張建華，曹希亮，劉超，郝永清

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院、農(nóng)業(yè)部動(dòng)物疾病臨床診療技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、內(nèi)蒙古預(yù)防重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特 010018；2.拜耳（四川）動(dòng)物保健有限公司 610225)

我國(guó)奶牛牛支原體流行情況調(diào)查

張建華1，曹希亮2，劉超2，郝永清1

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院、農(nóng)業(yè)部動(dòng)物疾病臨床診療技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、內(nèi)蒙古預(yù)防重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特 010018；2.拜耳（四川）動(dòng)物保健有限公司 610225)

由牛支原體引起的奶牛支原體肺炎和乳房炎所導(dǎo)致的經(jīng)濟(jì)損失非常巨大，而目前我國(guó)尚無(wú)較詳細(xì)的奶牛牛支原體病流行病學(xué)資料。2008～2016年，本課題組采用牛支原體間接ELISA、直接培養(yǎng)法和特異性PCR檢測(cè)法對(duì)國(guó)內(nèi)12個(gè)地區(qū)30個(gè)規(guī)?；膛?chǎng)進(jìn)行了牛支原體感染情況調(diào)查及分析，共對(duì)843份血清和60份肺臟、關(guān)節(jié)液及鼻腔黏液、1 090份乳樣中的牛支原體抗體和牛支原體及其核酸進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示，血清抗體陽(yáng)性率為52.31%（441/843）；病料陽(yáng)性率為55%（33/60）；乳樣陽(yáng)性率為34.22%（373/1090）；從樣本中共分離保存了55株支原體菌種。檢測(cè)結(jié)果表明，國(guó)內(nèi)大部分奶牛場(chǎng)存在牛支原體感染，部分奶牛場(chǎng)發(fā)生牛支原體肺炎、乳房炎及關(guān)節(jié)炎臨床病例，并存在垂直傳播的風(fēng)險(xiǎn)。牛支原體感染可能成為危害國(guó)內(nèi)規(guī)模化奶牛場(chǎng)奶牛健康的主要疫病之一。

牛支原體；奶牛；流行情況調(diào)查

牛支原體（Mycoplasma bovis）是危害養(yǎng)牛業(yè)的重要致病性支原體，除導(dǎo)致牛乳房炎外，還導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎、角膜結(jié)膜炎、耳炎、生殖道炎癥、流產(chǎn)與不孕等多種病癥[1]。1961年美國(guó)首次從乳房炎患牛中分離到牛支原體，1976年報(bào)道該病原與牛呼吸系統(tǒng)疾病有關(guān)。在歐洲，25%～33%的犢牛肺炎由牛支原體引起，每年損失1.44億～1.92億歐元[2]。在美國(guó)，每年因牛支原體感染導(dǎo)致的牛呼吸系統(tǒng)疾病和乳腺疾病所造成的損失達(dá)1.40億美元。在我國(guó)，有關(guān)奶牛支原體方面的疾病報(bào)道較少。2008年以后，我國(guó)許多地區(qū)相繼散發(fā)以壞死性肺炎為主要病變的犢牛肺炎病例，辛九慶[3]、石磊[4]、冉智光[5]等人從患病動(dòng)物上分離并鑒定出牛支原體，患病牛群發(fā)病率50%～100%，患病牛死亡率10%～50%。本課題組于2008～2016年對(duì)國(guó)內(nèi)12個(gè)地區(qū)30個(gè)規(guī)模化奶牛場(chǎng)的牛支原體感染情況進(jìn)行了調(diào)查分析，以期為我國(guó)奶牛牛支原體的流行病學(xué)調(diào)查及相關(guān)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 病料來(lái)源

2008年9月～2016年5月，在全國(guó)12個(gè)地區(qū)30個(gè)規(guī)?；膛?chǎng)采集6月齡以下犢牛血清843份、肺炎死亡犢牛肺臟病料17份、具有肺炎癥狀的犢牛鼻腔拭子30份、膝關(guān)節(jié)明顯腫大的關(guān)節(jié)液13份、臨床難治性乳房炎患牛乳樣1 090份。

