劉建壘，邢效娟，周 瑞，景 浩

（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083）

牛血清白蛋白與槲皮素及花青素相互作用方式及其納米顆粒特征的比較

劉建壘，邢效娟，周 瑞，景 浩*

（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083）

實(shí)驗(yàn)比較了牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）與脂溶性小分子槲皮素（quercetin，QUE）和水溶性花青素（anthocyanin，ACN）相互作用方式及其納米顆粒的特征。QUE對(duì)BSA熒光猝滅作用為靜態(tài)猝滅方式（低濃度），但在較高濃度時(shí)為靜態(tài)與動(dòng)態(tài)并存的復(fù)合猝滅方式，兩者的相互作用力為疏水作用力；ACN對(duì)BSA的熒光猝滅程度小于QUE對(duì)BSA的，為靜態(tài)猝滅方式，相互作用力為靜電作用力。BSA與QUE的結(jié)合常數(shù)大于BSA與ACN的結(jié)合常數(shù)。BSA與QUE或ACN相互作用可形成納米顆粒，其大小分別為42.5 nm和53.7 nm，ζ-電勢(shì)分別為－25.64 mV和－21.50 mV。1 mol BSA分子可分別與8 mol QUE和10 mol ACN結(jié)合。BSA與QUE形成的納米顆粒（BSA-QUE）粒徑較BSA與ACN（BSA-ACN）的小，且穩(wěn)定性較高。BSA-QUE對(duì)DPPH自由基和ABTS＋·清除率均高于BSA-ACN。

牛血清白蛋白；槲皮素；花青素；相互作用；納米顆粒

牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）是牛血清中最主要的蛋白質(zhì)，其來(lái)源豐富，價(jià)格便宜，在水中溶解性較好，容易純化，具有較好的小分子物質(zhì)結(jié)合特性[1]。BSA是單鏈蛋白質(zhì)，由583 個(gè)氨基酸殘基組成，含3 個(gè)結(jié)構(gòu)相似的結(jié)構(gòu)域（domain Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ），每個(gè)結(jié)構(gòu)域包含2個(gè)亞結(jié)構(gòu)域（ⅠA、ⅠB，ⅡA、ⅡB，ⅢA、ⅢB），它們聚集在一起形成了一個(gè)不對(duì)稱(chēng)的心形結(jié)構(gòu)，心形結(jié)構(gòu)的內(nèi)部集中了所有的疏水性氨基酸，構(gòu)成了疏水性?xún)?nèi)核和親水性外殼，這使BSA與親水性和疏水性小分子物質(zhì)均可發(fā)生相互作用[2-3]。

槲皮素（quercetin，QUE）和花青素（anthocyanin，ACN）廣泛存在于水果、蔬菜和谷物中。QUE又稱(chēng)五羥基黃酮，在A、B和C 3 個(gè)芳香環(huán)骨架上的3、5、7、3’位和4’位上的氫原子被羥基取代（圖1A）。由于槲皮素為平面型分子，分子堆砌較緊密，分子間引力較大，不易被溶劑或溶質(zhì)分散，所以槲皮素的水溶性較差，在水中的溶解度約1?μg/mL，在模擬胃液中的溶解度為5.5?μg/mL，在模擬腸液中的溶解度為28.9?μg/mL[4-5]；也不溶于乙醚、苯、氯仿、石油醚等；但可溶于冰醋酸、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、吡啶、丙酮等溶劑[6]。ACN屬于水溶性多酚類(lèi)化合物，它的基本結(jié)構(gòu)為2-苯基苯并吡喃陽(yáng)離子，根據(jù)3’位及5’位的取代基不同，可將ACN分為6 種：錦葵素類(lèi)、牽牛素類(lèi)、芍藥素類(lèi)、天竺葵素類(lèi)、飛燕草素類(lèi)和矢車(chē)菊素類(lèi)[7]，其中矢車(chē)菊素-3-O-葡萄糖苷最常見(jiàn)[8]（圖1B）。不同性質(zhì)的小分子化合物與BSA的相互作用方式不同[9]。如，在10%二甲基亞砜溶液中脂溶性的QUE對(duì)BSA的熒光有較強(qiáng)的猝滅作用，猝滅方式為靜態(tài)與動(dòng)態(tài)并存的復(fù)合方式，兩者的相互作用力為疏水作用力和氫鍵；而在10%二甲基亞砜溶液中水溶性的萊菔硫烷對(duì)BSA的熒光也有較強(qiáng)的猝滅作用，猝滅方式為靜態(tài)猝滅，兩者的相互作用力為氫鍵、范德華力和疏水作用力[10]。目前報(bào)道的BSA與小分子化合物相互作用的研究多為單一小分子或同性質(zhì)的小分子進(jìn)行比較；而對(duì)BSA與不同性質(zhì)的小分子化合物相互作用的比較缺乏研究。因此，本研究以QUE（脂溶性）和ACN（水溶性）為代表，采用熒光光譜法，比較研究BSA與生物活性小分子相互作用方式；采用動(dòng)態(tài)光散射法分析BSA與QUE及ACN納米顆粒的顆粒特性，并比較了相互作用后形成的納米顆粒的抗氧化活性。

