許紅喜，張洪濤，韓歡勝，閆德光，衛(wèi)喜明，宋偉紅，張金友，甘文平

（黑龍江農(nóng)墾科學院畜牧獸醫(yī)研究所，哈爾濱 150038）

不同緩沖液添加大豆蛋白冷凍奶牛精子試驗效果研究

許紅喜，張洪濤，韓歡勝，閆德光，衛(wèi)喜明，宋偉紅，張金友，甘文平

（黑龍江農(nóng)墾科學院畜牧獸醫(yī)研究所，哈爾濱 150038）

本文為解決奶牛凍精稀釋液添加卵黃易污染、易將異源動物體內(nèi)微生物傳染給輸精母畜等弊端，進行了兩個方面的試驗研究：（1）選擇含蛋白量高的大豆粉溶液添加Tris緩沖液制成蛋白Tris稀釋液，添加磷酸鹽緩沖液制成蛋白PBS稀釋液，及傳統(tǒng)使用的卵黃Tris稀釋液，分別冷凍奶牛鮮精，觀察解凍后活力；（2）觀察蛋白Tris稀釋液、蛋白PBS稀釋液與卵黃Tris稀釋液超低溫冷凍奶牛精子解凍后在4℃環(huán)境中存活時間。結果表明，蛋白Tris稀釋液、蛋白PBS稀釋液與卵黃Tris稀釋液超低溫冷凍的奶牛，細管凍精質量都能符合國家標準，但冷凍效果最佳的是蛋白Tris稀釋液。在冷藏4℃下，蛋白Tris稀釋液、卵黃Tris稀釋液第5天精子活力仍能達到國家標準，蛋白Tris稀釋液顯微鏡下的觀察視野要比卵黃Tris稀釋液清晰，不易滋長細菌。因此，添加大豆粉溶液制成的蛋白Tris稀釋液冷凍奶牛精子的效果最佳，試驗證明，植物源稀釋液可以替代動物源稀釋液。

大豆蛋白；精子活力；Tris緩沖液；磷酸鹽緩沖液

Stewart 于1951年報道了用牛冷凍精液進行人工授精后順利產(chǎn)下一頭牛犢[1]，之后，牛冷凍精液保存技術進入快速發(fā)展時期，卵黃和奶類稀釋液一直沿用至今。然而，近年來卵黃在精液保存中的使用受到了眾多的質疑，卵黃對精子保護作用的機理尚不清楚，而且卵黃成分復雜不穩(wěn)定，易受到外界的影響而變化，增加了精液稀釋液不穩(wěn)定因素[2]。卵黃來源于禽類，還可能攜帶病原微生物，如沙門氏菌、禽流感等，從而影響精子品質。同時近年來，由于禽流感、瘋牛病等畜禽傳染病的影響，精液稀釋液中的動物源成分可能會造成疫情的傳播、交叉感染，甚至可能產(chǎn)生新型疫情[3]。據(jù)Andrabi SMH的研究，卵黃中的一些氨基酸在有氧的情況下，經(jīng)酶作用后，可能產(chǎn)生對精子有害的過氧化氫酶，該成分可抑制精子呼吸，降低精子活率[4]。世界動物健康組織（OIE)早在2003年建議，精液處理中應該避免使用有生物學感染風險的動物源產(chǎn)品或在處理過程中確保其生物安全性[5]。如果不能較好的解決稀釋液中動物源成分添加的問題，這便使得跨地區(qū)、跨國等全球性的優(yōu)秀精液流動受到了限制，影響冷凍精液的國際貿(mào)易，阻礙了全球優(yōu)秀種公畜的遺傳資源交流[6]。因此，尋找成分穩(wěn)定、無微生物污染的非動物源性替代物顯得尤為重要。

目前牛精子冷凍超低溫保存的無動物源成分冷凍釋液在國內(nèi)還未發(fā)展成熟，各種公牛站普遍都在應用進口稀釋液，張世偉2008年公布了發(fā)明專利“牛羊無動物源凍精稀釋液及牛羊冷凍精液的制作方法”，公開號為CN 101310729A，此發(fā)明專利中包含牛羊無動物源性物質添加凍精稀釋液配方，此配方比較繁瑣，而且還有咖啡因的加入，所以未得到推廣和應用。凍精生產(chǎn)過程中，影響凍精質量的因素很多，稀釋液是其中關鍵性的因素[7]。郭麗娟對國外進口的濃縮稀釋液和站內(nèi)自制的稀釋液進行了對比試驗，結果表明，進口稀釋液和自制稀釋液對牛精液的冷凍效果差異不顯著，由于進口稀釋液不含卵黃等動物源物質，其視野清晰度要好于自制稀釋液，也可以避免來自卵黃中有害菌污染的可能。但進口稀釋液成本要遠高于自制稀釋液，而兩種稀釋液對牛精液的冷凍效果差異不大，用自制稀釋液可大大降低種公牛凍精生產(chǎn)成本，提高種公牛站的經(jīng)濟效益[8]。因此研制一種冷凍效果好、視野清晰度高、無污染、配方簡單、成本低的無動物源凍精稀釋液對我國各大種公牛站和畜牧繁殖產(chǎn)業(yè)具有重大的經(jīng)濟價值。

