李 婷，高東微，張 雋，武目濤，陳源樹，劉 津

(廣東檢驗檢疫技術(shù)中心∥廣東省動植物與食品進(jìn)出口技術(shù)措施研究重點實驗室，廣東 廣州 510623)

進(jìn)口玉米酒糟粕中轉(zhuǎn)基因品系檢測方法的比較研究

李 婷，高東微，張 雋，武目濤，陳源樹，劉 津

(廣東檢驗檢疫技術(shù)中心∥廣東省動植物與食品進(jìn)出口技術(shù)措施研究重點實驗室，廣東 廣州 510623)

以美國進(jìn)口玉米酒糟粕(DDGS)中轉(zhuǎn)基因玉米品系MIR162的實時熒光PCR檢測方法為研究內(nèi)容，分別采用3種常見商業(yè)化試劑盒提取基因組DNA，采用3個檢測標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的實時熒光PCR方法進(jìn)行MIR162定性檢測，比較了9種方法組合在檢測玉米酒糟粕中轉(zhuǎn)基因成分的檢測技術(shù)性能。結(jié)果表明，使用TIANGEN?植物基因組DNA提取試劑盒和《SN/T 1196—2012 轉(zhuǎn)基因成分檢測 玉米檢測方法》規(guī)定的熒光PCR方法，檢測靈敏度最高，符合現(xiàn)行檢驗監(jiān)管法規(guī)要求?？紤]到大宗農(nóng)產(chǎn)品及其加工產(chǎn)品的國際貿(mào)易普遍存在轉(zhuǎn)基因成分低水平混雜的情況，進(jìn)一步探討了進(jìn)口農(nóng)產(chǎn)品轉(zhuǎn)基因成分檢驗監(jiān)管分類管理的必要性，提出針對不同風(fēng)險級別的進(jìn)口農(nóng)產(chǎn)品采用靈敏度相適宜的檢測方法。

玉米酒糟粕；轉(zhuǎn)基因品系MIR162；基因組DNA；實時熒光PCR；低水平混雜

玉米酒糟粕(distillers dried grains with solubles, DDGS)是玉米在生產(chǎn)乙醇的過程中經(jīng)過糖化、發(fā)酵、蒸餾除酒精后，殘留物及殘液再經(jīng)干燥處理的產(chǎn)物。與玉米原料相比，DDGS具有低淀粉、高蛋白質(zhì)、高脂肪、富含消化纖維以及有效磷和硫含量高等優(yōu)點，在飼料生產(chǎn)中得到了廣泛應(yīng)用[1]。近年來，我國飼料行業(yè)對DDGS的需求量出現(xiàn)大幅增長，國內(nèi)產(chǎn)量不能滿足需求，自2009年開始大量進(jìn)口，進(jìn)口量呈現(xiàn)迅猛增長的態(tài)勢[2]。

按照我國農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因管理辦法等法規(guī)規(guī)定，對進(jìn)口農(nóng)產(chǎn)品進(jìn)行轉(zhuǎn)基因標(biāo)識符合性檢驗監(jiān)管，對進(jìn)口轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品的轉(zhuǎn)基因品系進(jìn)行檢測，是出入境檢驗檢疫重要工作內(nèi)容。DDGS進(jìn)口檢驗要對未經(jīng)批準(zhǔn)的轉(zhuǎn)基因玉米品系進(jìn)行檢測。2013-12，國家質(zhì)檢總局通報了數(shù)起從美國進(jìn)口DDGS中檢出未經(jīng)批準(zhǔn)的轉(zhuǎn)基因玉米品系MIR162的案例，對相關(guān)貨物作出了退運處理，進(jìn)口企業(yè)蒙受了巨額經(jīng)濟損失[3]。

