張燕紅 路榮 劉國英 范秀麗 任旭榮 張妍/金宇保靈生物藥品有限公司

細(xì)胞免疫組化法篩選口蹄疫病毒單克隆抗體的研究

張燕紅 路榮 劉國英 范秀麗 任旭榮 張妍/金宇保靈生物藥品有限公司

口蹄疫(Foot-and-Mouth Disease，F(xiàn)MD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth Disease Virus，F(xiàn)MDV)引起的偶蹄獸的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病。該病感染途徑多、傳播速度快，嚴(yán)重危害畜牧業(yè)的發(fā)展和國際經(jīng)濟貿(mào)易的流通，被世界動物衛(wèi)生組織（OIE）列為A類疾病，該病為必須上報的疾病。我國也將其列為一類傳染病，并列為國家強制性免疫的動物疫病之一。根據(jù)口蹄疫血清型不同，口蹄疫病毒分為O、A、C、SATⅠ、SATⅡ、SATⅢ、AsiaⅠ七個型血清型，且各個血清型間沒有交叉保護力，每個血清型又有很多亞型，型內(nèi)不同毒株間的變異可導(dǎo)致抗原差異，這為口蹄疫的診斷和預(yù)防帶來了極大的困難。

1975年，科學(xué)家建立了淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，他們把用預(yù)定抗原免疫的小鼠脾細(xì)胞與能在體外培養(yǎng)中無限制生長的骨髓瘤細(xì)胞融合，形成細(xì)胞雜交瘤。通過克隆化可得到來自單個雜交瘤細(xì)胞的單克隆系，即雜交瘤細(xì)胞系，它所產(chǎn)生的抗體是針對同一抗原決定簇的高度同質(zhì)的抗體，即所謂單克隆抗體，簡稱單抗。與多抗相比，單抗純度高，專一性強、重復(fù)性好、且能持續(xù)地?zé)o限量供應(yīng)。

1982年，科學(xué)家首次研究成功抗O型FMDV單抗以來，世界許多國家已先后研制出多株針對各種血清型的單克隆抗體。目前FMDV單克隆抗體主要應(yīng)用于FMDV抗原位點的分析與定位、FMDV受體結(jié)合位點的研究、FMDV抗原結(jié)構(gòu)與生物學(xué)功能相關(guān)性研究、鑒定并跟蹤病毒株抗原變異等方面，同時，F(xiàn)MDV單抗還可以根據(jù)流行毒株的中和單抗譜，從疫苗毒中選擇出相近毒株，應(yīng)用于免疫預(yù)防中。針對疫苗株的單克隆抗體，也可用于對疫苗質(zhì)量進行評估。

一、材料

1.病毒。O/GX/09-7、O/Mya98/XJ/2010、O/ JMS、O/OZK-93、O/OR-80、Re-A/WH/09、Asia-1/JSL株病毒液，由金宇保靈生物藥品有限公司提供。

2．細(xì)胞培養(yǎng)。24～48 h的單層BHK-21細(xì)胞，由金宇保靈生物藥品有限公司提供。

3．細(xì)胞培養(yǎng)基。MEM（宜興市塞爾生物科技有限公司），加入10%胎牛血清（Hyclone公司）。

4．1．2%GUM膠。將3．6 g GUM膠粉加至300 ml沸水中，用攪拌器混勻，116℃、20分鐘高壓滅菌，冷卻后冷藏保存。

5．GUM膠培養(yǎng)基。1．2% GUM膠（aladdin）+2XMEM（體積比為1∶1），由金宇保靈生物藥品有限公司按說明書配制。

6．固定液的配制。甲醇（北京化工廠），丙酮（天津市富宇精細(xì)化工有限公司），（體積比為1∶1），置于-20℃保存。

7．其他試劑。1%馬血清PBS（0．01 mol/L，pH值7．6）、一抗（7G3、2B4、3D7、2B5），均由金宇保靈生物藥品有限公司提供；二抗（羊抗鼠）購自sigma公司；Vector VIP substrate kit for peroxidase試劑盒（貨號：SK-4600），購自美國Life Technologies公司。

二、方法

1.細(xì)胞培養(yǎng)。將BHK-21細(xì)胞懸液加入到六孔板中，每孔加2ml，培養(yǎng)24h長滿單層。

2.稀釋病毒。將O/GX/09-7、O/Mya98/XJ/2010、O/JMS、O/OZK-93、O/OR-80、Re-A/WH/09、Asia-1/JSL株病毒液按照10-4、10-5、10-6滴度進行稀釋。將稀釋后的毒液加入已長滿單層BHK細(xì)胞的六孔板中，每個滴度2個復(fù)孔，每孔加200μL病毒液，置于37℃吸附1小時，期間要振搖幾次，使病毒與細(xì)胞充分結(jié)合。

