聶 鑫，王 偉

（華東理工大學(xué)生物工程學(xué)院生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237）

潛在促生菌Bacillus tequilensis U36的產(chǎn)IAA特性及其對(duì)辣椒的促生效果

聶 鑫，王 偉

（華東理工大學(xué)生物工程學(xué)院生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237）

對(duì)從土壤中分離到的一株潛在根圍促生菌U36進(jìn)行了系統(tǒng)分析，通過形態(tài)學(xué)、生理生化特性及16S rRNA分析鑒定其為特基拉芽孢桿菌Bacillus tequilensis。盆栽試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，U36對(duì)植物生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，而且在正常土壤中植株的生長(zhǎng)優(yōu)于無菌土。但就促生效率而言，在滅菌土中加入U(xiǎn)36后的促生效率高于正常土中的促生效率：正常土中U36對(duì)辣椒根長(zhǎng)、根重、莖長(zhǎng)、莖重和葉面積的促進(jìn)效率分別達(dá)到47.7%、37.5%、21.5%、69.2%和8.1%；而在滅菌土中，辣椒根長(zhǎng)、根重、莖長(zhǎng)、莖重和葉面積的促進(jìn)效率分別為49.2%、58.8%、25.7%、58.2%和24.1%。通過研究發(fā)現(xiàn)U36不僅具有固氮、解磷的功能，還可產(chǎn)生促生長(zhǎng)物質(zhì)吲哚乙酸（IAA），且IAA的產(chǎn)生具有色氨酸依賴性。該菌株的優(yōu)良促生特性可以作為潛在促生菌用于生物肥料研發(fā)，具有很好的應(yīng)用價(jià)值。

辣椒；促生菌；Bacillus tequilensis；吲哚乙酸；色氨酸依賴性

植物根圍促生菌（PGPR）是一類在土壤中與植物密切相關(guān)的重要微生物，這些微生物的生長(zhǎng)活動(dòng)可以促進(jìn)宿主植物的生長(zhǎng)［1］。自然界中的PGPR種類很多，有些微生物具有直接促進(jìn)植物生長(zhǎng)的功能，如Goswami等［2］研究的Paenibacillus mucilaginosus N3；有些微生物的促生作用機(jī)制是基于對(duì)一些植物病原菌的拮抗，如我們常見的一些熒光假單胞菌和芽孢桿菌都具有生物防治的效果，從而促進(jìn)植物生長(zhǎng)［3］。對(duì)于PGPR的研究和應(yīng)用一直在不斷發(fā)展，特別是近幾年隨著人們生活水平的不斷提高、環(huán)保意識(shí)的增強(qiáng)以及對(duì)化學(xué)肥料危害的深入了解，安全無污染的生物農(nóng)藥和生物肥料成為研究重點(diǎn)。Gopalakrishnan等研究的放線菌對(duì)水稻的促生作用［4］以及Paungfoo-Lonhienne等研究的伯克氏菌屬的促生作用［5］都為PGPR的發(fā)展和應(yīng)用奠定了重要基礎(chǔ)。

PGPR的促生機(jī)制有多方面，大多數(shù)PGPR的促生作用是多種促生機(jī)制共同作用的結(jié)果。有的菌株具有固氮、解磷和解鉀的功能，從而為宿主植物提供N、P、K等營(yíng)養(yǎng)元素；有的則通過產(chǎn)生一些促生長(zhǎng)的物質(zhì)如吲哚乙酸（IAA）、氫氰酸、鐵載體等［6］來達(dá)到促進(jìn)植物生長(zhǎng)的效果。這些促生機(jī)制在很多研究中被用來篩選PGPR，為后續(xù)的生物測(cè)定以及田間試驗(yàn)提供參考。IAA是一種常見的植物促生長(zhǎng)激素，很多PGPR都可以產(chǎn)生該類物質(zhì)，但是產(chǎn)生的方式有所不同。Idris等［7］對(duì)Bacillus amyloliquefaciens FZB4 產(chǎn)生IAA的機(jī)理進(jìn)行了深入研究，發(fā)現(xiàn)其具有色氨酸依賴性。目前，對(duì)PGPR促生作用的研究很多，但是就PGPR在正常土壤環(huán)境和無菌土壤環(huán)境中促生效果的比較研究還未見報(bào)道。鑒于此，本研究基于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)篩選到的可能具有促生潛力的菌株Bacillus tequilensis U36（簡(jiǎn)稱U36），對(duì)它產(chǎn)生IAA的色氨酸依賴性及其在正常土與無菌土中的促生效果進(jìn)行初步比較，目的是對(duì)該菌株可能作為潛在生物肥料的有效成分提供依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