截止2014-12，轉(zhuǎn)基因玉米品系MIR162獲得我國農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)以前，出入境檢驗檢疫實驗室開展了大量的進(jìn)口DDGS中轉(zhuǎn)基因品系MIR162檢測工作，統(tǒng)一采用了《轉(zhuǎn)基因玉米酒糟粕基因組DNA提取方法標(biāo)準(zhǔn)操作程序》中規(guī)定的TIANGEN?植物基因組DNA提取試劑盒提取DDGS基因組DNA和《SN/T 1196—2012 轉(zhuǎn)基因成分檢測 玉米檢測方法》進(jìn)行熒光PCR的檢測策略。采用這樣的檢測方法組合，在實驗室檢測實際工作中，經(jīng)常發(fā)生痕量轉(zhuǎn)基因品系MIR162檢出的情況，貨物按照我國轉(zhuǎn)基因管理法規(guī)必須退貨或銷毀。檢驗監(jiān)管實踐表明，一昧提高檢測靈敏度，并非科學(xué)保障國境安全、促進(jìn)國際貿(mào)易的最佳選擇。為此，本研究嘗試通過實驗考察進(jìn)口DDGS轉(zhuǎn)基因玉米品系MIR162檢測方法的技術(shù)性能，比較其與其他常見檢測方法的技術(shù)差別，探討更加符合貿(mào)易需要的DDGS等進(jìn)口飼料中轉(zhuǎn)基因成分檢測方法，提出更加科學(xué)的進(jìn)口農(nóng)產(chǎn)品轉(zhuǎn)基因成分檢驗策略。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100%的轉(zhuǎn)基因玉米MIR162種子粉末標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(貨號AOCS 1208-A)購自美國化學(xué)石油家學(xué)會。DDGS樣品為10個本實驗室進(jìn)口法檢業(yè)務(wù)留樣。

TaqMan?Universal Master MixⅡwith UNG (貨號4440038，美國)；Promega Wizard?基因組DNA純化試劑盒(貨號A1120，美國)；TIANGEN?植物基因組DNA提取試劑盒(貨號DP305-02)購自天根生化科技(北京)有限公司；OMEGA?磁珠法植物基因組DNA提取試劑盒(M1128-00，美國)。PCR引物和探針由上海閃晶分子生物科技有限公司合成，引物探針序列見表1。

表1 引物和探針序列

1.2 基因組DNA的提取

1.2.1 DDGS

1.2.1.1 Promega Wizard?試劑盒提取基因組DNA

稱取40 mg DDGS粉末放入2 ml離心管中，按照試劑盒操作說明書提取基因組DNA，最后用50 μl TE緩沖液溶解DNA。

1.2.1.2 TIANGEN?試劑盒提取基因組DNA

稱取120 mg DDGS粉末放入2 ml離心管中，按照《轉(zhuǎn)基因玉米酒糟粕基因組DNA提取方法標(biāo)準(zhǔn)操作程序》提取基因組DNA，具體內(nèi)容包括：加入800 μl GP1緩沖液，振蕩混勻30 s，加入蛋白酶K溶液5 μl，混勻后65℃溫浴40 min，冷卻至室溫后加入750 μl氯仿，充分震蕩，13 400g離心10 min，轉(zhuǎn)移上層水相，加入700 μl GP2緩沖液，充分混勻并每次650 μl分次全部轉(zhuǎn)入CB3吸附柱，13 400g離心30 s，棄廢液，然后按照試劑盒操作說明書完成剩余提取步驟，最后用50 μl TE 緩沖液洗脫DNA。

1.2.1.3 OMEGA?試劑盒提取方法

稱取50 mg DDGS粉末放入2 ml離心管中，按照試劑盒操作說明書提取基因組DNA，最后用50 μl溶解緩沖液溶解DNA。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

采用經(jīng)1.2.1節(jié)比較提取性能后優(yōu)選出性能最優(yōu)的試劑盒，按照同樣的操作步驟提取100%轉(zhuǎn)基因玉米MIR162種子粉末標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的基因組DNA。

1.3 DNA純度和得率的檢測

采用NanoDrop1000核酸蛋白分析儀(Thermofisher，美國)測定DNA溶液的純度及質(zhì)量濃度。DNA的純度通過OD260/OD280、OD260/OD230來進(jìn)行判斷；DNA得率根據(jù)下式計算：