圖 1 槲皮素（A）和矢車(chē)菊素-3-O-葡萄糖苷（B）結(jié)構(gòu)圖Fig. 1 Chemical structures of quercetin (A) and cyanidin-3-glucoside (B)

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

BSA（fraction V，純度≥98%，分子質(zhì)量66.43 ku）美國(guó)Amresco公司；QUE（色譜級(jí)，純度≥95%，相對(duì)分子質(zhì)量302.24） 美國(guó)Sigma公司；篤斯越橘花青素提取物（以多酚為主要成分，約占提取物的65%～66%，提取物還含有糖11.7%、水分12.2%、蛋白質(zhì)3.2%、灰分0.9%及油脂0.6%） 大興安嶺華野生物工程有限公司。篤斯越橘花青素提取物進(jìn)一步經(jīng)過(guò)XAD-7樹(shù)脂柱分離純化，得到純化的ACN，其中80.94%為矢車(chē)菊素-3-O-葡萄糖苷。

二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2,2’-聯(lián)氨-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid），ABTS）二銨鹽（均為分析純）美國(guó)Sigma公司；去離子水（deionized water，dH2O）北京科豐正業(yè)有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1800型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海美普達(dá)儀器有限公司；F-7000型熒光分光光度計(jì) 日本Hitachi公司；Nano-ZS90型納米粒度儀 英國(guó)Malvern Instruments公司；XB 220A型電子天平 瑞士Precisa Gravimetrics AG公司；QL-901型旋渦混合器 海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司；PHS-3C＋型酸度計(jì) 成都世紀(jì)方舟科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 BSA-QUE和BSA-ACN溶液的制備

用磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS，pH 7.4）配制濃度為1.5×10－4mol/L的BSA儲(chǔ)備液。用DMSO配制濃度為18×10－3mol/L的QUE母液，再用DMSO稀釋分別得到濃度為1.5×10－3、3.0×10－3、6.0×10－3、9.0×10－3、12.0×10－3、15.0×10－3mol/L的QUE儲(chǔ)備液。用dH2O配制濃度為18×10－3mol/L的ACN母液（此處為了計(jì)算方便，統(tǒng)一使用篤斯越橘中含量最高的矢車(chē)菊素-3-O-葡萄糖苷的相對(duì)分子質(zhì)量449.2作為ACN的近似相對(duì)分子質(zhì)量進(jìn)行處理），用dH2O稀釋分別得到濃度為1.5×10－3、3.0×10－3、6.0×10－3、9.0×10－3、12.0×10－3、15.0×10－3mol/L的ACN儲(chǔ)備液。

BSA-QUE和BSA-ACN復(fù)合物溶液的制備：在15 mL離心管中先加入8.9 mL PBS（pH 7.4），其次加入1 mL BSA儲(chǔ)備溶液，用旋渦混合器混1 min，最后分別加入0.1 mL不同濃度的QUE或ACN儲(chǔ)備液，用旋渦混合器混5 min，室溫條件下靜置待測(cè)。其中BSA的終濃度為1.5× 10－5mol/L；QUE或ACN的終濃度分別為0.0、1.5×10－5、3.0×10－5、6.0×10－5、9.0×10－5、12.0×10－5、15.0×10－5、18.0×10－5mol/L；QUE或ACN與BSA濃度比分別為0、1∶1、2∶1、4∶1、6∶1、8∶1、10∶1和12∶1。