菌株：U36分離自施入了生防菌熒光假單胞菌CPF10的西瓜根圍土壤中。

辣椒：朝天椒（Capsicum frutescens），種子購(gòu)于徐州一粒籽園藝有限公司。

土壤：上海市亭林地區(qū)蔬菜大棚內(nèi)的辣椒種植土壤，pH 7.76（±0.20），總氮1.23（±0.08）g/kg，有機(jī)碳10.41（±1.08）g/kg，有機(jī)質(zhì)1.77（±1.44）g/kg，砂粒（50～2000 μm）17.18%，粉粒（2～50 μm）79.76%，粘粒（＜2 μm）3.16%，土壤質(zhì)地為黃壤土。土壤取回后自然晾干，過2 mm篩，部分土壤需滅菌處理，滅菌方法參照Delmont等［8］，滅菌后的土壤放置1周后使用。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)于2014年9月在華東理工大學(xué)生物工程學(xué)院生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行。

1.2.1 U36的鑒定 （1）形態(tài)學(xué)鑒定和生理生化鑒定：參照文獻(xiàn)［9］和文獻(xiàn)［10］進(jìn)行鑒定。（2）分子生物學(xué)鑒定：將菌株用LB液體培養(yǎng)液培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，離心收集菌體，采用SDS-CTAB法提取總基因組DNA。以總DNA為模板，采用通用引物27F（5＇-AGAGTTTGATCCT GGCTCAG-3＇）和1492R（5＇-GGTTACCTTGTTA CGACTT-3＇）進(jìn)行16S rRNA的PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后純化回收并測(cè)序（上海生工生物工程科技有限公司），獲得16SrRNA序列后，在GenBank中采用Blast程序搜索同源序列，利用MEGA 4.0軟件建立系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.2 菌株U36促生長(zhǎng)作用 試驗(yàn)設(shè)4個(gè)處理：（1）滅菌土添加U36；（2）正常土添加U36；（3）滅菌土未添加U36（CK1）；（4）正常土未添加U36（CK2）。每個(gè)處理3次重復(fù)。辣椒種子先用70%乙醇消毒2 min，再用次氯酸鈉溶液處理2 min，最后用無菌水沖洗10次。將處理后的種子，在無菌水中浸泡1 h后播種于圓形花盆（盆口×盆底×盆高=100 mm×70 mm ×95 mm）中，花盆內(nèi)含有500 g土，初始含水量為10%（V/W），置于人工植物培養(yǎng)箱（溫度24℃、相對(duì)濕度70%、光照12 h/d）中，每隔2 d澆水1次，每次約50 mL，花盆底部放置淺碟，以防止菌淋濾出。試驗(yàn)菌株U36培養(yǎng)于LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)24 h，菌液離心沉淀后用無菌水稀釋，使最終加入的試驗(yàn)菌量為1×108CFU/g（按干土量計(jì)），播種后將菌液通過灌根的方式加入到土壤中。處理后第40天對(duì)辣椒植株進(jìn)行取樣，測(cè)量根重、莖重、根長(zhǎng)、莖長(zhǎng)和葉面積等生理指標(biāo)。

1.2.3 菌株U36固氮作用 配制Ashby無氮培養(yǎng)基（KH2PO40.2 g/L、CaCO30.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.2 g/L、NaCl 0.2 g/L、CaSO40.1 g/L、葡萄糖10 g/L、瓊脂20 g/L，pH 7.0），從LB固體培養(yǎng)基上挑取U36菌株的單菌落在Ashby無氮培養(yǎng)基固體平板上劃線，3次重復(fù)，37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后進(jìn)行觀察。如果可以生長(zhǎng)，則該菌株可以利用空氣中的氮?dú)馐棺约涸跓o氮培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，具有固氮能力。

1.2.4 菌株U36解磷作用 配制PVK改良培養(yǎng)基〔葡萄糖10 g/L、Ca3PO45 g/L、（NH4）2SO40.5 g/L、NaCl 0.2 g/L、MgSO40.1 g/L、KCl 0.2 g/L、酵母粉0.5 g/L、MnSO40.002 g/L、4%溴酚藍(lán)6 mL、瓊脂20 g/L、pH自然〕，從LB固體培養(yǎng)基上挑取U36菌株單菌落涂于PVK改良培養(yǎng)基固體平板上，3次重復(fù)，37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后進(jìn)行觀察。如果菌落周圍可以產(chǎn)生透明圈，說明該菌株可以溶解不溶的磷酸鈣產(chǎn)生磷元素供菌體生長(zhǎng)，具有解磷作用。