3.病毒培養(yǎng)。每孔加入2 mL GUM膠培養(yǎng)基，置于37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36～48 h（中間不要晃動）。

4．細(xì)胞固定。棄掉GUM膠培養(yǎng)基，用PBS（0．01 mol/L，pH值7．6）清洗1～2次，每孔再加入1．5 ml固定液，置于-20℃固定2 h。

5．封閉。棄掉固定液，每孔加入1．5 ml的含1%馬血清PBS（0．01 mol/L，pH值7．6）進行封閉，置于37℃封閉1 h。

6．稀釋單抗。（用1%馬血清稀釋）

表1 單抗稀釋方法

7．棄掉封閉液，每孔加入1．5 ml稀釋好的單抗，置于37℃培養(yǎng)40 min或者室溫（25℃） 1 h。8．棄液，用PBS（0．01 mol/L，pH值7．6）清洗三次。9．用PBS（0．01 mol/L，pH值7．6）稀釋二抗至1∶2 000。

10．每孔加入1 ml稀釋好的二抗置于37℃培養(yǎng)30 min。

11．棄液，用PBS（0．01 mol/L，pH值7．6）液清洗3次。

12．顯色利用顯色試劑盒，按照試劑盒使用說明書進行操作，10min后顯微鏡下觀察染色情況。

三、結(jié)果

1．7G3、2B4抗體與O/GX/09-7株病毒液發(fā)生顯色反應(yīng)，與O/Mya98/XJ/2010、O/JMS、O/OZK-93、O/OR-80、Re-A/WH/09、Asia-1/JSL株均不發(fā)生顯色反應(yīng)；

圖1 左圖為2B4單抗與O/GX/09-7株顯色反應(yīng)，右圖為7G3與O/GX/09-7株顯色反應(yīng)。

2．3D7、2B5抗體與O/Mya98/XJ/2010株病毒液發(fā)生顯色反應(yīng)，與O/GX/09-7、O/JMS、O/OZK-93、O/ OR-80、Re-A/WH/09、Asia-1/JSL株均不發(fā)生顯色反應(yīng)。

圖2 左圖為2B5單抗與O/Mya98/XJ/2010株顯色反應(yīng)，右圖為3D7與O/GX/09-7株顯色反應(yīng)。

四、討論

自1982年 McUcllogh等首次研制出抗O型單克隆抗體以來，世界上許多國家先后研制出多株針對各型的單克隆抗體，我國也有研究制備型單克隆抗體的報道[7]，但是，F(xiàn)MDV具有多個抗原位點，每個位點又含有許多表位，因此獲得更多的O型FMDV單克隆抗體，對于尋求具有診斷價值的單克隆抗體，以及鑒定保護性抗原表位，是必要的。1990年Maanen等用針對O、A和C型FMDV不同表位的單克隆抗體各2株，建立了一種復(fù)合捕獲阻斷ELISA，用于檢測O、A、C型FMDV，應(yīng)用試驗結(jié)果顯示該方法具有敏感、特異、快速等優(yōu)點，可用于牛FMD疫苗免疫效力試驗中免疫應(yīng)答效果的評價。目前，間接夾心ELISA是OIE的世界口蹄疫參考實驗室檢測FMDV抗原和病毒血清型時推薦使用的方法。然而FMDV單克隆抗體多應(yīng)用于研究和確定目標(biāo)的檢測，尚未廣泛應(yīng)用于診斷和檢疫中，因此需要利用單克隆抗體開發(fā)更簡便、更廉價、更準(zhǔn)確的診斷方法?？梢灶A(yù)期，本研究制備的4株O型FMDV特異性單抗，將在的研究和防制中發(fā)揮重要的作用。

本試驗通過雜交瘤技術(shù)獲得3株穩(wěn)定分泌抗型單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，經(jīng)生物學(xué)特性鑒定，均為特異性針對O型FMDV的單抗。其中，7G3抗體與O/ GX/09-7株病毒發(fā)生特異性反應(yīng)，3D7、2B5抗體只與O/Mya98/XJ/2010株病毒發(fā)生特異性反應(yīng)，而2B4抗體在高濃度時與O/Mya98/XJ/2010株病毒有交叉反應(yīng)，該抗體與MYA98有微弱的交叉反應(yīng)，但仍可作為ELISA抗原檢測的包被抗體。

（略）