1.2 試劑

牛支原體間接ELISA試劑盒，購(gòu)自加拿大Biovet公司。

1.3 培養(yǎng)基

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：PPLO肉湯粉21g，葡萄糖1g，0.4%酚紅2.5mL，25%酵母浸液10mL，充分溶解定容至800mL，用1mol/L NaOH調(diào)pH值至7.6～7.8，121℃滅菌15min，4℃保存（可保存2周）。

完全培養(yǎng)基：基礎(chǔ)培養(yǎng)基使用時(shí)加入200mL的滅活馬血清、終濃度為100U/mL的青霉素以及終濃度為1g/L的丙酮酸鈉。配制固體培養(yǎng)基時(shí)，高壓前再加入10g瓊脂粉，滅菌后溫度降至50℃時(shí)再加入后續(xù)的添加劑。

1.4 間接ELISA檢測(cè)

按照ELISA試劑盒說(shuō)明書操作。

1.5 PCR檢測(cè)

1.5.1 病料的處理

取病料無(wú)菌接種牛支原體液體培養(yǎng)基，置5% CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)48h，將培養(yǎng)物再接種1次培養(yǎng)基，每天觀察培養(yǎng)基顏色變化，取培養(yǎng)管顏色變化且底部有渾濁的培養(yǎng)管離心，從沉淀中粗提牛支原體核酸。

1.5.2 乳樣的處理

用滅菌棉簽蘸取乳樣涂于支原體固體培養(yǎng)基，72h后進(jìn)行觀察，如果見到針尖狀菌落，挑去菌落進(jìn)行純化，用試劑盒提取核酸。

1.5.3 模板的制備

取3mL培養(yǎng)物15 000r/min離心20min，棄上清，用0.1mol/L PBS反復(fù)沖洗2次，加入50μL PBS懸浮沉淀

并置于沸水中煮沸10min，立即冰浴，3000r/min離心10min，將上清吸入另一個(gè)離心管，作為DNA模板。

1.5.4 PCR 反應(yīng)

參考本實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)牛支原體特異性序列和牛支原體16S rDNA引物進(jìn)行PCR。引物序列見表1。

表1 引物列表

25μL 反應(yīng)體系：模板3μL、P1和P2各0.5μL（10μmol/L）、dNTPs（2.5mmol/L）2.0μL、PCR 10×buffer 2.5μL、Taq 酶0.5μL（2.5U/μL）、ddH2O 16μL。優(yōu)化的PCR 擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5min；95℃變性1min，53℃退火1min，72℃延伸1min，32個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，4℃條件下保存?；厥?6S rDNA PCR產(chǎn)物并送上海生工生物工程有限公司測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 各地區(qū)牛支原體血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果

調(diào)查結(jié)果表明，6個(gè)地區(qū)的6個(gè)規(guī)?；膛?chǎng)均存在牛支原體感染，感染率為16.16%～84.6%，表明感染地區(qū)分布廣、感染率高（表2）。2010年，李大偉等[6]對(duì)我國(guó)14個(gè)省的牛群進(jìn)行的支原體流行病學(xué)調(diào)查顯示，牛場(chǎng)群抗體陽(yáng)性率為84.4%，個(gè)體陽(yáng)性率為47.8%, 其中肉牛（52%）和奶牛（61.2%）個(gè)體陽(yáng)性率較高，而牦牛個(gè)體陽(yáng)性率（14.2%）較低，本次調(diào)查結(jié)果與此相似。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，這些地區(qū)奶牛感染的多是牛支原體肺炎，可能與近幾年從國(guó)外大量引進(jìn)奶牛有一定的關(guān)系，因此，有必要對(duì)進(jìn)口的奶牛和凍精進(jìn)行牛支原體檢疫。