1.2.5 菌株U36解鉀作用 配制解鉀培養(yǎng)基（蔗糖5 g/L、Na2HPO42 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、FeCl30.005 g/L、CaCO30.1 g/L、鉀長(zhǎng)石粉1 g/L、瓊脂20 g/L、pH 7.0～7.5），從LB固體培養(yǎng)基上挑取U36菌株單菌落涂于解鉀培養(yǎng)基固體平板上，3次重復(fù)，37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后進(jìn)行觀察。如果周圍有透明圈產(chǎn)生，說明該菌株可以溶解不溶的鉀長(zhǎng)石產(chǎn)生鉀元素供菌體生長(zhǎng)，具有解鉀作用。

1.2.6 菌株U36產(chǎn)IAA特性 繪制IAA標(biāo)準(zhǔn)曲線：取IAA標(biāo)品，配置成0、0.5、1.0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0 μg/mL的濃度梯度，取2 mL各濃度IAA加入4 mL索爾克染劑（1 mL 0.5 mol/L FeCl3·H2O加入到50 mL 35%濃H2SO4中），30℃中暗保溫30 min，530 nm下利用分光光度計(jì)測(cè)定吸光度，以O(shè)D值為縱坐標(biāo)、IAA濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

將U36與實(shí)驗(yàn)室分離到的另外兩種菌株U12和U40作為對(duì)照菌株同時(shí)進(jìn)行試驗(yàn)。首先，將3種菌株單菌落接種到LB液體培養(yǎng)基中，加入5 mmol/L L-色氨酸、0.06%SDS（十二烷基硫酸鈉）和1%甘油，37℃下180 r/min振蕩培養(yǎng)48 h。取菌液于離心管中10 000 r/min離心5 min，取2 mL上清，加入2滴磷酸和4 mL索爾克染劑。28℃下30 min左右顏色由黃色變?yōu)榉奂t色則說明顯陽(yáng)性，檢測(cè)到有IAA的產(chǎn)生，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算產(chǎn)生的IAA含量。

1.2.7 菌株U36產(chǎn)IAA的色氨酸依賴性 將菌株U36、U12和U40分別接種到LB液體培養(yǎng)基中，置于37℃下180 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后作為母液使用。取1 mL菌液接種到新的100 mL LB液體培養(yǎng)基中，設(shè)0、250、500 μg/mL L-色氨酸3個(gè)處理，每個(gè)處理3次重復(fù)。處理后同樣條件下振蕩培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)后0、1、2、3、4、5 d時(shí)取樣，每個(gè)樣品3次重復(fù)。然后進(jìn)行IAA色氨酸依賴性檢測(cè)，分別取上述菌液于離心管中10 000 r/min離心5 min，取2 mL上清，加入2滴磷酸和4 mL索爾克染劑，28℃下30 min左右顏色由黃色變?yōu)榉奂t色則說明顯陽(yáng)性，檢測(cè)到有IAA的產(chǎn)生，測(cè)定530 nm下的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算IAA濃度。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

利用SPSS軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，檢驗(yàn)其差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株U36的鑒定

菌株U36的形態(tài)學(xué)鑒定及生理生化鑒定結(jié)果表明，U36在培養(yǎng)基中呈白色、干燥、粗糙、無光澤狀態(tài)，電子顯微鏡下觀察為桿狀，且為革蘭氏陽(yáng)性。生理生化鑒定發(fā)現(xiàn)U36可水解葡萄糖、蔗糖、明膠、淀粉，但不水解乳糖和檸檬酸，甲基紅試驗(yàn)陽(yáng)性說明該菌株水解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸并最終被分解為甲酸、乙酸和乳酸等。

對(duì)U36進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，16SrRNA測(cè)序結(jié)果采用MEGA 4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1）。將16SrRNA的測(cè)序結(jié)果與GenBank中的核苷酸序列進(jìn)行同源性比較，發(fā)現(xiàn)該菌株序列（GenBank登陸號(hào)為HQ223107）與Bacillus tequilensis（10 b）同源性達(dá)99.887%，結(jié)合生理生化特征，確定菌株U36為特基拉芽孢桿菌Bacillus tequilensis。

