林劍東+翁麗珍+郭志平+阮琰+黃明翔+陳曉紅

[摘要] 目的 探索醫(yī)院獲得性肺炎（HAP）相關(guān)蛋白飛行質(zhì)譜的表達(dá)特點(diǎn)。方法 方便選擇2014年7月—2015年6月期間于福建省福州肺科醫(yī)院接受血清蛋白質(zhì)飛行圖譜檢測(cè)的HAP（細(xì)菌性）患者58例與健康者31名作為研究對(duì)象，進(jìn)行血清蛋白飛行質(zhì)譜檢測(cè)，分析其相關(guān)蛋白峰值并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。 結(jié)果 對(duì)58例HAP（細(xì)菌性）患者與31名健康者的血清蛋白飛行質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)有4個(gè)蛋白峰（3 336.53、3 415.60、4 651.22、6 118.62 M/Z），比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。由此 4個(gè)差異蛋白峰構(gòu)成的診斷模型判別HAP的總有效率為98.88%（88/89），特異度為100.00%（31/31）、靈敏度為98.28%（57/58）、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為100.00%（57/57）、陰性預(yù)測(cè)值為96.88%（31/32）。結(jié)論 蛋白飛行質(zhì)譜技術(shù)具有方法簡(jiǎn)便、檢測(cè)快速，標(biāo)本用量少等優(yōu)點(diǎn)。該方法在HAP早期診斷方面具有一定價(jià)值，可能成為HAP早期診斷的輔助指標(biāo)，值得進(jìn)一步研究。

[關(guān)鍵詞] 蛋白飛行質(zhì)譜技術(shù)（SELDI-TOF-MS）；實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)；醫(yī)院獲得性肺炎；血清診斷

[中圖分類號(hào)] R5 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-0742（2017）01（c）-0004-04

Initial Research on Nosocomial Pneumonia Related Proteins Flight Mass Spectrometry Expression

LIN Jian-dong， WENG Li-zhen， GUO Zhi-ping， RUAN Yan， HUANG Ming-xiang， CHEN Xiao-hong

Department of Clinical tTeaching Tuberculosis， Fujian Medical University of Fuzhou Pulmonary Hospital， Fuzhou， Fujian Province， 350008 China

[Abstract] Objective To explore the expression features of nosocomial pneumonia related proteins flight mass spectrometry expression. Methods 58 cases of HAP patients receiving the serum proteins flight mass spectrometry in our hospital from July 2014 to June 2015 and 31 cases of healthy persons were convenient selected as the research objects and tested by the serum proteins flight mass spectrometry， and the related protein peak value was analyze and statistically processed. Results 4 protein peaks were found（3 336.53，3 415.60，4 651.22，6 118.62 M/Z）， and the difference had statistical significance（P<0.01）， and the effective rate， specificity degree， sensitivity degree， positive and negative predictive values were respectively 98.88%（88/89）， 100.00%（31/31）， 98.28%（57/58）， 100.00%（57/57） and 96.88%（31/32）. Conclusion The proteins flight mass spectrometry technology is simple and the rapid， which is of a certain value in the HAP early diagnosis， which can by the auxiliary index of HAP early diagnosis， and it is worth further research.

[Key words] SELDI-TOF-MS； Laboratory diagnosis technology； Nosocomial pneumonia； Serum diagnosis