1.3.2 熒光光譜測(cè)定

按照1.3.1節(jié)方法分別配制BSA-QUE和BSA-ACN復(fù)合物溶液并測(cè)定其熒光光譜，其中BSA的終濃度是1.5× 10－5mol/L，QUE及ACN的終濃度分別為0.0、1.5×10－5、3.0×10－5、6.0×10－5、9.0×10－5、12.0×10－5、15.0×10－5、18.0×10－5mol/L。準(zhǔn)確移取3.0 mL上述溶液于石英熒光池中（1 cm×1 cm），測(cè)定發(fā)射熒光光譜。激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為343 nm，狹縫分別為2 nm（激發(fā)）和5 nm（發(fā)射）；控制溶液溫度分別為25（298 K）、30（303 K）、35 ℃（308 K）。將熒光強(qiáng)度分別帶入Stern-Volmer方程（1）和對(duì)數(shù)方程（2）計(jì)算猝滅常數(shù)KSV、結(jié)合常數(shù)K和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n[11-12]。

式中：F0和F分別為QUE或ACN加入前后BSA的熒光強(qiáng)度；C為QUE或ACN的濃度/（mol/L）；KSV為動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)/（L/mol）。

根據(jù)熱力學(xué)參數(shù)之間的關(guān)系式（3）和（4）計(jì)算BSA與QUE或ACN相互作用過(guò)程中的吉布斯自由能ΔG/（kJ/mol）、焓變?chǔ)/（kJ/mol）和熵變?chǔ)/（J/（mol·K））[13]。

式中：K1和K2分別為對(duì)應(yīng)溫度條件下的結(jié)合常數(shù)/（L/mol）；T1和T2分別為不同溫度/K；R為理想氣體常數(shù)8.314 J/（mol?K）。

1.3.3 結(jié)合量的測(cè)定

BSA與QUE及ACN的結(jié)合量的測(cè)定采用Fang Ru等[14]的方法，通過(guò)鹽析法使體系中BSA納米顆粒沉淀析出，從而將結(jié)合在納米顆粒中的 QUE及ACN和未結(jié)合的 QUE及ACN分開(kāi)。制備BSA與QUE及ACN復(fù)合物，使QUE及ACN與BSA濃度比為0、2∶1、4∶1、6∶1、8∶1、10∶1、12∶1、14∶1、16∶1、18∶1、20∶1、22∶1、24∶1；BSA的終濃度為1.5×10－5mol/L；QUE及ACN的終濃度分別是0、3×10－5、6×10－5、9×10－5、12×10－5、15×10－5、18×10－5、21×10－5、24×10－5、27×10－5、30×10－5、33×10－5mol/L和36×10－5mol/L。在配制的納米顆粒溶液（10 mL）中，緩慢加入硫酸銨粉末并不斷攪拌，直至體系中有未溶解的硫酸銨；靜置20 min，然后取出上清液，4 ℃條件下，10 000×g離心30 min。取上清液，用紫外-可見(jiàn)分光光度法測(cè)定其吸光度，然后根據(jù)QUE及ACN的濃度與吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出游離QUE及ACN的濃度。用總的QUE及ACN的濃度減去游離QUE及ACN的濃度可計(jì)算得到每摩爾BSA結(jié)合QUE或ACN的物質(zhì)的量（mol QUE/mol BSA或mol ACN/mol BSA）。

1.3.4 粒徑及ζ-電勢(shì)測(cè)定

按照1.3.1節(jié)方法分別配制復(fù)合物BSA-QUE和BSAACN，其中BSA的終濃度是1.5×10－5mol/L，QUE及ACN的終濃度為1.5×10－4mol/L。測(cè)量溫度25 ℃，平衡時(shí)間120 s，散射角90°，每個(gè)樣品測(cè)3 次。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)通過(guò)馬爾文儀器自帶軟件Zetasizer軟件進(jìn)行分析，得到粒徑、多分散系數(shù)（polydispersity index，PdI）和ζ-電勢(shì)。

1.3.5 自由基清除率的測(cè)定

在BSA的濃度為1.5×10－5mol/L，QUE及ACN的濃度均為1.5×10－4mol/L條件下，比較BSA、QUE、ACN、BSA-QUE及BSA-ACN對(duì)DPPH自由基和ABTS＋·的清除率大小。

1.3.5.1 DPPH自由基清除率的測(cè)定

DPPH自由基清除率的檢測(cè)參照Dong Xueyan等[15]的方法。配制2.5 mmol/L DPPH的無(wú)水乙醇儲(chǔ)備液，4 ℃避光保存?zhèn)溆?。使用時(shí)再用無(wú)水乙醇稀釋?zhuān)苽?.15 mmol/L的DPPH工作液。取96 孔測(cè)試板，每孔依次加入樣品溶液（15?μL）和0.05 mmol/L Tris-HCl （pH 7.4，60?μL）以及DPPH工作液（150?μL）（Asample）。以PBS加DPPH工作液為空白對(duì)照（Ablank），同時(shí)用樣品加無(wú)水乙醇溶液作為樣品顏色參比（Acontrol）。振蕩混合均勻，避光室溫條件下放置30 min后，用酶標(biāo)儀測(cè)定520 nm波長(zhǎng)處的吸光度。依據(jù)公式（5）計(jì)算DPPH自由基清除率。1.3.5.2 ABTS＋·清除率的測(cè)定