圖1 U36的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 菌株U36的促生作用

在辣椒生長(zhǎng)40 d時(shí)測(cè)定各項(xiàng)生理指標(biāo)，結(jié)果見表2。由表2可知，U36在正常土和滅菌土中與對(duì)照的各個(gè)生理指標(biāo)差異顯著，正常土壤中植株的生長(zhǎng)狀況優(yōu)于滅菌土，但促生效率不同。正常土中U36對(duì)根長(zhǎng)的促進(jìn)效率達(dá)47.7%，根重促進(jìn)效率達(dá)37.5%，莖長(zhǎng)促進(jìn)效率達(dá)21.5%，莖重促進(jìn)效率達(dá)69.2%，葉面積促進(jìn)效率只有8.1%；而在滅菌土中根長(zhǎng)、根重、莖長(zhǎng)、莖重和葉面積的促進(jìn)效率分別為49.2%、58.8%、25.7%、58.2%和24.1%。由此可見，無論是U36處理還是非U36處理中，正常土中的植株生長(zhǎng)狀況都比滅菌土中好，在根長(zhǎng)、莖長(zhǎng)、莖重和葉面積上都有顯著差異。但就總體促生效率而言，在滅菌土中加入U(xiǎn)36后的促生效率比正常土中要高，說明U36具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)的作用，發(fā)揮著重要的生態(tài)功能。

表2 U36在正常土與滅菌土中對(duì)辣椒生長(zhǎng)情況的影響

2.3 菌株U36的固氮、解磷和解鉀特性

通過對(duì)U36固氮、解磷、解鉀特性的研究，發(fā)現(xiàn)U36表現(xiàn)出了一定的固氮作用和解磷作用，但不具有解鉀的特性。具有固氮和解磷作用可能是U36表現(xiàn)出促生特性的一個(gè)重要原因。

2.4 菌株U36的產(chǎn)IAA特性

IAA的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示。通過對(duì)發(fā)酵液中的IAA進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，菌株U36和兩個(gè)對(duì)照菌株都可產(chǎn)生IAA，但產(chǎn)量不同。在該處理?xiàng)l件下，U12的IAA產(chǎn)量只有22.5（±2.3）μg/mL，U40的IAA產(chǎn)量有58.1（±3.2）μg/mL，而U36的IAA產(chǎn)量達(dá)到63.1（±3.7）μg/mL。可見，在這3種菌株中U36的IAA產(chǎn)量最大。

圖2 IAA標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖3 U36產(chǎn)生IAA的濃度隨發(fā)酵時(shí)間的變化

對(duì)U36產(chǎn)IAA的色氨酸依賴性試驗(yàn)結(jié)果見圖3。對(duì)0、1、2、3、4、5 d的樣品進(jìn)行IAA檢測(cè)的結(jié)果表明，該菌株在沒有色氨酸存在的情況下，代謝產(chǎn)物基本檢測(cè)不到IAA的產(chǎn)生，而在色氨酸濃度為250、500 μg/mL時(shí)可以檢測(cè)到IAA的產(chǎn)生。在500 μg/mL色氨酸濃度下，發(fā)酵2 d即可達(dá)到較高的IAA濃度，然后趨于平緩，而在250 μg/mL色氨酸濃度下約4 d才能達(dá)到較高IAA濃度，然后趨于平緩，這可能是培養(yǎng)基中的色氨酸已被完全利用而導(dǎo)致IAA的生成終止，IAA濃度基本保持不變?？梢姡诟呱彼釢舛葪l件下生成IAA的效率及其產(chǎn)量可能會(huì)更高。

3 結(jié)論與討論

PGPR研究是近幾年熱點(diǎn)，越來越多的PGPR菌株被分離出來，利用其促進(jìn)植物生長(zhǎng)的特性被廣泛應(yīng)用于不同地域、不同環(huán)境下的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)［11-12］。在PGPR促生機(jī)制的研究中，IAA是一種重要的植物激素，是很多PGPR促生特性的重要原因［13］。我們發(fā)現(xiàn)本實(shí)驗(yàn)室分離到的U36菌株可以產(chǎn)生IAA，且具有色氨酸依賴性，即在有色氨酸存在的條件下可利用色氨酸產(chǎn)生IAA，且在高色氨酸濃度條件下IAA的生成效率也會(huì)提高。這一特性在其他PGPR的研究中也被發(fā)現(xiàn)［14-15］，有學(xué)者認(rèn)為這可能與菌株產(chǎn)生IAA時(shí)的一些關(guān)鍵酶的表達(dá)有關(guān)［16］。因此，在應(yīng)用時(shí)若補(bǔ)充一些關(guān)鍵氨基酸，其在土壤中將發(fā)揮更好的促生效果。