肺部感染性疾?。ê?jiǎn)稱肺炎）是最常見的一種呼吸系疾病，而醫(yī)院獲得性肺（hospital-acquired pneumonia HAP）又是重癥病房中常見疾病，其病情重，病原體復(fù)雜，早期診斷比較困難，影響治療及預(yù)后。病原體診斷、針對(duì)性治療又是降低HAP病死率的關(guān)鍵。但是臨床工作中常常無法快速培養(yǎng)病原體，嚴(yán)重影響了HAP的治療。表面加強(qiáng)的激光解析電離化飛行—時(shí)間質(zhì)譜（Surface enhanced laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry， SELDI-TOF-MS）簡(jiǎn)稱蛋白飛行質(zhì)譜技術(shù)（SELDI-TOF-MS），是一種新型蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法。該技術(shù)是通過特定的化學(xué)表面結(jié)合蛋白質(zhì)分子，利用激光將其輻射成為離子。當(dāng)離子飛行于電場(chǎng)中，可以被檢測(cè)到，蛋白質(zhì)的類型及其含量需要表示為不同位置、強(qiáng)度的峰，進(jìn)而形成了蛋白飛行質(zhì)譜，通過對(duì)該圖譜進(jìn)行分析，能夠?qū)Ω尤?、?zhǔn)確的了解蛋白質(zhì)的組分和性質(zhì)，其對(duì)于多種疾病的診斷具有很高的參考價(jià)值。在臨床上開始得到廣泛的應(yīng)用[1-2]。該研究應(yīng)用具有方法簡(jiǎn)便、檢測(cè)快速，標(biāo)本用量少等優(yōu)點(diǎn)的蛋白飛行質(zhì)譜技術(shù)（SELDI-TOF-MS），方便選擇2014年7月—2015年6月期間于該院接受血清蛋白質(zhì)飛行圖譜檢測(cè)的58例HAP（細(xì)菌性）患者作為研究對(duì)象，選取同期接受檢查的31名健康者作為研究對(duì)象，分析兩組間的特異蛋白飛行質(zhì)譜，對(duì)比兩組受檢者的圖譜特點(diǎn)及其差異性，評(píng)價(jià)其對(duì)HAP（細(xì)菌性）的早期診斷率，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

方便選擇于該院接受血清蛋白質(zhì)飛行圖譜檢測(cè)的58例HAP（細(xì)菌性）患者和同期接受檢查的31名健康者作為研究對(duì)象，根據(jù)《肺炎診斷》（中華人民共和國(guó)衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)WS382-2012）標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行診斷[3]，排除糖尿病、精神病、癲癇、過敏性哮喘患者及妊娠、哺乳期婦女。HAP患者男性34例，女性24例，平均年齡為45.2歲。健康者男性18例，女性16例，平均年齡為44.7歲。兩組受檢者的基本資料對(duì)照均衡，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），可進(jìn)行對(duì)比分析。

1.2 影像資料

胸片及胸部CT提示有斑片狀陰影、空洞、肺不張、胸腔積液等表現(xiàn)。右肺6例、 右中葉3例，右下葉4例、右上下葉7例，右中下葉6例，左肺7例、左下葉5例、右上葉及左下葉3例、左上葉及右下葉7例；雙下葉10 例。

1.3 病原學(xué)資料

在58例患者中，送檢50例患者的痰液，用以培養(yǎng)致病菌，其中20例（40.00%）患者的痰液培養(yǎng)出細(xì)菌；經(jīng)支氣管鏡刷檢培養(yǎng)、肺泡灌洗、經(jīng)氣管內(nèi)吸引分泌物、胸水培養(yǎng)陽(yáng)性檢出率分別為51.72%（15/29）、33.48%（10/29）、50.00%（9/18）、33.33%（3/9）；血培養(yǎng)和痰涂片革蘭染色陽(yáng)性檢出率分別為21.68%（12/58）和91.38%（53/58）。各種方法致病菌培養(yǎng)中肺炎鏈球菌9例，銅綠假單胞菌11例，鮑曼不動(dòng)桿菌12例，肺炎克雷伯菌8例，流感嗜血桿菌3例，嗜麥芽窄食假單胞菌4例，大腸埃希菌7例，沙雷菌3例，金黃色葡萄球菌6例，耐甲氧西林金黃社葡萄球菌5例，洛非不動(dòng)桿菌1例。

1.4 方法

1.4.1 主要儀器及樣品準(zhǔn)備 選用CPCS（Ciphergen ProteinChip System）、PBS II/C型蛋白指紋圖譜儀以及WCX蛋白磁珠（WCX Magnetic Beads）。受檢者于清晨6 h接受靜脈采血2 mL，在4℃的環(huán)境下予以保存，經(jīng)離心處理后抽取上層血清并在-80℃的溫度條件下予以保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 步驟 血清樣品與裂解液混合，經(jīng)孵育加入緩沖液稀釋。在磁鐵上反復(fù)孵育、去上清液、緩沖液洗脫，最后均勻混合SPA飽和溶液，取1 μL使用于Au/Steel芯片，并風(fēng)干。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