1 材料與方法

1.1 冷凍精液

冷凍精液取自博瑞遺傳有限公司生產(chǎn)基地的荷斯坦公牛，公牛編號為HB96190。

1.2 儀器

冷藏柜（海爾，青島）、低溫平衡柜（海爾，青島）、恒溫水浴箱（齊欣，上海）、液氮罐（金鳳，成都）、光學顯微鏡（Olympus）。

1.3 大豆蛋白提取方法

取大豆去皮，75%乙醇消毒，經(jīng)粉粹機破碎，研磨、溶解（用超聲波破碎輔助溶解），5 000r/min離心，棄上層油脂和底層未溶解的大分子蛋白和粗纖維等，取中層溶液待用。

1.4 冷凍保存稀釋液配制

蛋白Tris稀釋液：三羥甲基氨基甲烷24.224g，檸檬酸13.536g，葡萄糖11g，甘油60mL，大豆溶液1 000mL。

蛋白PBS稀釋液：取4.0g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4、1.8g K2HPO4、11g葡萄糖和60mL甘油，將大豆溶液定容至1 000mL，用HCl調節(jié)溶液的pH值至7.4。

卵黃Tris稀釋液：三羥甲基氨基甲烷24.224g，檸檬酸13.536g，葡萄糖11g，加800mL水、200mL卵黃、60mL甘油。

1.5 不同稀釋液配方冷凍奶牛精子試驗方法

將采集到的精液迅速放入保溫瓶內(nèi)，溫度保持在35℃，在實驗室內(nèi)做肉眼直觀檢查。然后取一滴精液滴在載玻片上，顯微鏡下觀察精液精子活力，精子活力在0.6以上，分成3份分別加入少量的蛋白Tris稀釋液、蛋白PBS稀釋液、卵黃Tris稀釋液，血球計數(shù)板檢查精子密度。用3種稀釋液將精液稀釋至1億個/mL，放于低溫平衡柜中以0.5℃/min的速度降溫。約2h后，平衡柜溫度降到4℃，在4℃環(huán)境中裝入0.25mL細管，將分裝好的細管置于4℃平衡2～4h，在液氮面上約2.5cm、-110℃熏蒸10min，投入液氮中。按照國家標準檢測細管凍精：每種稀釋液配方冷凍的細管凍精隨機取出10支，在37℃條件下解凍，在顯微鏡下觀察解凍后精子活力和37℃環(huán)境下保存4h的精子活力及精子畸形率。

1.6 不同稀釋液配方冷凍奶牛精子存活試驗方法

將每種稀釋液配方的細管凍精隨機解凍10支，分別放入10支1.5mL離心管，再在離心管里添加1mL的相應配方的稀釋液，記錄為第1天，觀察活力。然后將離心管放到4℃冷藏，每隔1d觀察1次，連續(xù)觀察8d。

2 試驗結果

2.1 不同稀釋液配方冷凍奶牛精子試驗結果

按照國家標準檢測細管凍精，檢測結果如表1所示。從表1可以看出，解凍奶牛精子的活力、37℃環(huán)境下保存4h的精子活力、精子畸形率等關鍵性指標都符合國家標準，蛋白Tris稀釋液、蛋白PBS稀釋液、卵黃Tris稀釋液都可以應用到生產(chǎn)實踐中去，但是冷凍效果最佳的是蛋白Tris稀釋液。

表1 不同稀釋液的奶牛凍精質量檢查結果

2.2 存活試驗結果

每次在顯微鏡下觀察10個視野取平均值，蛋白PBS稀釋液在第3天出現(xiàn)活力下降，已達不到國家標準的輸精要求。蛋白Tris稀釋液和卵黃Tris稀釋液在第4天出現(xiàn)活力下降，但至第5天仍能達到國家標準輸精要求，在第6天才達不到國家標準輸精要求。蛋白Tris稀釋液顯微鏡下觀察，視野比卵黃Tris稀釋液清晰。

表2 冷凍奶牛精子解凍后4 ℃放置后存活活力比較

3 分析與討論

3.1 關于不同稀釋液配方冷凍奶牛精子試驗結果

本試驗設計為盡量減少誤差，在原精活力、抽樣、試驗環(huán)境、稀釋倍數(shù)和批次都相同的情況下，將精子密度的差異降到最低。超低溫冷凍后檢查精子的活力，通過顯微鏡進行鏡檢時，觀察到在視野中不同配方冷凍的精子活力，其中蛋白Tris稀釋液最好，其次是卵黃Tris稀釋液。冷凍保護劑對精液的冷凍保存起著關鍵性作用，甘油作為最早應用于人類精液冷凍保存的保護劑，是一種滲透性保護劑，有利于電解質和水結合，使精子內(nèi)蛋白含量穩(wěn)定，減少冷凍時細胞內(nèi)冰晶的形成，減少了超低溫對精子的損傷，但同時也產(chǎn)生了一定的毒性作用，可以引起精子超微結構的明顯損害。Tris緩沖液在低溫下的pH值要高于室溫下的，配制的蛋白Tris稀釋液在室溫下pH值為7，隨著緩慢降溫pH值緩慢升高，能減輕甘油的毒性。