U36的促生效果不論在正常土還是無菌土盆栽試驗(yàn)中的表現(xiàn)都十分突出，這可能源于U36的優(yōu)良促生特性。產(chǎn)生的IAA直接促進(jìn)植物生長(zhǎng)，固氮特性使其獲得更多的氮源供植物利用，解磷作用幫助植物利用土壤中難以利用的磷元素。我們還發(fā)現(xiàn)，植物在正常土中的生長(zhǎng)比在無菌土中的生長(zhǎng)狀態(tài)好，這與國(guó)內(nèi)外一些學(xué)者研究的結(jié)果有一定的相似性［17］，原因可能有以下幾個(gè)方面：首先，我們的研究用土取自蔬菜大棚內(nèi)的土壤，該土壤環(huán)境可能更利于植物的生長(zhǎng)，土壤中的很多有益微生物都與植物生長(zhǎng)密切相關(guān)，所以相同的條件下正常土比無菌土中的植株生長(zhǎng)較好；其次，在加入U(xiǎn)36以后，U36不僅自身可以產(chǎn)生一些促生長(zhǎng)物質(zhì)直接作用于植物本身，而且可以與土壤中的微生物相互作用，可能增加了有益菌群的數(shù)量，同時(shí)減少了有害菌群的數(shù)量，所以有菌土中辣椒的生長(zhǎng)狀況比無菌土好，Wu等［18］的研究也得到相似結(jié)果。在無菌土的條件下，U36表現(xiàn)出的促生效率比正常土更好，可能是在無菌土條件下辣椒本身長(zhǎng)勢(shì)較差，當(dāng)U36加入后很快定殖，其對(duì)植物直接的促生作用得到加強(qiáng)，從而表現(xiàn)出更高的促生效率。

然而，也有少量PGPR的研究與本研究結(jié)果不同［19］，他們認(rèn)為土壤滅菌徹底消除了土壤中的不利生物因素外，高溫滅菌也會(huì)使土壤中的某些緩效養(yǎng)分得到釋放［20］，從而使植株的生長(zhǎng)得到顯著改善。這種差異可能與研究所用土壤和所用植株的不同有關(guān)，不同的研究土壤，其中的微生物群落對(duì)不同的植株生長(zhǎng)的影響不同。如果土壤原本不利于植物生長(zhǎng)，滅菌處理可能會(huì)殺滅土壤中的有害菌群；但如果土壤原本的微生物菌群是有利于植物生長(zhǎng)的，滅菌處理可能會(huì)殺滅大量的有益菌群，從而降低了土壤活力。

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（責(zé)任編輯 張輝玲）

IAA production characteristics and growth-promoting effects on pepper of potential plant grouth-promoting rhizobacteria（PGPR）Bacillus tequilensis U36

NIE Xin1，WANG Wei
（State Key Laboratory of Bioreactor Engineering，School of Biotechnology，East China University of Science and Technology，Shanghai 200237，China）

We systematically analyzed a potential plant growth-promoting rhizobacteria（PGRP）U36，which was separated from soil. This strain was eventually determined to be Bacillus tequilensis through the morphological，physiological and biochemical properties and 16S rRNA assay. Through the pot experiment，we found that U36 promoted pepper growth，which was better in normal soil than in sterilized soil，but the growth promoting efficiency was much higher in sterilized soil than in normal soil after applying U36. In normal soil，the promoting efficiencies of U36 on root length，root weight，stem length，stem weight and leaf area of pepper were 47.7%，37.5%，21.5%，69.2% and 8.1%，respectively. While in sterile soil，the promoting efficiencies were 49.2%，58.8%，25.7%，58.2% and 24.1%，respectively. Besides，U36 not only had the functions of nitrogen fixation and phosphate-solubilizing，but also could produce the growth promoting substance IAA，and the generation of IAA had tryptophan dependence. With the excellent growth-promoting effect，U36 can be used as a potential PGPR for the development of biological fertilizer，which has a good application value.

pepper；plant growth-promoting rhizobacteria（PGPR）；Bacillus tequilensis；IAA；tryptophan dependence

S758.2

A

1004-874X（2017）01-0036-07

2016-10-28

上海市科技創(chuàng)新行動(dòng)計(jì)劃重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目（15391901500）

聶鑫（1990-），男，在讀碩士生，E-mail：niexin19901203@sina.com

王偉（1963-），男，博士，教授，E-mail：weiwang@ecust.edu.cn

聶鑫，王偉. 潛在促生菌Bacillus tequilensis U36的產(chǎn)IAA特性及其對(duì)辣椒的促生效果［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，44（1）：36-42.