張 濤，廖紅梅，張春紅，譚茜茜，毛 偉，黃 霞

重慶地區(qū)無償獻(xiàn)血人群隱匿性乙型肝炎病毒感染的特征

張 濤，廖紅梅，張春紅，譚茜茜，毛 偉，黃 霞

目的了解重慶地區(qū)無償獻(xiàn)血人群中隱匿性乙型肝炎病毒感染（occult hepatitis B virus infection, OBI）情況，分析其血清學(xué)和病毒學(xué)特征。方法應(yīng)用酶聯(lián)免疫法（篩查HBsAg、抗-HCV、抗-HIV）及核酸檢測(cè)（nucleic acid testing, NAT）法（篩查HBV、HCV、HIV）篩查重慶地區(qū)93 625份初篩合格的無償獻(xiàn)血者血液標(biāo)本。對(duì)其中HBsAg（-）但HBV DNA（+）的標(biāo)本進(jìn)行抗-HBs、抗-HBc、HBeAg、抗-HBe 4項(xiàng)血清學(xué)標(biāo)志物測(cè)定，進(jìn)一步對(duì)抗-HBc（+）標(biāo)本做病毒載量測(cè)定以及基因分型。結(jié)果93 625份標(biāo)本中HBsAg（-）但HBV DNA（+）的檢出率為0.097%（91/93 625）。91份陽性標(biāo)本中79份為抗-HBc（+），檢出率為0.084%（79/93 625）。該部分標(biāo)本陽性者被視為OBI獻(xiàn)血者。OBI獻(xiàn)血者的血清學(xué)特征可以分為4種模式：?jiǎn)慰?HBc（+）、抗-HBc（+）/抗-HBs（+）、抗-HBc（+）/抗-HBe（+）以及抗-HBc（+）/抗-HBs（+）/抗-HBe（+）。病毒載量為0～1056.8 IU/ml（中位數(shù)為108.6 IU/ml），基因型以B型為主。結(jié)論重慶地區(qū)無償獻(xiàn)血者中OBI檢出率較高，其血清學(xué)和病毒學(xué)特征具有地區(qū)性。NAT能提高OBI檢出的靈敏度，但也存在一定的假陽性，對(duì)血液安全具有重要影響。

核酸檢測(cè)；隱匿性乙型肝炎病毒感染；血清學(xué)特征；病毒學(xué)特征

近年來隨著分子生物學(xué)技術(shù)在病毒檢測(cè)中的應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)在HBsAg（-）的人群中可檢出HBV DNA，這種除窗口期外的HBsAg（-）但HBV DNA（+）的感染被定義為隱匿性乙型肝炎病毒感染（occult hepatits B virus infection, OBI）[1]。OBI是HBV感染的一種特殊類型[2]，流行于世界各地，與 HBV流行率呈正相關(guān)。我國(guó)是 HBV感染的高流行區(qū)，在無償獻(xiàn)血人群中，OBI具有較高的流行率[3]，是影響血液安全的一個(gè)潛在因素。我們利用重慶市血液中心推行核酸檢測(cè)（nucleic acid testing, NAT）的機(jī)會(huì)，收集了本中心2012—2013年HBsAg（-）但HBV DNA（+）的獻(xiàn)血者標(biāo)本，通過篩查抗-HBc（+）排除窗口期影響，對(duì)確定為OBI的部分標(biāo)本進(jìn)行血清學(xué)及病毒學(xué)特性分析，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 2012年10月—2013年9月于本中心采集的93 625份無償獻(xiàn)血者標(biāo)本。獻(xiàn)血者均符合《獻(xiàn)血者健康檢查要求》（GB18467-2011）的規(guī)定。其中，男48 542例，女45 038例，平均年齡為（31.3±4.0）歲，最小19歲，最大55歲。經(jīng)HBsAg及ALT初篩合格后的標(biāo)本送檢驗(yàn)科分別行酶聯(lián)免疫法和NAT檢測(cè)。最后收集HBsAg（-）但HBV DNA（+）無償獻(xiàn)血者標(biāo)本血漿20 ml，-80 ℃凍存?zhèn)錂z。