1.4 DDGS的實時熒光PCR檢測

分別對10個DDGS基因組DNA進(jìn)行MIR162品系特異性序列和內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因Adh1進(jìn)行熒光PCR。MIR162品系特異性序列的引物、探針和反應(yīng)條件分別采用《QT-EVE-ZM-022玉米MIR162 品系定量檢測PCR方法》、《SN/T 1196—2012 轉(zhuǎn)基因成分檢測 玉米檢測方法》、《SN/T 1201—2014飼料中轉(zhuǎn)基因植物成分PCR檢測方法》3種標(biāo)準(zhǔn)檢測方法。內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因Adh1的引物、探針和反應(yīng)條件統(tǒng)一采用《QT-EVE-ZM-022玉米MIR162 品系定量檢測PCR方法》。PCR反應(yīng)體系(25 μl)：2×TaqMan?Universal Master Mix 12.5 μl，正反向引物和探針各0.25 μl，DNA模板200 ng，加雙蒸水補足總體積至25 μl。PCR反應(yīng)體系引物探針貯備液濃度和PCR反應(yīng)條件見表2。PCR反應(yīng)設(shè)置2個平行。用ABI 7900實時熒光PCR儀(ABI，美國)進(jìn)行實時熒光PCR，熒光信號通過SDS Software 2.3進(jìn)行收集和分析。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將1.2.2中提取的100%轉(zhuǎn)基因玉米MIR162標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)基因組DNA用TE緩沖液10倍濃度梯度稀釋至100 、10 、1 、0.1 、0.01 ng/μl，分別以之為模板，按照QT-EVE-ZM-022的反應(yīng)體系和條件，分別對MIR162品系特異性序列和內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因Adh1進(jìn)行熒光PCR。PCR反應(yīng)體系(25 μl)：2×TaqMan?Universal Master Mix 12.5 μl，正反向引物和探針各0.25 μl，DNA模板2 μl，加雙蒸水補足總體積至25 μl。PCR反應(yīng)體系引物探針貯備液濃度和PCR反應(yīng)條件見表2。PCR反應(yīng)設(shè)置3個平行。用ABI 7900實時熒光PCR儀進(jìn)行實時熒光PCR，熒光信號通過SDS Software 2.3進(jìn)行收集和分析。

根據(jù)單倍體玉米基因組大小2.73 pg[4]，計算出PCR反應(yīng)體系中的初始模板拷貝數(shù)分別為73 260 、7 326 、733 、73 、7.3 。以初始模板拷貝數(shù)的對數(shù)值為橫坐標(biāo)(x軸)，對應(yīng)的Ct值為縱坐標(biāo)(y軸)，用基于3個平行反應(yīng)的單個Ct值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，用最小二乘法求出擬合直線，得到等式：yCt=a×xlg(copies)+b。其中y代表Ct值，x代表樣品的拷貝數(shù)的對數(shù)lg(copies)，a代表斜率，b代表截距。

表2 PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件

1.6 轉(zhuǎn)基因成分含量的計算

采用1.2.1節(jié)比較提取性能后選出的試劑盒，提取10個DDGS樣品基因組DNA，按照QT-EVE-ZM-022進(jìn)行MIR162品系特異性序列和內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因Adh1的熒光PCR，得到的Ct值代入1.5繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用方程式計算得到對應(yīng)的拷貝數(shù)，并利用下式計算樣品中轉(zhuǎn)基因品系MIR162含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取方法比較

本研究采用出入境檢驗檢疫系統(tǒng)開展進(jìn)口農(nóng)產(chǎn)品轉(zhuǎn)基因成分檢測工作中常用的3種商業(yè)化試劑盒，進(jìn)行DDGS基因組DNA提取性能的比較。其中，TIANGEN試劑盒的操作步驟按照《轉(zhuǎn)基因玉米酒糟粕基因組DNA提取方法標(biāo)準(zhǔn)操作程序》進(jìn)行，其他2種試劑盒的使用按照操作說明書進(jìn)行。考慮到DDGS基因組DNA提取效率會受到核酸破壞程度的影響，本研究統(tǒng)一采用相關(guān)操作說明中規(guī)定的稱樣范圍內(nèi)最大值進(jìn)行樣品的稱量。3種試劑盒提取結(jié)果見表3。

