。實驗過程中有12例血液樣本暫時不能確定RhD陰性的基因結構，目前尚未明確具體原因，不過會在今后的工作中通過改善實驗操作或更換試劑盒重新進行檢測。

據有關研究報道，在對RhD陰性個體進行檢測時發(fā)現RhD基因，但這些RhD基因包含D基因卻不表現出D抗原特征[6]?，F推測出現這種現象的原因主要有兩個，其一是RhD陰性個體不是真正的RhD陰性，可能只是D抗原處于較弱勢態(tài)，由于受到乙醚放散試驗的限制而未能檢測出其真實的基因結構。本實驗也發(fā)現了7例RhD陰性個體顯示為RHD陽性的基因；其二可能是RHD基因發(fā)生核苷酸片段變更、缺失或增加而出現突變現象[7]。我國RhD陰性人群的基因結構呈現多態(tài)性特征，與歐美地區(qū)白種人的RhD陰性基因結構有著明顯的區(qū)別，說明用于檢測白種人RhD陰機制的基因定型試劑盒并不完全適用于中國人。若今后在采用PCR-SSP法基因分型檢測RhD陰性個體時出現不能確定的情況，則須通過確定RHD基因的排列順序來進一步確認是否存在弱D型、部分D型結構。RhD陰性血液發(fā)生輸血安全問題的主要原因是抗D基因具有較強的免疫原性。當RhD陰性血液接觸到Rh陽性血液時，會有部分RhD陰性個體對D抗原發(fā)生致敏反應，等到再次接觸到D抗原時就會出現溶血反應。如果RhD陰性孕婦之前有過輸血史或生育史，在妊娠時容易出現新生兒溶血，是因為母體是RhD陰性血，而胎兒是Rh陽性血，兩者血型不匹配，Rh血型D抗原則會引發(fā)新生兒溶血癥。鑒于臨床輸血關系到受血者的生命安全，因此臨床醫(yī)學上應對我國人群的RHD基因基礎結構進行更加深入的研究，從而建立起適合我國人群的基因分型架構。

[1] 閆芳,王全立.RhD陰性個體遺傳多態(tài)性與抗-D同種免疫關系研究[J].北京醫(yī)學,2014,4:314～316.

[2] 高勇,孟憲軍,胡金萍,等.徐州地區(qū)漢族RhD陰性人群RHD基因多態(tài)性研究[J].國際檢驗醫(yī)學雜志,2014,12:1571～1572.

[3] 余加宏,王成輝,張秀慧,等.蚌埠地區(qū)124例RhD陰性獻血者的RHCE表型及DEL型的分布與基因研究[J].中華全科醫(yī)學,2014,8:1306～1308.

[4] 楊波,呂運來,蘭炯采.洛陽地區(qū)回族人群RHD基因Rhesusboxes研究[J].中國輸血雜志,2014,9:904～906.

[5] 聶詠梅,周豪杰,李曉帆.RhDel表型與RHEC表型的相關性研究[J].熱帶醫(yī)學雜志,2013,2:175～177.

[6] 王志紅,肖鯤,任誠誠,吳文靜.洛陽地區(qū)無償獻血者Rh血型臨床相關高頻抗原分布調查[J].臨床血液學雜志(輸血與檢驗版),2013,4:553～556.

[7] 舒群峰.十堰市Rh弱D和/或部分D變異型血型血清學檢測結果分析[J].檢驗醫(yī)學,2015,10:1004～1007.

國家自然科學基金，(編號：81141056)

1006-6233(2017)02-0284-03

A 【doi】10.3969/j.issn.1006-6233.2017.02.033