孟冠男， 楊照微，楊素麗，黃麗紅，才子斌*，何成彥，郭宏華

(1.吉林大學第一醫(yī)院 腫瘤中心，吉林 長春130021；2.吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院)

AGR2在結(jié)直腸癌中的表達及意義

孟冠男1， 楊照微2，楊素麗2，黃麗紅2，才子斌1*，何成彥2，郭宏華2

(1.吉林大學第一醫(yī)院 腫瘤中心，吉林 長春130021；2.吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院)

目的 初步探討前梯度蛋白2(Anterior Gradient-2,AGR2)在結(jié)直腸癌組織中的表達及臨床意義。用以定義新的結(jié)直腸癌的生物標志物。方法 結(jié)直腸癌組織與癌旁組織中蛋白質(zhì)表達譜由二維色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(LC-MS)完成，蛋白表達情況通過免疫印跡驗證。結(jié)果 被篩選的結(jié)直腸癌組織和癌旁組織中的差異蛋白共39個，其中19個為上調(diào)表達蛋白。結(jié)論 AGR2在結(jié)直腸癌組織中表達上調(diào)，可能是新的結(jié)直腸癌的生物標志物。

結(jié)直腸癌；AGR2；二維色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術

(ChinJLabDiagn,2017,21:0389)

近年來，結(jié)直腸癌在中國的發(fā)病率逐年增高，在公眾眼中已被視為常見腫瘤之一[1]。手術和化療對于早期的結(jié)直腸癌的治療具有較好的效果[2]。然而，由于對化療不敏感且容易復發(fā)使得晚期結(jié)直腸癌患者的五年存活率只有50%[3]。因此，在結(jié)直腸癌進入晚期之前對其進行診斷對于提高結(jié)直腸癌的生存率顯得尤為重要。在二維色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術篩選出的39個表達存在差異蛋白中，前梯度蛋白2(AGR2)是上調(diào)表達蛋白之一。研究顯示，AGR2在細胞的生長增殖過程中扮演了重要角色。

1 材料與方法

1.1 研究對象 本實驗所用標本來自吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院，組織標本庫取病理確診為結(jié)直腸癌的證實為Dukes B期腺癌患者，患者術前未接受任何治療，為接受手術治療后的新鮮組織標本。所用癌旁正常組織為遠離癌組織10厘米以上且位于癌組織上段。依據(jù)上述標準，取手術新鮮組織，沖洗，液氮速凍，-80℃保存。

1.2 方法 通過LC-MS/MS法篩選出的結(jié)直腸癌組織及癌旁正常組織中的39個有顯著差異的蛋白質(zhì)中選擇上調(diào)蛋白AGR2做免疫印跡，從蛋白表達的角度驗證前期實驗的準確性。

1.3 主要試劑 N,N,N′,N′-四甲基乙二胺(TMED)、二硫代蘇糖醇(DTT)、考馬斯亮藍、十二烷基磺酸鈉(SDS)、溴酚藍、苯甲基磺酰氟(PMSF)購于Sigma公司。碘代乙酰胺(IAM)、IPG預制膠條、礦物油、蛋白質(zhì)定量試劑盒(RCDC Protein Assay Kit)購于Bio-Rad公司。TPCK修飾的測序級胰酶購自Promeg公司。Agilent 1200高效液相色譜儀購自美國Agilent公司，LTQXL離子肼質(zhì)譜儀購自美國Thermo Fisher公司。

1.4 統(tǒng)計學處理 SEQUEST算法計算二維色譜與質(zhì)譜聯(lián)用圖譜數(shù)據(jù)，均數(shù)±標準差(x—±s)表示實驗中的數(shù)據(jù)，用SPSS11.0軟件分析，統(tǒng)計學意義標準為P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌組織與癌旁組織差異蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析 本實驗的每個蛋白的豐度通過譜圖數(shù)來衡量。衡量的標準如下：①兩個樣品中蛋白譜圖數(shù)的差值≥72；②兩個樣品中蛋白譜圖數(shù)的比值≥1。依據(jù)上述標準，對比分析數(shù)據(jù)中腫瘤組織與癌旁組織的蛋白，得到39個有顯著差異的蛋白，本文以上調(diào)蛋白AGR2為中心進行論述，AGR2質(zhì)譜結(jié)果見圖1，圖2。