表3 3種商業(yè)化試劑盒提取DDGS基因組DNA結(jié)果比較

上述3種商業(yè)化試劑盒均能從DDGS中提取出玉米基因組DNA。但是由表3可知，提取效果有明顯差異。采用Promega試劑盒提取的DNAOD260/OD280在1.8左右，OD260/OD230較小，表明去蛋白質(zhì)效果較好，但是未能有效去除多糖、鹽和小分子雜質(zhì)等；采用OMEGA試劑盒提取的DNAOD260/OD280在1.45～1.74，OD260/OD230在0.96～1.44，表明DNA中存在較多的蛋白質(zhì)、多糖和鹽等雜質(zhì)；用TIANGEN試劑盒提取的DNAOD260/OD280在1.77～1.85，OD260/OD230在2.39～3.92，表明提取的DNA純度較好。就DNA得率而言，Promega試劑盒的DNA得率顯著高于其余2種方法，得率最低的是TIANGEN試劑盒。從采用3種方法提取得到的DNA進(jìn)行玉米內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因檢測的Ct值來看，TIANGEN試劑盒提取得到的DNA在進(jìn)行下游PCR檢測時Ct值最小，擴增效果最好；OMEGA試劑盒法提取DNA的Ct值波動最大，擴增效果不穩(wěn)定。因此，如果為盡量提高檢測靈敏度的目的，應(yīng)當(dāng)選用TIANGEN試劑盒提取DDGS中的基因組DNA。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線分析

根據(jù)歐洲轉(zhuǎn)基因檢測網(wǎng)絡(luò)實驗室(European Network of GMO Laboratories, ENGL)對轉(zhuǎn)基因檢測方法的要求[5]，標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率應(yīng)在-3.6～-3.1，代表PCR擴增效率在90%～110%，線性決定系數(shù)R2應(yīng)大于0.98，說明實驗結(jié)果線性有效。根據(jù)表4的轉(zhuǎn)基因玉米MIR162標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)梯度濃度基因組DNA的實時熒光PCR結(jié)果，繪制MIR162品系特異性序列和內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因Adh1的標(biāo)準(zhǔn)曲線。其中MIR162品系特異性序列標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性決定系數(shù)R2為0.997 9，斜率為-3.591，截距為39.206；內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性決定系數(shù)R2為0.997 8，斜率為-3.468 1，截距為38.676。這些數(shù)據(jù)說明實驗結(jié)果線性有效，所繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線可以用來測定樣品中轉(zhuǎn)基因成分含量。

表4 轉(zhuǎn)基因玉米MIR162標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)梯度濃度基因組DNA PCR結(jié)果

圖1 MIR162品系特異性序列和內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因Adh1的擴增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 3種DNA提取試劑盒與3種熒光PCR方法組合的檢測結(jié)果分析

對3種提取試劑盒提取的DDGS基因組DNA分別采用3個標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的熒光PCR方法進(jìn)行MIR162品系特異性序列檢測，并按照1.6求出DDGS中MIR162品系特異性序列和內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因Adh1的拷貝數(shù)，計算樣品中轉(zhuǎn)基因品系MIR162含量,結(jié)果見表5。

對3種提取試劑盒提取的DDGS基因組DNA進(jìn)行MIR162品系特異性序列實時熒光PCR檢測的Ct值中，采用TIANGEN試劑盒的Ct值最小，且10個樣品的MIR162品系特異性序列均能檢出。這個結(jié)果表明，TIANGEN試劑盒提取的DNA對MIR162品系特異性序列擴增效率最高。特別是對于樣品6，只有該試劑盒提取出的DNA能夠檢出MIR162。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線和轉(zhuǎn)基因成分含量計算公式，求得該樣品中MIR162只有0.13%，說明該試劑盒提取的DNA對下游熒光PCR檢測的靈敏度提供了優(yōu)良的保障。緊隨其后的是OMEGA試劑盒，也得到了較小的Ct值，而Promega試劑盒提取的DNA獲得的Ct值較大。以上結(jié)果說明，相比于TIANGEN試劑盒，其余2種試劑盒提取的DNA進(jìn)行MIR162品系特異性序列的下游熒光PCR檢測時，靈敏度相對較差。