ABTS＋·的檢測(cè)參照Dong Xueyan等[15]的方法。配制140 mmol/L ABTS儲(chǔ)存液，放在－20 ℃避光保存?zhèn)溆?。使用時(shí)，再用dH2O稀釋?zhuān)苽?4 mmol/L的ABTS工作液。將ABTS工作液與4.9 mmol/L的過(guò)硫酸鉀溶液充分混勻，使ABTS和過(guò)硫酸鉀終濃度分別為7 mmol/L和2.45 mmol/L。避光室溫條件下放置13 h。然后將其用dH2O稀釋至吸光度（630 nm波長(zhǎng)處）為0.50左右。取96 孔測(cè)試板，每孔依次加入樣品溶液（10?μL）和ABTS稀釋液（90?μL）（Asample）。以PBS加ABTS工作液為空白對(duì)照（Ablank），同時(shí)用樣品加dH2O作為樣品顏色參比（Acontrol）。振蕩混合均勻，室溫放置4 min后，用酶標(biāo)儀測(cè)定630 nm波長(zhǎng)處的吸光度。ABTS＋·清除率也按照公式（5）進(jìn)行。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 BSA-QUE及BSA-ACN的熒光猝滅光譜

圖 2 BSA-QUE（A）和BSA-ACN（B）的熒光光譜Fig. 2 Effect of QUE (A) and ACN (B) on the fl uorescence emission spectrum of BSA

隨著QUE濃度的增加，復(fù)合物溶液熒光強(qiáng)度逐漸降低，且熒光峰從343 nm移動(dòng)到340 nm（圖2A）。隨著ACN濃度的增加，BSA的熒光強(qiáng)度也逐漸降低，且熒光峰的位置（343 nm）沒(méi)有發(fā)生變化（圖2B）。當(dāng)QUE和ACN與BSA濃度比為12∶1時(shí)，QUE可以幾乎完全猝滅復(fù)合物溶液的熒光，而ACN對(duì)復(fù)合物溶液的熒光猝滅程度小。復(fù)合物溶液熒光強(qiáng)度減少，表明QUE和ACN與BSA之間存在相互作用。BSA的熒光主要由其中的色氨酸和酪氨酸殘基產(chǎn)生，酪氨酸和色氨酸的最大熒光發(fā)射波長(zhǎng)分別為304 nm和340 nm。因?yàn)樵?04 nm處未見(jiàn)熒光峰，只在343 nm處測(cè)定到熒光發(fā)射波峰，故此處的熒光變化主要反映BSA中色氨酸殘基的熒光變化[16]。Xiao Jianbo等[17]研究表明，小分子物質(zhì)（槲皮素、槲皮苷、山柰酚、楊梅黃酮及高良姜素）對(duì)BSA熒光猝滅的程度越大，小分子越接近BSA的色氨酸殘基。QUE較ACN對(duì)復(fù)合物溶液的熒光猝滅的程度較大，表明QUE較ACN更接近于BSA的色氨酸殘基。

前期實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)DMSO溶劑含量為10%時(shí)，對(duì)BSA的熒光峰沒(méi)有明顯影響[14]。本實(shí)驗(yàn)所有樣品中DMSO的含量均為1%，對(duì)QUE與BSA相互作用的影響亦可以忽略。在激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm時(shí)，QUE和ACN在發(fā)射波長(zhǎng)

290～420 nm范圍內(nèi)的熒光強(qiáng)度幾乎為0[18-19]。因此，采用BSA的激發(fā)波長(zhǎng)280 nm作為體系的熒光激發(fā)波長(zhǎng)。

2.2 BSA與QUE及ACN相互作用的熒光猝滅機(jī)理與結(jié)合常數(shù)

圖 3 QUE（A）和ACN（B）對(duì)BSA的熒光猝滅曲線Fig. 3 Fluorescence quenching curves of BSA by QUE (A) and ACN (B) based on Stern-Volmer equation

表 1 不同溫度BSA-QUE和BSA-ACN的猝滅常數(shù)KSVTable 1 Quenching constants of BSA-QUE and BSA-ACN at different temperatures