圖1 AGR2蛋白中序列肽段GWGDQLIWTQTYEEALYK的串聯(lián)質(zhì)譜圖

圖2 AGR2蛋白中序列肽段LAEQFVLLNLVYETTDK的串聯(lián)質(zhì)譜圖

2.2 AGR2在結(jié)直腸癌組織與癌旁組織表達水平的比較 在上述實驗中鑒定出的19個呈現(xiàn)上調(diào)表達的蛋白中選出AGR2做蛋白印跡實驗，結(jié)果見圖3。癌組織明顯高于癌旁正常組織。

3 討論

結(jié)直腸癌作為我國常見腫瘤之一，發(fā)病率逐年增加。其預后及存活率與疾病診斷的階段密切相關。對于早期診斷的結(jié)直腸癌患者，其五年生存率高達82.9%[4]，而晚期診斷的五年生存率則只有50%。為了提高患者的生存率，探索可用于早期診斷和判斷復發(fā)的方法意義深遠。

圖3 AGR2在結(jié)直腸癌及癌旁組織中的表達

近期的研究顯示，AGR家族有三種亞基：AGR1,AGR2和AGR3。AGR2也叫做hAG-2或Gob-4，可編碼長度為17kDa的分泌性蛋白，是人類與非洲爪蟾蜍蛋白(xenopus laevis pritein，XAG-2)的直系同源基因。蟾蜍胚胎中的XAG-2誘導了黏液腺的分化[5,6]，雖然AGR2 在人體內(nèi)的功能尚不清楚，有研究顯示AGR2 可以誘導細胞的遷移和腫瘤的增殖。通過抑制P53促進細胞的存活。增強了細胞的黏附和遷移能力。AGR2在一些生物學通路包括遷移和轉(zhuǎn)移中有著重要的生物學功能[7,8]。AGR2在多種人類腫瘤中高表達，并且其高表達與轉(zhuǎn)移表型及不良預后相關[9,10]。AGR2在氨基酸序列同源性的基礎上被認為是二硫鍵異構酶(PDI)家族的一員,定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的一種分泌蛋白[10]，同時也存在于細胞核和細胞表面。在正常組織中，AGR2高表達于肺、氣管、胃腸道以及包含粘蛋白分泌細胞或具有分泌功能的組織中[7]。AGR2既高表達于膀胱尿道上皮，又高表達于氣管；AGR2高表達于肺癌但并沒有高表達于尿路上皮癌。在前列腺癌、胰腺癌和乳腺癌中，AGR2的表達隨腫瘤的分期而降低。有研究表明，AGR2可以通過促進從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到細胞表面的受體表達來調(diào)控表皮生長因子受體(EGFR)通路。在正常的胰腺組織中并沒有發(fā)現(xiàn)AGR2的表達，但在早期胰腺炎中卻因為EGFR信號通路的開啟，誘導了AGR2在細胞表面的出現(xiàn)。EGFR的高表達增強了下游信號的傳導；突變型EGFR受體能夠持續(xù)活化EGFR；自分泌環(huán)的原有功能加強等。在惡性腫瘤中EGFR的過表達占有重要的位置，多種惡性腫瘤組織中都有EGFR的過表達。AGR2同時具有促進兩棲動物和魚組織的再生功能。AGR2作為細胞增殖、遷移的刺激因子為人們所熟悉，與化療耐藥性、轉(zhuǎn)移、復發(fā)相關。分泌性AGR2與乳腺癌的轉(zhuǎn)移和預后不良相關。并可以作為前列腺癌的腫瘤標志物。由上述趨勢，我們推測AGR2的表達量與腫瘤的類型相關，并且在不同類型的腫瘤中AGR2扮演的角色可能也不同[11]。AGR2可作為合適的候選基因用以探索循環(huán)腫瘤細胞，進而探索其與不同腫瘤之間的關系。盡管大量研究顯示AGR2的表達與結(jié)直腸癌患者的臨床參數(shù)相關，但AGR2在癌癥進展中所扮演的具體角色并不清楚。