從3種實時熒光PCR方法對MIR162品系特異性序列檢測的Ct值來看，10個樣品中， 采用SN/T 1196—2012檢測Promega試劑盒提取的DNA時有2個樣品未檢出；采用SN/T 1201—2014檢測Promega試劑盒和OMEGA試劑盒提取的DNA時分別有2和1個樣品未檢出；采用QT-EVE-ZM-022檢測Promega試劑盒和OMEGA試劑盒提取的DNA時分別有4和1個樣品未檢出。由此可見，SN/T 1196—2012對不同試劑盒提取的DNA適用性更好，檢測靈敏度最高。

表5 3種DNA提取試劑盒與3種PCR方法組合的檢測結(jié)果比較

從3種DNA提取試劑盒與3種熒光PCR方法的9種組合來看，由TIANGEN試劑盒提取的樣品DNA用3種實時熒光PCR方法均能檢出MIR162品系特異性序列。其中，當(dāng)MIR162的含量大于0.62%時，3種熒光PCR方法Ct值相當(dāng)；當(dāng)MIR162小于0.62%時，使用SN/T 1196—2012的Ct值更小，其他2種實時熒光PCR方法檢測結(jié)果則相當(dāng)。因此，使用“TIANGEN試劑盒+SN/T 1196—2012”的組合檢測靈敏度最高。TIANGEN試劑盒與另外2種熒光PCR方法的組合與之相比稍差。由OMEGA試劑盒提取的樣品DNA中，有7個樣品使用SN/T 1196—2012的Ct值均比其他2個實時熒光PCR方法的Ct值小。但是與“TIANGEN試劑盒+SN/T 1196—2012”的組合相比，“OMEGA試劑盒+SN/T 1196—2012”Ct值普遍明顯較高，說明檢測性能相對較差。由Promega試劑盒提取的樣品DNA用3種實時熒光PCR方法檢測的3個組合，Ct值參差不齊，表明檢測結(jié)果的穩(wěn)定性較差、靈敏度較低。

3種DNA提取試劑盒與3種熒光PCR方法組合的檢測結(jié)果分析表明，使用TIANGEN試劑盒提取，并采用SN/T 1196—2012進(jìn)行實時熒光PCR檢測的組合靈敏度最高，檢測低限達(dá)到0.1%。

3 討論

熒光PCR檢測的性能好壞，極大地取決于DNA模板的質(zhì)量。不同的商業(yè)化試劑盒，提取DDGS得到的基因組DNA品質(zhì)和得率差別很大，對下游檢測的結(jié)果具有至關(guān)重要的影響。

DDGS是玉米酒精發(fā)酵的副產(chǎn)品，經(jīng)過深加工，核酸受到比較嚴(yán)重的破壞，與植物原材料相比蛋白質(zhì)和脂類物質(zhì)比例很高，從中提取玉米基因組DNA存在較大的技術(shù)困難，對DNA提取試劑盒的技術(shù)要求遠(yuǎn)高于未經(jīng)加工的植物原材料。出入境檢驗檢疫系統(tǒng)在日常開展進(jìn)口農(nóng)產(chǎn)品轉(zhuǎn)基因成分檢測工作中，經(jīng)常使用的商業(yè)化植物基因組DNA提取試劑盒種類較多，可能導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因痕量水平檢測結(jié)果在不同實驗室之間存在差異較大的情況。鑒于此，本研究以進(jìn)口DDGS為切入點探討了上述3種常見的商業(yè)化試劑盒對進(jìn)口農(nóng)產(chǎn)品轉(zhuǎn)基因成分檢測技術(shù)性能的影響。

在本研究的3種試劑盒中，雖然有些種類的試劑盒提取的DNA采用紫外分光光度法測得較高的得率，但是純度表現(xiàn)欠佳，進(jìn)行下游熒光PCR檢測時靈敏度較差。反之，有些種類的試劑盒雖然得率數(shù)據(jù)不突出，但是具有明顯的熒光PCR優(yōu)勢。我們在選擇適宜的商業(yè)化試劑盒和熒光PCR檢測方法的時候，不應(yīng)當(dāng)只關(guān)注試劑盒的DNA得率，應(yīng)當(dāng)更多地關(guān)注試劑盒對下游熒光PCR靈敏度的影響，更多地關(guān)注不同試劑盒與熒光PCR方法的組合得到的Ct值。