1.2 試劑及儀器 ALT檢測(cè)（上?？迫A、瑞士澳斯邦）；HBsAg檢測(cè)（北京萬泰、生物梅里埃）?？?HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc（ELISA法）檢測(cè)試劑盒（上?？迫A）；HBV、HCV、HIV-1NAT試劑盒、PROCLEIX TIGRIS 核酸檢測(cè)系統(tǒng)（美國(guó)諾華）； HBV DNA提取試劑盒和熒光定量PCR試劑盒（TaKaRa）；HBV基因分型檢測(cè)試劑盒（珠海賽樂奇）；RSP150和RSP200型全自動(dòng)樣品處理儀（瑞士帝肯）；FAME24/20和FAME24/30型全自動(dòng)酶聯(lián)免疫分析系統(tǒng)（瑞士哈米爾頓）；酶標(biāo)儀（美國(guó)BIO-TEK）；超速離心機(jī)（SIGMA）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（ABI 7500）。

1.3 方法

1.3.1 HBsAg檢測(cè) 對(duì)93 625份無償獻(xiàn)血者標(biāo)本用全自動(dòng)酶聯(lián)免疫分析儀使用2種不同廠家試劑分別對(duì)HBsAg進(jìn)行ELISA法檢測(cè)，設(shè)置S/CO≥0.8為有反應(yīng)性，0.8≤S/CO＜1.0為灰區(qū)。雙試劑S/CO均≥0.8，直接判定為陽性；單試劑有反應(yīng)性標(biāo)本采用原試劑進(jìn)行雙孔復(fù)試，至少1孔有反應(yīng)性判定為陽性。

1.3.2 病毒核酸檢測(cè) 采用ULTRIO試劑進(jìn)行HIV RNA、HCV RNA、HBV DNA三聯(lián)檢測(cè)分析。對(duì)于ULTRIO有活性的標(biāo)本，判定為NAT聯(lián)檢陽性，再分別進(jìn)行Procleix HIV、HCV 和HBV鑒別試驗(yàn)。收集上述ELISA檢測(cè)HBsAg（-）但NAT檢測(cè)（+）的獻(xiàn)血者標(biāo)本血漿50 ml，-80 ℃凍存。

1.3.3 HBV血清標(biāo)志物檢測(cè) 對(duì)HBsAg（-）但HBV DNA（+）的標(biāo)本進(jìn)行4種血清標(biāo)志物（抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc）ELISA檢測(cè)，按試劑盒說明書操作，酶標(biāo)儀上判讀結(jié)果。標(biāo)本S/CO≥1判定為陽性，標(biāo)本S/CO＜1時(shí)，判定為陰性。

1.3.4 病毒核酸提取 將收集的ELISA檢測(cè)HBsAg（-）但NAT檢測(cè)（+）的獻(xiàn)血者血漿予以解凍，充分振蕩混勻，進(jìn)行超速離心濃縮處理。每份樣品取20 ml分裝于10支2 ml Axygen離心管（2 ml/管），4 ℃ 12 000×g離心0.5 h，吸取上清850 μl棄去，留底部濃縮液150 μl。收集各管濃縮液，并用所棄上清液調(diào)整終體積至2.0 ml，獲得10倍濃縮標(biāo)本。嚴(yán)格按試劑說明書操作提取濃縮所得的2 ml/份血漿中的HBV DNA。