表2 牛支原體血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果

2.2 牛病料及奶樣PCR檢測(cè)結(jié)果

用牛支原體特異性引物PCR 檢測(cè)M.bovis陽(yáng)性DNA和1 150份病料，結(jié)果顯示，從406份病料均擴(kuò)增出約442bp大小的片段，與預(yù)期擴(kuò)增片段相符，陰性對(duì)照未見特異性條帶（圖1）。不同來(lái)源病料的牛支原體PCR檢測(cè)結(jié)果見表3。表3顯示，陽(yáng)性檢出率為14%～100%。不難看出，同一地區(qū)不同牧場(chǎng)陽(yáng)性檢出率相差很大，說(shuō)明牛支原體引起發(fā)病與牧場(chǎng)管理有直接關(guān)系。所以，做好牧場(chǎng)管理，把握用藥劑量，調(diào)整日糧比例，對(duì)有效控制牛支原體病的發(fā)生有指導(dǎo)性意義。課題組從上述的406份陽(yáng)性病料中共分離得到83株支原體，經(jīng)純化后鑒定的支原體共有55株。據(jù)Rifatbegovic等對(duì)荷蘭奶牛呼吸道牛支原體分離結(jié)果表明，患有呼吸道疾病病牛的肺臟中牛支原體的分離率亦在20%以上。如此高的分離率說(shuō)明牛支原體已經(jīng)成為奶牛的常見致病微生物，牛支原體感染可能成為危害國(guó)內(nèi)規(guī)?；膛?chǎng)奶牛健康的主要疫病之一。

圖1 病料中牛支原體PCR擴(kuò)增結(jié)果

表3 牛支原體PCR檢測(cè)結(jié)果

2.3 牛支原體感染趨勢(shì)分析

如圖2所示，2008～2009年和2015～2016年，調(diào)查牛場(chǎng)出現(xiàn)了較高的牛支原體感染率，陽(yáng)性檢出率都在70%以上，其中最高出現(xiàn)在2008年，陽(yáng)性檢出率高達(dá)84.6%；最低年份為2013年，陽(yáng)性檢出率為16.4%。早期發(fā)病率較高的原因，可能是國(guó)內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)報(bào)道的是牛支原體肺炎，因重視程度不夠而導(dǎo)致較高的發(fā)病率。隨著抗支原體藥物的不斷研發(fā)、引進(jìn)，使得發(fā)病率逐年下降，但是濫用抗生素極易使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，近年來(lái)牛支原體檢出率突然升高與之有較大的關(guān)系。在一年當(dāng)中，隨著季節(jié)的變化，牛群的感染率也不同，筆者對(duì)8年中每個(gè)月的陽(yáng)性檢出率進(jìn)行了平均統(tǒng)計(jì)，得到的結(jié)果如圖3所示?？梢钥闯觯?1月到次年4月的陽(yáng)性檢出率較高，最高出現(xiàn)在3月，為70.28%。在氣溫較低的月份，牛機(jī)體抵抗力降低，使得牛支原體可以趁虛而入，引起疾病的發(fā)生。所以可在氣溫轉(zhuǎn)寒之前進(jìn)行藥物預(yù)防和疫苗免疫，以減少牛支原體病的發(fā)生。

圖2 2008～2016年牛支原體陽(yáng)性檢出率

圖3 8年中各個(gè)月份平均陽(yáng)性率

3 討論

經(jīng)對(duì)全國(guó)12個(gè)地區(qū)30個(gè)規(guī)模化奶牛場(chǎng)持續(xù)8年的跟蹤調(diào)查表明，所有牧場(chǎng)均存在不同程度的牛支原體感染。課題組共檢測(cè)843份血清，60份肺臟、關(guān)節(jié)液及鼻腔黏液，1 090份乳樣。結(jié)果顯示，血清抗體陽(yáng)性率為52.31%（441/843）；病料陽(yáng)性率為55%（33/60）；乳樣陽(yáng)性率為34.22%（373/1090）。陽(yáng)性檢出率如此之高，值得深思。