3.2 關于存活試驗結果

將每種稀釋液配方隨機解凍10支，在顯微鏡下觀察取平均值，蛋白PBS稀釋液在第3天出現(xiàn)活力下降，在第3天已達不到國家標準的輸精要求。蛋白Tris稀釋液和卵黃Tris稀釋液在第4天出現(xiàn)活力下降，第5天仍能到達精子活力國家標準，在第6天達不到國家標準。精子只有在適宜的pH值和滲透壓下才能存活，奶牛精子體外存活中，精子的pH值最適范圍是在7.0～7.5之間，滲透壓一般在0.295～0.310 osm為宜。3種配方稀釋液的pH值和滲透壓配制都滿足最適要求，但是最后的冷凍活力不同，Tris緩沖液在4℃低溫下的pH值要高于室溫下的pH值，有利于低溫精子的靜息，而PBS緩沖液中含有很多鹽離子，這對低溫靜息下的精子具有一定的損傷。

[1] Stewart D L. Storage of bull spermatozoa at low temperatures[J].Vet Rec, 1951, 63: 6566.

[2] 段洪云,張翔,孫玉玲.大豆卵磷脂對馬精液冷凍保存的效果研究[J].中國畜牧獸醫(yī)，2013, 08: 33-34.

[3] 金海.無動物源性水牛精液冷凍保存稀釋液的研究[D]. 武漢:華中農(nóng)業(yè)大學, 2014.

[4] Andrabi SMH. Factors affecting the quality of cryopreserved buffalo (Bubalus bubalis) bull spermatozoa[J]. Reprod Domest Anim, 2009, 44:552-69.

[5] 蔡虹.牛精液冷凍稀釋液新配方研究[D]. 武漢:華中農(nóng)業(yè)大學, 2009.

[6] Aires VA, Hinsch KD, Mueller-Schloesser F, et al. Hinsch E.In vitro and in vivo comparison of egg yolk-based and soybean lecithin-based extenders for cryopreservation of bovine semen[J].Theriogenology, 2003, 60:269-79.

[7] 王化青,鄧福金. 進口稀釋液與自制稀釋液對比試驗[J]. 現(xiàn)代畜牧獸醫(yī),2005, 10: 37-38.

[8] 郭麗娟,劉曉寧.兩種牛凍精稀釋液的對比試驗[J].黑龍江動物繁殖,2004,12(5):37-38.

Study on the Effect of Different Buffer Addition of Soybean Protein on Freezing Bovine Spermatozoa

XU Hong-xi, ZHANG Hong-tao, HAN Huan-sheng, YAN De-guang, WEI Xi-ming, SONG Wei-hong, GAN Wen-ping
(Heilongjiang Agricultural Science Academy of Animal Husbandry and Veterinary Research Institute, Harbin 150038)

In this paper, in order to solve the problems that egg diluent of bovine spermatozoa frozen semen is liable to pollut by heterologous microorganisms, and infectious to insemination dams, this study includes 2 experiments(1) Tris protein dilution is made from high protein content of soybean powder solution with Tris buffer added, PBS protein dilution is made from high protein content of soybean powder solution with phosphate buffer solution, and the traditional liquid is yolk Tris diluent, they were prepared for bovine semen frozen.(2) To observe Tris protein diluent, protein PBS diluent and yolk Tris diluent cryopreservation of bovine sperm thawing in 4℃ environment preservation time. The experimental results show that Tris protein diluent, PBS protein diluent and yolk Tris diluent have no signifcant difference in liquid nitrogen of frozen bovine spermatozoa. Tris protein diluent and yolk Tris diluent can reach national standard of sperm motility for fve days in 4℃ environment preservation time. Tris protein diluent can easily distinct sperm motility and exam under microscope compared to yolk Tris diluent, it is not easily to develop bacteria. So, the effect in freezing experiment and survival time experiment of Tris protein diluent is the best, plant source dilution can substitute animal source dilution for bovine semen frozen.

Soybean protein; Sperm motility; Tris buffer solution; Phosphate buffer

S823.3

A

1004-4264（2017）03-0020-03

10.19305/j.cnki.11-3009/s.2017.03.006

2016-08-10

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系建設專項（CARS-37)。

許紅喜（1979-），女，漢族，碩士，助理研究員，研究方向為畜牧獸醫(yī)。

甘文平（1963-），男，漢族，研究員。