1.3.5 病毒載量測(cè)定 方法參照文獻(xiàn)[4]。HBV-1引物序列：5'-CAA CCT CCA ATC ACT CAC CAA C-3'。HBV-2引物序列：5'-ATA TGA TAA AAC GCC GCA GAC AC-3'。雙標(biāo)探針BS-1：5'-（Cy5） TCC TCC AAT TTG TCC TGG TTA TCG CT-（BH Q2） -3'（上海生工合成）。反應(yīng)體系25 μl：2×Premix Ex Taq 12.5 μl，Rox DyeⅡ0.4 μl，HBV-1（10.0 μmol/L）終濃度 0.4 μmol/L，HBV-2（10.0 μmol/L）終濃度0.4 μmol/L，探針BS-1（5.0 μmol/L）終濃度0.2 μmol/L；反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 30 s，56 ℃ 1 min，42個(gè)循環(huán)。

1.3.6 病毒基因分型 取直用型PCR反應(yīng)液（PCR小管）室溫下融化、離心，加入所提HBV DNA 2 μl混勻，離心10 s。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：95 ℃10 min；94 ℃ 30 s ，56 ℃ 30 s ，72 ℃ 30 s ，50個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。取10 μlPCR擴(kuò)增產(chǎn)物解鏈后與基因分型芯片雜交、顯影，判讀結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料呈正態(tài)分布，用±s或中位數(shù)（最小值，最大值）表示。多組間定量資料差異性比較用單因素方差分析，兩兩比較用最小顯著差法。多組間率的比較用R×C χ2檢驗(yàn)，兩兩比較用Scheffe法。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 重慶市OBI無償獻(xiàn)血者血清學(xué)特征 初篩合格的93 625份無償獻(xiàn)血者標(biāo)本中HBsAg（-）但HBV DNA（+）檢出率為0.097%（91/93 625），對(duì)91份HBV DNA（+）標(biāo)本進(jìn)行HBV血清學(xué)標(biāo)志物檢測(cè)，79份為抗-HBc（+）標(biāo)本，表明獻(xiàn)血者既往有HBV感染從而排除窗口期感染，確認(rèn)為OBI，檢出率為0.084% (79/93 625)。其中初次獻(xiàn)血者31例（39%）、重復(fù)獻(xiàn)血者48例（61%），男性54例（68%）、女性25例（32%）。其余12例標(biāo)本無血清學(xué)標(biāo)志物，不能排除窗口期影響，須進(jìn)行連續(xù)追蹤檢測(cè)。

根據(jù)血清學(xué)標(biāo)志物結(jié)果，分為4種血清學(xué)模式，79例OBI獻(xiàn)血者中抗-HBc（+）占40.5%，抗-HBc（+）/抗-HBs（+）占26.5%，抗-HBc（+）/抗-HBe（+）占24.1%，抗-HBc（+）/抗-HBs（+）/抗-HBe（+）占8.8%?？傮w上各血清學(xué)模式組在獻(xiàn)血次數(shù)、年齡、性別和ALT方面差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。此外，不存在抗-HBs（+）/抗-HBe（+）及單獨(dú)抗-HBe模式。

2.2 重慶市OBI獻(xiàn)血者HBV分子生物學(xué)特征 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，79例OBI獻(xiàn)血者HBV載量均為低水平，范圍為0～1056.8 IU/ml（中位數(shù)為108.6 IU/ml）（圖1）。對(duì)能定量的63份OBI獻(xiàn)血者進(jìn)行基因型檢測(cè)，45例為B型（71.4%），12例為C型（19.1% ），6例不能確定基因型（表2）。