使用ProteinChip System Ⅱc質(zhì)譜儀和Ciphergen ProteinChip 3.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的采集，蛋白質(zhì)相對(duì)含量及蛋白質(zhì)質(zhì)荷比數(shù)據(jù)則通過Biomarker Pattern 5.0軟件予以處理，進(jìn)而獲得蛋白質(zhì)圖譜，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和多峰分析，觀察是否出現(xiàn)差異蛋白峰表達(dá)，進(jìn)而判斷為陽(yáng)性（有差異蛋白峰的高表達(dá)或低表達(dá)）或陰性（無差異蛋白峰表達(dá)）。通過t和χ2檢驗(yàn)資料，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。根據(jù)計(jì)算 x、s、P值，建立診斷模型并評(píng)價(jià)檢測(cè)結(jié)果。

2 結(jié)果

經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在分子量為0～50 000 m/z的范圍內(nèi)對(duì)所繪制的蛋白飛行質(zhì)譜峰進(jìn)行分析比較，58例HAP（細(xì)菌性）患者及31名健康者血清中，共獲得138個(gè)差異表達(dá)蛋白。其中，發(fā)現(xiàn)由M/Z 3 336.53、3 415.60、4 651.22、6 118.62構(gòu)建的診斷模型可用于區(qū)分HAP（細(xì)菌性）患者與健康對(duì)照組，判別HAP的特異度為100.00%（31/31）、靈敏度為98.28%（57/58）、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為100.00%（57/57）、陰性預(yù)測(cè)值為96.88%（31/32）、總有效率為98.88%（88/89），見表1。與健康對(duì)照組相比，HAP（細(xì)菌性）患者血清中有2個(gè)蛋白質(zhì)M/Z 4 651.22、6 118.62表達(dá)上調(diào)，其蛋白含量高于健康者；2個(gè)蛋白質(zhì)M/Z 3 336.53、3 415.60表達(dá)則下調(diào)，蛋白含量低于健康者，見表2；M/Z 3 336.53蛋白質(zhì)譜圖代表，見圖1。

該組蛋白飛行質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)產(chǎn)生的診斷決策樹中共有5個(gè)終節(jié)點(diǎn)，見圖2：其中2、4終節(jié)點(diǎn)均為只包含HAP（細(xì)菌性）患者，共57例，滿足≤3.426（M3 336）（括號(hào)代表相應(yīng)蛋白質(zhì)相對(duì)含量，下同）及≤0.590（M4 651）為終節(jié)點(diǎn)4，滿足≤3.426（M3 336）、≤2.325（M3 415）及≤0.860（M6 118）為終節(jié)點(diǎn)2；終節(jié)點(diǎn)3、5為正常人，共30例，滿足≤3.426（M3 336）及≤2.325（M3 415）為終節(jié)點(diǎn)3，滿足≤3.426（M3 336）及≤0.590（M4 651）為終節(jié)點(diǎn)5。錯(cuò)誤分組率為1.12%。

3 討論

重癥監(jiān)護(hù)病房患者是醫(yī)院感染的高發(fā)人群[4]，患者病情危重、病程長(zhǎng)、抗菌素的廣泛長(zhǎng)期使用、各種侵入性操作和器械的應(yīng)用，使得醫(yī)院感染的發(fā)病率漸漸升高，其發(fā)生率約5～15例/1 000個(gè)床位日[5]，增加了患者的死亡率，延長(zhǎng)了住院時(shí)間[6]，在臨床中引起高度重視。

HAP是指患者入院48 h后發(fā)生的肺炎，主要是由于細(xì)菌、病毒、真菌等病原體所引起，其中以細(xì)菌最為常見，需要重點(diǎn)予以防控。由于HAP在臨床癥狀和X線或CT影像都無絕對(duì)的特征，病原學(xué)診斷率不高，顯然不利于HAP患者的臨床診斷和治療。