根據(jù)QUE及ACN對(duì)BSA的熒光猝滅光譜，繪制猝滅曲線（圖3）。選取猝滅曲線中呈線性相關(guān)部分的QUE和ACN的濃度計(jì)算得出猝滅常數(shù)（KSV）（表1）。由圖3A可知，隨著QUE濃度的增加（0.0～9.0×10－5mol/L），F(xiàn)0/F逐漸變大，且呈線性關(guān)系；當(dāng)QUE濃度繼續(xù)增加（9.0×10－5～18.0×10－5mol/L）時(shí)，F(xiàn)0/F增加速率變快，猝滅曲線逐漸向Y軸傾斜。由圖3B可知，隨著ACN濃度的增加（0.0～18.0×10－5mol/L），F(xiàn)0/F逐漸變大，且呈線性關(guān)系。當(dāng)QUE和ACN的濃度分別為0.0～9.0×10－5mol/L和0.0～18.0×10－5mol/L時(shí)，猝滅常數(shù)KSV隨溫度的升高而減小，且BSA-QUE的猝滅常數(shù)大于BSA-ACN的猝滅常數(shù)。

靜態(tài)猝滅和動(dòng)態(tài)猝滅是BSA和小分子相互作用常見(jiàn)的熒光猝滅方式。小分子導(dǎo)致BSA由激發(fā)態(tài)返回到基態(tài)，不發(fā)射光子，為動(dòng)態(tài)猝滅過(guò)程。隨著體系溫度升高，動(dòng)態(tài)猝滅效應(yīng)增強(qiáng)[20]。小分子與BSA在基態(tài)時(shí)生成不發(fā)光的配合物，從而導(dǎo)致熒光強(qiáng)度降低的過(guò)程為靜態(tài)猝滅過(guò)程。猝滅常數(shù)KSV表示成雙分子猝滅和與單分子衰變的速率常數(shù)，其大小反映了猝滅劑對(duì)熒光分子的接觸程度和反應(yīng)速率[21]。通過(guò)不同溫度條件下的猝滅常數(shù)變化，可以區(qū)分出動(dòng)態(tài)和靜態(tài)猝滅方式。動(dòng)態(tài)猝滅與擴(kuò)散系數(shù)有關(guān)，隨著溫度升高擴(kuò)散系數(shù)增大，熒光猝滅程度增大，猝滅常數(shù)增大。靜態(tài)猝滅源于相對(duì)穩(wěn)定的復(fù)合物，溫度升高可能引起復(fù)合物的穩(wěn)定性下降，使熒光猝滅程度降低，猝滅常數(shù)減小。結(jié)果表明，當(dāng)QUE和ACN的濃度分別為0.0～9.0×10－5mol/L和0.0～18.0× 10－5mol/L時(shí)，QUE及ACN對(duì)BSA的熒光猝滅屬于靜態(tài)猝滅，即分別形成了BSA-QUE和BSA-ACN復(fù)合物，且隨著溫度的升高（298～308 K），BSA-QUE比BSA-ACN更穩(wěn)定。當(dāng)QUE的濃度大于9.0×10－5mol/L時(shí)，QUE對(duì)BSA的熒光猝滅方式是靜態(tài)和動(dòng)態(tài)猝滅并存，而不是單一的靜態(tài)猝滅方式。總之，QUE與BSA相互作用在低濃度時(shí)主要是通過(guò)靜態(tài)猝滅的方式，而隨著濃度的增加，出現(xiàn)動(dòng)態(tài)猝滅的方式；而ACN與BSA相互作用主要是通過(guò)靜態(tài)猝滅的方式，且不隨著ACN濃度的增加而改變。

表 2 不同溫度BSA-QUE和BSA-ACN的結(jié)合常數(shù)K及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)nTable 2 Binding constants (K） and binding sites (n）of BSA-QUE and BSA-ACN at different temperatures