3 討 論

重慶是HBV的高發(fā)地區(qū)[5]，推測(cè)OBI獻(xiàn)血者在無償獻(xiàn)血人群中流行率較高。本研究利用血液中心核酸檢測(cè)系統(tǒng)篩選出HBsAg（-）但HBV DNA（+）的獻(xiàn)血者，通過檢測(cè)抗-HBc（+）排除窗口期影響，剩余部分被認(rèn)定為OBI獻(xiàn)血者，其檢出率為0.084%（79/93 625），高于深圳、香港等地區(qū)報(bào)告的檢出水平[6]。須要注意的是，通過檢測(cè)抗-HBc（+）排除窗口期，可能漏檢小部分OBI獻(xiàn)血者，此類獻(xiàn)血者只有通過追蹤檢測(cè)才能確認(rèn)，本研究中暫未涉及。分析篩選出的79例OBI獻(xiàn)血者的血清學(xué)特征，抗-HBc（+）占40.5%，抗-HBc（+）/抗-HBs（+）占26.5%，抗-HBc（+）/抗-HBe（+）占24.1%，抗-HBc（+）/抗-HBs（+）/抗-HBe（+）占8.8%。各組間在獻(xiàn)血次數(shù)、年齡、性別和ALT方面均無顯著差異。這一方面表明長(zhǎng)期反復(fù)暴露在HBV高流行環(huán)境中是導(dǎo)致OBI的一個(gè)重要原因，另一方面提示我們必須重視抗-HBc指標(biāo)的應(yīng)用。雖然在我國(guó)健康人群中抗-HBc陽性率（34.11%）本身較高[7]，將其作為獻(xiàn)血者篩查指標(biāo)會(huì)淘汰大多數(shù)合格獻(xiàn)血者，但可以在窗口期排查、追蹤調(diào)查OBI獻(xiàn)血者時(shí)使用該指標(biāo)了解血清學(xué)狀態(tài)[8]。另外2種血清學(xué)模式抗-HBc（+）/抗-HBs（+）與抗-HBc（+）/抗-HBe（+）比例基本一致，這2種模式的存在表明OBI獻(xiàn)血者不僅存在HBsAg變異，而且其捐獻(xiàn)的血液同樣具有傳播HBV的風(fēng)險(xiǎn)。3種抗體都存在的比例較小，但也表明OBI獻(xiàn)血者中同樣有抗-HBs（+）與抗-HBe（+）共存的情況?？?HBs常被認(rèn)為是一種保護(hù)性抗體，而抗-HBe則常被作為HBV復(fù)制的一個(gè)指標(biāo)，2者共存的現(xiàn)象提示OBI獻(xiàn)血者可能存在HBV免疫逃亡情況。

表1 重慶地區(qū)79例OBI獻(xiàn)血者一般資料和血清學(xué)特征Table1 Generally data and serological features of 79 OBI cases in Chongqing region

圖1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)OBI 獻(xiàn)血者（部分）病毒載量水平Figure1 HBV viral load levels of OBI donors detected by QPCR

表2 重慶地區(qū)63例OBI獻(xiàn)血者病毒學(xué)特征Table 2 Virological characteristics of 63 OBI donors in Chongqing

在病毒學(xué)特征方面，OBI獻(xiàn)血者最顯著的特征是血液中的HBV DNA載量均較低[6]。近年來開展的NAT技術(shù)，與實(shí)時(shí)熒光定量PCR等方法相比，具有較高的靈敏度，極大提升了HBV DNA的檢出率。雖然NAT較為靈敏，但也存在假陽性的可能。因此，我們采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法進(jìn)一步對(duì)NAT（+）的結(jié)果進(jìn)行確認(rèn)，同時(shí)進(jìn)一步確認(rèn)了OBI獻(xiàn)血者的病毒載量水平。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法往往不能檢出OBI獻(xiàn)血者中的HBV DNA，本研究中采取超速離心濃縮法[9]對(duì)獻(xiàn)血者血漿中的病毒進(jìn)行了富集處理，顯著提高了檢出率，對(duì)病毒載量進(jìn)行了準(zhǔn)確定量和基因分型。結(jié)果顯示，63份OBI獻(xiàn)血者病毒載量在0～1056.8 IU /ml（中位數(shù)為108.6 IU /ml）之間，與已有的報(bào)道一致[10]；基因分型以B型為主，與我國(guó)南方地區(qū)HBV主要為B型，北方地區(qū)主要為C型分布情況相同[11]。此外，有16份標(biāo)本雖經(jīng)超速離心濃縮并使用目前較為靈敏的實(shí)時(shí)熒光定量PCR的商品化試劑盒進(jìn)行檢測(cè)仍未檢測(cè)出HBV DNA，一方面可能是受實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的局限造成假陰性結(jié)果，另一方面也可能是獻(xiàn)血者本身是真陰性，而NAT結(jié)果為假陽性?；谶@2種檢測(cè)方法結(jié)果的差異，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法定期對(duì)NAT檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行復(fù)核確認(rèn)，將有助于深入了解NAT方法造成假陰性或假陽性的情況。