根據(jù)報(bào)道，歐美國(guó)家約25%～30%的牛呼吸疾病綜合征是由牛支原體引起的，這與本課題組所得到的數(shù)據(jù)相近。從這些年的跟蹤調(diào)查中可以看出，牛支原體肺炎、乳房炎已經(jīng)發(fā)展成為流行趨勢(shì)[7]。牛支原體主要的傳播途徑是水平傳播和垂直傳播[8]。水平傳播包括健康牛和病牛的直接接觸或經(jīng)呼吸道、生殖道、乳頭傳播。垂直傳播主要是子宮感染，在分娩過程中犢牛接觸了帶有牛支原體的陰道分泌液和飲用了牛支原體乳房炎患牛的初乳[9～11]。而成年牛感染另一個(gè)途徑可能是人工受精，這加大了牛支原體在傳播途徑上的控制難度。另一方面原因是牛支原體的分離培養(yǎng)比較困難，筆者從1 150份樣品中僅分離到55株牛支原體，污染問題和雜菌的干擾在很大程度上影響了支原體的分離培養(yǎng)工作。市場(chǎng)上尚無(wú)針對(duì)支原體的生化培養(yǎng)管和藥敏試劑盒，支原體的培養(yǎng)基內(nèi)又含有高比例的血清，勢(shì)必會(huì)影響預(yù)期的效果。這對(duì)牛支原體疾病的初期診斷造成了很大的困擾[12～14]。

課題組在國(guó)內(nèi)大部分地區(qū)采集了臨床樣品，通過血清學(xué)方法、病原學(xué)方法和特異性PCR方法對(duì)我國(guó)主要奶牛養(yǎng)殖地區(qū)牛支原體感染發(fā)病情況進(jìn)行詳細(xì)調(diào)查，為有效控制牛支原體病提供了流行病學(xué)數(shù)據(jù)。從樣本中分離純化55株與牛肺炎、乳房炎有關(guān)的支原體，包括產(chǎn)堿支原體6株、加利福尼亞支原體1株、牛生殖道支原體8株、牛支原體40株，沒有分離到同樣可以引起奶牛乳房炎的牛鼻支原體和加拿大支原體。由此可見，牛支原體是引起支原體病的主要支原體，并且牛支原體在國(guó)內(nèi)流行比較廣泛，迫切需要開展對(duì)該病的研究，為防控工作提供理論基礎(chǔ)。

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Prevalence Investigation of Mycoplasma bovis in China

ZHANG Jian-hua1, CAO Xi-liang2, LIU Chao2, HAO Yong-qing1
(1.Key Laboratory of Clinical Diagnosis and Treatment Technology in Animal Disease, Ministry of Agriculture of China, College of Veterinary Medicine, Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot 010018; 2. Bayer(Sichuan) Animal Healthcare L.td,Co; Chengdu 610225)

Mycoplasma bovis, which can lead to penumonia and mastitis of dairy cow, causes huge losses of breeding industry. Since it spreads quickly, it is very necessary to make a suitable epidemic analysis to prevent and control the spreading of this pathogens. From 2008 to 2016, we collected 483 serums, 60 lungs,synovial and Nasal mucus and 1090 milk samples from 30 large-scale dairy felds of 12 provinces. We used indirect ELISA, direct cultivation method and PCR to detect the antibody level and nucleic acid of Mycoplasma bovis. As the result shows, in the serum, positive rate is 52.31%, in pathological samples, the positive rate is close to 55%, and in milk samples, the positive rate is 34.22%.We separated 55 Mycoplasma bovis strains from these samples. As the detection result shows, Mycoplasma bovis exist in most dairy feld in China, some of them are bothering with penumonia,mastitis and arthritis. Moreover, Mycoplasma bovis has a potential to be vertical spreaded. The infection of Mycoplasma bovis may cause a huge damage in large-scale dairy felds.

Mycoplasma bovis; Cow; Epidemiological investigation

S858.23

A

1004-4264（2017）03-0023-04

10.19305/j.cnki.11-3009/s.2017.03.007

2016-08-09

國(guó)家科技支撐計(jì)劃資助項(xiàng)目(2012BAD13B00)。

張建華（1991-），男，內(nèi)蒙古人，碩士研究生，研究方向?yàn)楂F醫(yī)微生物學(xué)與免疫學(xué)。

郝永清（1962-），男，內(nèi)蒙古人，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)楂F醫(yī)微生物學(xué)與免疫學(xué)。