本研究通過差異蛋白質(zhì)組學篩選出的結(jié)直腸癌相關蛋白AGR2，并對其在結(jié)直腸癌組織和癌旁組織的表達情況通過免疫印跡的方法進行檢測，發(fā)現(xiàn)AGR2在結(jié)直腸癌組織中表達明顯增高，提示AGR2可能是結(jié)直腸癌新的生物標志物。

[1]Xu AG,Yu ZJ,Jiang B,et al.Colorectal cancer in Guangdong Province of China:a demographic and anatomic survey[J].World J Gastroenterol ,2010,16:960.

[2]Lai YL,Lin JK,Liang WY,et al.Surgical resection combined with chemotherapy can help achieve better outcomes in patients with primary colonic lymphoma[J].J Surg Oncol,2011,104:265.

[3]Adam R,Haller DG,Poston G,et al.Toward optimized front-line therapeutic strategies in patients with metastatic colorectal cancer-an expert review from the International Congress on Anti-Cancer Treatment (ICACT) 2009[J].Ann Oncol,2010,21(8):1579.

[4]Tsikitis VL,Malireddy K,Green EA,et al.Postoperative surveillance recommendations for early stage colon cancer based on results from the clinical outcomes of surgical therapy trial[J].J Clin Oncol,2009,27:3671.

[5]Aberger F,Weidinger G,Grunz H,et al.Anterior specification of embryonic ectoderm:the role of the Xenopus cement gland-specific gene XAG-2[J].Mech Dev,1998,72:115.

[6]Komiya TY,Hirohashi S.Cloning of the gene gob-4,which is expressed in intestinal goblet cells in mice[J].Biochim Biophys Acta,1999,1444:434.

[7]Brychtova V,Vojtesek B,Hrstka R.Anterior gradient 2:a novel player in tumor cell biology[J].Cancer Lett,2011,304:1.

[8]Chevet E,Fessart D,Delom F,et al.Emerging roles for the pro-oncogenic anterior gradient-2 in cancer development[J].Oncogene,2012,6:2499.

[9]Chen R,Pan S,Duan X,et al.Elevated level of anterior gradient-2 in pancreatic juice from patients with pre-malignant pancreatic neoplasia[J].Mol Cancer,2010,9:149.

[10]Park K,Chung YJ,So H,et al.AGR2,a mucinous ovarian cancer marker,promotes cell proliferation and migration[J].Exp Mol Med,2011,43:91.

[11]Wang Z,Hao Y,Lowe AW.The adenocarcinoma-associated antigen,AGR2,promotes tumor growth,cell migration,and cellular transformation[J].Cancer Res,2008,68:492.

Expression Significance of AGR2 in Colorectal Cancer

MENGGuan-nan,YANGZhao-wei，YANGSu-li，etal.

(OncologyDepartment,TheFirstHospitalofJilinUniversity,Changchun130021,China)

Objective Detect the expression of Anterior Gradient-2 in colorectal cancer and its clinical significance,to define new biomarkers of colorectal cancer.Methods colorectal cancer tissues and pericarcinous tissues were analyzed with liquid chromatography/mass spectrometry,Protein expression were verified by western-blot.Results The number of mitochondrial proteins detected from colorectal cancer tissues and pericarcinous tissues is 39 and 19 were overxpressed.Conclusion AGR2 is overexpressed in colorectal cancer tissues and is the potential biomarker of colorectal cancer.

Colorectal Cancer;Anterior Gradient-2;LC-MS

國家自然基金資助項目(81572082)；吉林省科技發(fā)展項目(20150101153jc,20140311092YY，20150101153，20150414015)

1007-4287(2017)03-0389-03

R735.3+5 R735.3+7

A

2016-12-19)

*通訊作者