此外，NAT聯(lián)檢結(jié)果陽性的標(biāo)本，有相當(dāng)一部分標(biāo)本在進(jìn)一步做區(qū)分檢測(cè)時(shí)難以區(qū)分出具體的病毒種類。這類NAT篩查陽性結(jié)果到底是混樣檢測(cè)導(dǎo)致的假陽性，還是由于病毒含量太低致不能被鑒別，須要引起我們足夠的重視。在本次研究中，此類標(biāo)本并未被納入研究范圍，但根據(jù)已有報(bào)告，其中相當(dāng)一部分標(biāo)本最終被確認(rèn)為HBV[12]。因此，若將此部分標(biāo)本加以考慮，重慶地區(qū)無償獻(xiàn)血者OBI的檢出率應(yīng)比本次研究結(jié)果更高，這類標(biāo)本或許對(duì)研究OBI的血清學(xué)和病毒學(xué)特征更具有研究意義，當(dāng)然這也需要更靈敏、準(zhǔn)確的研究方法。

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（2016-05-04收稿 2016-12-23修回）

（本文編輯 閆晶晶）

Characterization of occult hepatitis B virus infection in Chongqing unpaid blood donors

ZHANG Tao*, LIAO Hong-mei, ZHANG Chun-hong, TAN Qian-qian, MAO Wei, HUANG Xia
Institute of Blood Transfusion, Chongqing Blood Center, 400015, China
*Corresponding author, E-mail: 93947742@qq.com

ObjectiveTo investigate the prevalence of occult HBV infection (OBI) of blood donors in Chongqing, and to analyze the characteristics of its serology and virology.MethodsA total of 93 625 prescreening acceptable blood samples were screened for HbsAg, anti-HCV and anti-HIV by EIAs, and tested for HBV, HCV and HIV-1 nucleic acids by nucleic acid test (NAT). HBsAg(-)/ HBV DNA(+) samples were detected for anti-HBc, anti-HBs, anti-HBe and HBeAg. And the anti-HBc(+) samples were further tested for viral loads and genotyping.ResultsThe detection rate of HBsAg(-)/HBV DNA(+) was 0.097% (91/93 625). Among 91 samples, 79 were positive for anti-HBc, the detection rate was 0.084% (79/93 625). These donors were called OBI. The OBI samples could be divided into 4 types according to serological tests, which were anti-HBc(+), anti-HBc(+)/anti-HBs(+), anti-HBc(+)/anti-HBe(+) and anti-HBc(+)/anti-HBs(+)/anti-HBe(+). According to the result of real-time fluorescent quantitative PCR(QPCR), all specimens of OBI′s viral load was 0-1056.8 IU/ml (median 108.6 IU/ml). The genotype was mainly B.ConclusionsOBI′s detection rate is higher in unpaid blood donors in Chongqing area, and the serology and virology characteristics are regionally. NAT can improve the sensitivity of OBI detection, but some results are false-positive, which have important effects on the blood safety.

nucleic acid testing; occult hepatitis B virus infection; serological characteristics; virology characteristic

R446.11；R512.6

A

1007-8134(2017)01-0044-04

10.3969/j.issn.1007-8134.2017.01.014

重慶市衛(wèi)生局醫(yī)學(xué)科研項(xiàng)目（2012-2-483）

400015，重慶市血液中心輸血研究所（張濤、廖紅梅、張春紅、譚茜茜、毛偉、黃霞）

張濤，E-mail: 93947742@qq.com