在選擇一個適宜的檢測方法的時候，實驗室還需要考慮各項成本。對于進(jìn)口DDGS這類批次多、樣品量大、對檢測時長有較大限制的樣品，還要綜合考慮人力操作成本和時間成本，以滿足大規(guī)模檢測的工作需要。各種試劑盒操作步驟不同，提取基因組DNA耗時差別較大。有些種類的試劑盒，使用中包括繁瑣的移液、離心等操作，遇到大批量樣品DNA提取時一方面容易發(fā)生交叉污染，另一方面這些操作潛在的耗時會極大地增加提取過程的總時長。此時，選擇試劑盒的因素還要顧及操作的便利性。

按照我國農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因管理辦法等相關(guān)法規(guī)，未經(jīng)批準(zhǔn)的轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品不得入境，進(jìn)口DDGS中不得含有未經(jīng)批準(zhǔn)的轉(zhuǎn)基因玉米品系成分。在此檢驗監(jiān)管原則下，進(jìn)口DDGS中未經(jīng)批準(zhǔn)的轉(zhuǎn)基因玉米品系成分不得檢出，也即對進(jìn)口DDGS中非法轉(zhuǎn)基因品系成分采取“零容忍”的評判標(biāo)準(zhǔn)，因此應(yīng)當(dāng)采用技術(shù)上最靈敏的檢測手段。從DDGS中轉(zhuǎn)基因玉米品系MIR162的檢測實踐和本研究結(jié)果可以看出，在“零容忍”的前提下，進(jìn)口法檢統(tǒng)一采用的“TIANGEN試劑盒+SN/T 1196—2012”方法組合最為靈敏，最符合檢驗監(jiān)管法規(guī)的要求。

與此同時，我國超過90%的進(jìn)口DDGS來自美國，均為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品。美國批準(zhǔn)的商業(yè)化轉(zhuǎn)基因玉米超過40種[6]，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中允許一定程度的摻雜。2013年轉(zhuǎn)基因玉米品系MIR162在美國全境種植面積已經(jīng)達(dá)到10%[7]，來自美國的玉米及其加工產(chǎn)品不可避免會發(fā)生轉(zhuǎn)基因品系MIR162低水平混雜的情況。本研究隨機抽取的10個進(jìn)口DDGS留樣檢測結(jié)果也表明，轉(zhuǎn)基因玉米品系MIR162的低水平混雜情況非常普遍，含量在0.13%到10.55%之間，污染率為100%。在這種情況下，對進(jìn)口DDGS的轉(zhuǎn)基因成分檢測采用最為靈敏的檢測方法，將會造成含有低濃度污染水平未經(jīng)批準(zhǔn)轉(zhuǎn)基因成分的大量DDGS商品檢測結(jié)果不合格，進(jìn)口貿(mào)易受到檢測結(jié)果的嚴(yán)重阻礙。2014-12，轉(zhuǎn)基因玉米品系MIR162獲得我國農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)以前，大量美國進(jìn)口DDGS因檢出污染水平的MIR162而滯留進(jìn)口口岸等待處置，與此同時全國飼料生產(chǎn)企業(yè)經(jīng)歷了嚴(yán)重的原料饑荒。

轉(zhuǎn)基因成分低水平混雜(low level presence，LLP)是指大宗農(nóng)產(chǎn)品及其副產(chǎn)品進(jìn)出口貿(mào)易過程中非主觀的、無意的、難以避免的轉(zhuǎn)基因成分污染，涉及的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品安全性已經(jīng)得到進(jìn)口國以外一個或多個其他國家的認(rèn)可，但是由于進(jìn)出口國的審批過程存在時間差而導(dǎo)致在進(jìn)口國成為不合格商品的情況[8]。隨著轉(zhuǎn)基因作物種植面積的增大，糧食中未準(zhǔn)入轉(zhuǎn)基因成分低水平混雜問題日益突出[9]。工業(yè)化農(nóng)業(yè)生產(chǎn)極大地消除了傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)中農(nóng)作物種植和農(nóng)產(chǎn)品加工的天然地域分隔，造成目前眾多貿(mào)易國家和地區(qū)在轉(zhuǎn)基因檢驗監(jiān)管中普遍面臨大宗農(nóng)產(chǎn)品轉(zhuǎn)基因成分低水平混雜的問題。目前國際上通行的做法是根據(jù)不同農(nóng)產(chǎn)品轉(zhuǎn)基因成分低水平混雜的實際情況，結(jié)合本國對該類農(nóng)產(chǎn)品的需求，綜合開展風(fēng)險評估，并根據(jù)風(fēng)險評估結(jié)果制定對應(yīng)的檢測方法，管理上采用閾值管理策略。歐盟、美國、日本、巴西等發(fā)達(dá)國家和地區(qū)都已經(jīng)設(shè)立了LLP閾值。例如，歐盟設(shè)定的轉(zhuǎn)基因飼料LLP閾值為0.1%，日本設(shè)定的進(jìn)口飼料LLP閾值為1%，加拿大制定中的谷物、食品和飼料LLP閾值為0.1%或0.2%[10]。我國至今尚未在進(jìn)口大宗農(nóng)產(chǎn)品的轉(zhuǎn)基因檢驗監(jiān)管中引入風(fēng)險分級管理的原則，沒有設(shè)定LLP閾值，實際操作中所采用的檢測方法靈敏度相當(dāng)于檢驗監(jiān)管的閾值。