SELDI-TOF-MS技術(shù)在國(guó)內(nèi)、外許多相關(guān)領(lǐng)域得到應(yīng)用，經(jīng)多項(xiàng)報(bào)道研究以及臨床實(shí)踐驗(yàn)證，其對(duì)于肝癌、乳腺癌、前列腺癌以及肺癌等腫瘤疾病的臨床診治中得到有效的應(yīng)用，為相關(guān)疾病的早期診療提供了重要的參考。我國(guó)曾應(yīng)用該技術(shù)對(duì)嚴(yán)重急性呼吸綜合征（Severe Acute Respiratory Syndromes SARS）的診斷。SELDI-TOF-MS能快速分析樣品血清中蛋白飛行質(zhì)譜特點(diǎn)，篩選SARS的診斷性標(biāo)記物，為早期診斷提供了依據(jù)。Kang等[7]研究了SARS和甲型流行性感冒、肺炎、肺癌患者及健康者之間的差異蛋白的表達(dá)特點(diǎn)，研究結(jié)果顯示診斷SARS的敏感性和特異性分別為97.30%和99.40%。我國(guó)北京協(xié)和醫(yī)院等單位研究得出的《SARS蛋白質(zhì)質(zhì)譜指紋圖譜及其臨床早期診斷》報(bào)告是當(dāng)前國(guó)內(nèi)最為權(quán)威的研究成果，其獲得了來自世界衛(wèi)生組織權(quán)威專家的肯定和認(rèn)可。

該研究選取HAP（細(xì)菌性）患者58例與健康者31名作為研究對(duì)象，經(jīng)血清蛋白飛行質(zhì)譜的檢測(cè)，觀察其血清蛋白峰的差異，進(jìn)而篩選出能達(dá)到最佳診斷效果的蛋白質(zhì)峰組合并建立診斷模型。結(jié)果顯示：質(zhì)荷比為3 336.53、3 415.60、4 651.22、6 118.62 M/Z的4個(gè)蛋白峰所構(gòu)建的診斷模型能較好的區(qū)分HAP（細(xì)菌性），其判別HAP（細(xì)菌性）的特異度為100.00%、靈敏度為98.28%、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為100.00%、陰性預(yù)測(cè)值為96.88%、總有效率為98.88%。2個(gè)蛋白質(zhì)M/Z 4 651.22、6 118.62蛋白含量高于健康者；2個(gè)蛋白質(zhì)M/Z 3 336.53、3 415.60蛋白含量低于健康者。篩選出的差異表達(dá)蛋白質(zhì)將有可能成為新的候選生物標(biāo)志物。

有國(guó)內(nèi)專家[8]應(yīng)用蛋白質(zhì)譜建立活動(dòng)性肺結(jié)核病的血清診斷模型，鑒別肺炎、慢性支氣管炎等非結(jié)核疾病的靈敏度96.90%，特異性為97.80%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別為97.70%和97.10%，總準(zhǔn)確率為97.30%。

翁麗珍等[9]對(duì)社區(qū)獲得性細(xì)菌性肺炎的蛋白飛行質(zhì)譜表達(dá)特點(diǎn)進(jìn)行了相關(guān)研究提示以3個(gè)蛋白峰（1 028.49、4 796.56、7 564.77 M/Z）在社區(qū)獲得性細(xì)菌性肺炎患者血清中表達(dá)有顯著性差異，在鑒別診斷社區(qū)獲得性細(xì)菌性肺炎的總有效率達(dá)95.80%，特異度為92.30%，靈敏度為100.00%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為91.70%，陰性預(yù)測(cè)值為100.00%。

因此，研究認(rèn)為SELDI-TOF-MS在HAP（細(xì)菌性）早期診斷方面具有一定價(jià)值，可能成為HAP早期診斷的輔助指標(biāo)，值得進(jìn)一步研究。該研究增加研究病例來深入進(jìn)行研究，以提升檢測(cè)的準(zhǔn)確性和可靠性，建立完善HAP蛋白飛行質(zhì)譜庫(kù)，為相關(guān)疾病的治療提供重要的參考依據(jù)。

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