對(duì)于靜態(tài)猝滅方式，不同溫度條件下的結(jié)合常數(shù)K和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n都可以根據(jù)lg（（F0－F）/F）－lgC計(jì)算出來(lái)，結(jié)果見(jiàn)表2。在溫度為298、303 K和308 K時(shí)，BSA與QUE的結(jié)合常數(shù)分別為8.56×104、9.82×104L/mol和1.22×105L/mol，結(jié)合位點(diǎn)數(shù)均接近于1；BSA與ACN的結(jié)合常數(shù)分別為6.45×104，6.07×104L/mol和6.03× 104L/mol，結(jié)合位點(diǎn)數(shù)均接近于1。隨著溫度的升高，BSA與QUE的結(jié)合常數(shù)隨著溫度的升高而增大，而B(niǎo)SA與ACN的結(jié)合常數(shù)隨著溫度的升高而減小，且BSA與QUE之間的結(jié)合常數(shù)大于BSA-ACN之間的結(jié)合常數(shù)。BSA與QUE及ACN的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)幾乎是不受溫度變化的影響。結(jié)果表明BSA和QUE及ACN之間有很強(qiáng)的結(jié)合力，形成了一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，且BSA與QUE之間的結(jié)合力大于BSA與ACN之間的結(jié)合力。Tang Lin等[18]報(bào)道，在Tris-HCl（pH 7.4）中，BSA和ACN相互作用的結(jié)合位點(diǎn)為BSA亞結(jié)構(gòu)域ⅡA中的第一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。此外，由于結(jié)合常數(shù)及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)只能在靜態(tài)猝滅的前提下計(jì)算，需要選取猝滅曲線中呈線性相關(guān)部分的QUE和ACN的濃度進(jìn)行計(jì)算，所以采用的QUE和ACN的濃度比不一致。

2.3 BSA與QUE及ACN相互作用的熱力學(xué)參數(shù)和作用力

表 3 不同溫度BSA-QUE和BSA-ACN結(jié)合的熱力學(xué)參數(shù)Table 3 Thermodynamic constants of BSA-QUE and BSA-ACN at different temperatures

根據(jù)熱力學(xué)參數(shù)之間的關(guān)系式可以計(jì)算得到相互作用的焓變?chǔ)、熵變?chǔ)和吉布斯自由能變?chǔ)，結(jié)果見(jiàn)表3。BSA與QUE相互作用的ΔH＞0，而B(niǎo)SA與ACN的ΔH＜0。QUE和ACN與BSA相互作用，它們的熱力學(xué)參數(shù)均為ΔS＞0和ΔG＜0。蛋白質(zhì)與小分子間的相互作用可能是通過(guò)范德華力、疏水力、靜電吸引力或氫鍵等[22]。根據(jù)ΔH和ΔS可以推斷出小分子與蛋白質(zhì)之間相互作用的方式：當(dāng)ΔS和ΔH都大于0時(shí)，為疏水作用力；當(dāng)ΔS和ΔH都小于0時(shí)，為氫鍵和范德華力；當(dāng)ΔS＞0，ΔH＜0時(shí)，主要為靜電作用[23]。由此可以推知，BSA與QUE間疏水作用力起主要作用力，而B(niǎo)SA與ACN間靜電作用力起主要作用。

BSA與小分子（QUE或ACN）的結(jié)合是一個(gè)自由能降低的自發(fā)過(guò)程（ΔG＜0）。ΔG絕對(duì)值越大，結(jié)合作用越強(qiáng)[24]，即BSA與QUE的結(jié)合作用強(qiáng)于BSA與ACN的結(jié)合作用，該結(jié)果與結(jié)合常數(shù)所得結(jié)論一致。前期研究報(bào)道，在10% DMSO溶液中，BSA與QUE的相互作用力為疏水作用力[25]；在0.1 mol/L的NaCl緩沖液（pH 7.4）中，BSA與ACN的相互作用力主要是靜電引力[26]，都與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。但也有實(shí)驗(yàn)表明，在dH2O、NaCl和PBS 3 種溶液中，BSA與ACN分子間的相互作用力為氫鍵和范德華力[27]。這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果不一致，可能是由于熒光測(cè)定方法和計(jì)算不同所致。

2.4 BSA與QUE及ACN相互作用結(jié)合量

圖 4 BSA對(duì)QUE及ACN的結(jié)合量Fig. 4 Binding capacity of BSA with QUE or ACN

隨著QUE與BSA的濃度比由0增加到10∶1，與BSA結(jié)合的QUE也逐漸增加；當(dāng)QUE與BSA的濃度比達(dá)到10∶1時(shí)，即體系中QUE的濃度達(dá)到1.5×10－4mol/L時(shí)，BSA對(duì)QUE的結(jié)合達(dá)到了飽和。1 mol BSA可結(jié)合8 mol QUE。隨著ACN與BSA的濃度比由0增加到20∶1，與BSA結(jié)合的ACN也逐漸增加；當(dāng)ACN與BSA的濃度比達(dá)到20∶1時(shí)，即體系中ACN的濃度達(dá)到3.0×10－4mol/L時(shí)，BSA對(duì)ACN的結(jié)合達(dá)到了飽和。1 mol BSA可結(jié)合10 mol ACN（圖4）。BSA與ACN的結(jié)合量高于BSA與QUE的結(jié)合量。