2013～2014年進(jìn)口DDGS中MIR162的檢驗監(jiān)管實踐表明，制定進(jìn)口農(nóng)產(chǎn)品轉(zhuǎn)基因成分檢測方法策略應(yīng)當(dāng)考慮的多方面因素。我們認(rèn)為，進(jìn)口農(nóng)產(chǎn)品的轉(zhuǎn)基因檢驗監(jiān)管工作中應(yīng)當(dāng)采用分類管理的思路，引入風(fēng)險分級的科學(xué)理念，考慮對沒有繁殖能力、不會造成生態(tài)擴散、僅用于飼料用途的DDGS等粕類飼料采取與初級農(nóng)產(chǎn)品有差別的管理措施，并適當(dāng)考慮進(jìn)口粕類飼料的國內(nèi)需求量，采用合適的檢測方法和松緊適度的結(jié)果評判標(biāo)準(zhǔn)，以科學(xué)保障國境安全、同時充分滿足貿(mào)易需要。

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(責(zé)任編輯：舒蓮梅)

Comparative research on detection methods of GM ingredients from imported distillers dried grains with soluble

LI Ting, GAO Dong-wei, ZHANG Jun, WU Mu-tao, CHEN Yuan-shu, LIU Jin

(Guangdong Inspection and Quarantine Technology Center, Guangdong Province Key Laboratory of Animal Plant and Food Import and Export of Technical Measures, Guangzhou 510623, China)

By real-time fluorescence PCR methods for detection of GM maize event MIR162 in distillers dried grains with soluble (DDGS) exported from US， 3 universal commercial kits were used for genomic DNA extraction, and 3 real-time fluorescence PCR methods provided in detection standards were applied for the qualitative detection of MIR162. A comparison of the 9 detection combinations was made to investigate the technical performances of GM ingredient detection for DDGS. The results showed that the combination of TIANGEN?plant genomic DNA extraction kit and the real-time fluorescence PCR method in"SN/T 1196-2012 detection of genetically modified components-maize test methods"gave a better detection sensitivity to satisfy the requirements of current inspection and supervision rules. Based on the wide-spread existence of low level presence (LLP) of GM ingredients in international trades for bulk agricultural products and their processed products, we further discussed the necessity of classified inspection and supervision on GM ingredients in the imported agricultural products,and also presented the application of detection methods with specific sensitivities which suitable for imported agricultural products at different risk levels.

distillers dried grains with solubles; GM event MIR162; genomic DNA extraction; real-time fluorescence PCR; low level presence

2016-10-17；

2017-01-10

廣東出入境檢驗檢疫局科技計劃項目"玉米酒糟粕轉(zhuǎn)基因品系標(biāo)準(zhǔn)檢測方法的比較研究"(2015GDK13)。

李 婷(1988-)，女，工程師，研究方向為食品分子生物學(xué)檢測。

劉 津(1983-)，女，高級工程師，研究方向為食品分子生物學(xué)檢測。

10.7633/j.issn.1003-6202.2017.03.013

S816.46 ;O652.4

A

1003-6202(2017)03-0055-08