董學(xué)艷[10]報(bào)道，在dH2O和10% DMSO中，當(dāng)QUE與BSA的濃度比分別達(dá)到20∶1和14∶1時(shí)，即體系中QUE的濃度分別達(dá)到3.0×10－4mol/L和2.1×10－4mol/L時(shí)，BSA對(duì)QUE的結(jié)合達(dá)到了飽和。在dH2O體系中，1 mol BSA分子上結(jié)合的QUE量為17 mol；在10% DMSO體系中，1 mol BSA分子上結(jié)合的QUE量為6 mol。DMSO中的S＝O基團(tuán)具有較強(qiáng)的氧化性，可能會(huì)破壞BSA的二級(jí)結(jié)構(gòu)α-螺旋中的氫鍵，使得內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露，導(dǎo)致BSA分子疏水聚集，結(jié)果使得BSA結(jié)合QUE的面積減少、結(jié)合QUE的量相應(yīng)減少。為了更直觀地比較BSA-QUE和BSA-ACN相互作用及形成納米顆粒的特征，在后面的實(shí)驗(yàn)中QUE及ACN與BSA的濃度比設(shè)置為10∶1。

雖然通過(guò)計(jì)算得到的BSA與QUE及ACN的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)均接近于1，但實(shí)際測(cè)得1 mol BSA可分別結(jié)合8 mol QUE或10 mol ACN。這是可能是由于通過(guò)模型計(jì)算，只能得到高親結(jié)合力的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)[28]，因此有一定的局限性。理論計(jì)算得到的位點(diǎn)可能反映的只是主要結(jié)合區(qū)域，故可以有多個(gè)小分子聚集。

2.5 BSA-QUE和BSA-ACN粒徑和ζ-電勢(shì)的比較

表 4 BSA-QUE和BSA-ACN納米顆粒的粒徑、多分散系數(shù)和ζ-電勢(shì)Table 4 Particle sizes, polydispersity index and ζ-potential of BSA-QUE and BSA-ACN nanoparticles

由表4可知，BSA、BSA-QUE和BSA-ACN的平均粒徑分別為24.7、42.5 nm和53.7 nm。BSA、BSA-QUE和BSA-ACN的多分散系數(shù)（PdI）分別為0.174、0.107和0.185。粒徑大小不一可能是由于BSA和QUE及ACN的相互作用力大小不同，當(dāng)溫度為25 ℃時(shí)，BSA和QUE的相互作用力大于和ACN的相互作用力，所以BSA-QUE粒徑較小。

在PBS（pH 7.4）中，BSA、BSA-QUE和BSA-ACN的ζ-電勢(shì)分別為－22.57、－25.64 mV和－21.50 mV。BSA-QUE較BSA的ζ-電勢(shì)減小，BSA-ACN較BSA的ζ-電勢(shì)變大。顆粒的ζ-電勢(shì)對(duì)于顆粒的穩(wěn)定性非常重要，當(dāng)顆粒的ζ-電勢(shì)絕對(duì)值大于30 mV時(shí)，表明顆粒很穩(wěn)定，當(dāng)顆粒的ζ-電勢(shì)絕對(duì)值小于20 mV時(shí)，表明顆粒更易聚集[29]。BSA-QUE的ζ-電勢(shì)比BSA-ACN的更接近于－30 mV，因此BSA-QUE納米顆粒更穩(wěn)定，該結(jié)果和相互作用力及粒徑結(jié)果相一致。

2.6 BSA對(duì)QUE及ACN抗氧化活性的影響

表 5 BSA-QUE和BSA-ACN納米顆粒的DPPH自由基和ABTS＋·清除率Table 5 DPPH and ABTS radical scavenging rates of BSA-QUE and BSA-ACN nanoparticles%

當(dāng)QUE的濃度為1.5×10－4mol/L時(shí)，QUE和BSAQUE的DPPH自由基清除率分別為45.8%和53.1%；ABTS＋·清除率分別為78.6%和85.0%。當(dāng)ACN的濃度為1.5×10－4mol/L時(shí)，ACN和BSA-ACN的DPPH自由基的清除率分別為22.5%和25.0%，ABTS＋·的清除率分別為45.4%和58.5%（表5）。BSA-QUE及BSA-ACN的自由基清除率均小于單獨(dú)QUE及ACN的自由基清除率與BSA的自由基清除率的理論加和計(jì)算值，且QUE和BSA-QUE的自由基清除率均高于ACN和BSA-ACN的自由基清除率。

QUE和ACN均具有較好DPPH自由基和ABTS＋·清除作用。它們的抗氧化作用主要與其結(jié)構(gòu)中的酚羥基有關(guān)。QUE的抗氧化作用主要來(lái)自其A環(huán)上的5-OH和7-OH以及B環(huán)上的3’-OH和5’-OH的貢獻(xiàn)；ACN的抗氧化作用主要來(lái)自其A環(huán)上的5-OH的貢獻(xiàn)[30-31]。早期研究表明，BSA可以與QUE的A環(huán)上5-OH形成分子間氫鍵[14]。BSA與QUE或ACN的酚羥基形成氫鍵，會(huì)導(dǎo)致抗氧化基團(tuán)的屏蔽，從而不同程度減弱QUE及ACN的自由基清除能力。

3 結(jié) 論

QUE和ACN對(duì)BSA均有較強(qiáng)的熒光猝滅作用，但兩者的猝滅程度和猝滅方式有所不同。QUE對(duì)BSA的熒光猝滅程度大于ACN對(duì)BSA的。QUE對(duì)BSA的熒光猝滅在低濃度時(shí)為靜態(tài)猝滅方式，在高濃度時(shí)為靜態(tài)與動(dòng)態(tài)并存的復(fù)合猝滅方式；而ACN對(duì)BSA的熒光猝滅為靜態(tài)猝滅方式。BSA與QUE的相互作用力為疏水作用力，而與ACN的相互作用力則為靜電作用力；且BSA與QUE的結(jié)合力大于BSA與ACN的；QUE與BSA的結(jié)合量小于ACN與BSA的。BSA與QUE形成的納米顆粒粒徑較BSA與ACN的小，且穩(wěn)定性較高。BSA-QUE對(duì)DPPH自由基和ABTS＋·的清除率均高于BSA-ACN。

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Interaction Modes and Nanoparticle Characteristics of Bovine Serum Albumin with Quercetin and Anthocyanin

LIU Jianlei, XING Xiaojuan, ZHOU Rui, JING Hao*
(College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China）

The interaction modes and nanoparticle characteristics of bovine serum albumin (BSA) with quercetin (QUE) and?anthocyanin?(ACN)?were?comparatively?investigated.?The?f l uorescence?of?BSA?was?greatly?quenched?by?QUE?in?both?static?(at?low?concentration)?and?dynamic?(at?high?concentration)?modes,?while?f l uorescence?quenching?of?BSA?by?ACN?was?just in a static mode. The binding constant of BSA with QUE was higher than that with ACN. BSA interacted with QUE and ACN by hydrophobic force and electrostatic force, respectively, to form BSA-QUE and BSA-ACN nanoparticles. The average?diameters?of?BSA-QUE?and?BSA-ACN?were?42.5?nm?and?53.7?nm,?respectively.?The?ζ-potentials of BSA-QUE and?BSA-ACN?were??25.64?and??21.50?mV,?respectively.?One?mole?of?BSA?could?combine?8?moles?of?QUE?or?10?moles?of?ACN. BSA-QUE nanoparticles were smaller and more stable than BSA-ACN nanoparticles. The DPPH and ABTS radical scavenging rates of BSA-QUE were higher than those of BSA-ACN.

bovine serum albumin (BSA); quercetin (QUE); anthocyanin (ACN); interaction; nanoparticle

10.7506/spkx1002-6630-201705002

TS201.4

A

1002-6630（2017）05-0007-07

劉建壘, 邢效娟, 周瑞, 等. 牛血清白蛋白與槲皮素及花青素相互作用方式及其納米顆粒特征的比較[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(5): 7-13. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201705002. http://www.spkx.net.cn

LIU Jianlei, XING Xiaojuan, ZHOU Rui, et al. Interaction modes and nanoparticle characteristics of bovine serum albumin with quercetin and anthocyanin[J]. Food Science, 2017, 38(5): 7-13. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201705002. http://www.spkx.net.cn

2016-06-30

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31171676）

劉建壘（1987—），男，博士研究生，研究方向?yàn)榈鞍着c小分子相互作用。E-mail：liujianlei@cau.edu.cn

*通信作者：景浩（1957—），男，教授，博士，研究方向?yàn)榈鞍着c小分子相互作用。E-mail：haojing@cau.edu.cn